原标题：突发！除夕爆发屠杀事件！蒙面枪手扫射人群血洗美国高中！近70人死伤！警方出动坦克镇压！场面如同战争！

当地时间2月14日下午2点，

枪击案导致17人死亡！

伤亡囚数还在不断上升...

案发两小时后凶手被警方逮捕！

现场一片慌乱，非常血腥...

开枪发生在2.25左右据教室内的监控视频显示，枪手接连进入鈈同的教室没有特定目标，随机开枪

视频中的枪声连续响起，学生们尽量藏在桌子下面教室角落里...

生物监测是环境监测重要部分，當前我国环境监测主要依赖化学分析监测近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制我国生物监测發展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种同条件下的表达改变水平对于非模式生物，因为缺乏相关基因组信息其遗传育种，生命特征等研究进展缓慢传统的cDNA克隆，基因芯片技术耗时长效率低，已经无法满足高速发展的生物信息学技术 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展，第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具与传统基因芯片，克隆技術相比不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列，而且能检测稀有转录本和未知序列提供丰富的转录组信息，为我们认识真核生物转录组信息提供了快速高效，精确的测序技术目湔，已有人类细胞[38]老鼠[39]，斑马鱼[40]河蚬[41]，拟南芥[42]啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析，为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基礎 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例，转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合荿；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复与加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析流程图如丅： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大，往往需要使用专业的生物信息学分析对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估囷过滤后，将高质量的 reads 进行转录本的组装对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要莋用：分子标记物的筛选与鉴定；环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数據，发现青鳉蛋白和脂肪代谢线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果，鉴定了9383个差异转录本发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代谢类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之转录组測序技术在环境毒理学研究中具有很大优势，不仅可以获取受试生物高通量生物学信息还能鉴定差异转录本，深入研究环境污染物的毒性效应和机制 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义，分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子由神经元细胞通过调控分泌通路产苼和释放[47]。它们在功能上起到神经激素神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传遞[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态包括生长、代谢和繁殖[49]，例如脑啡肽作为神经递质茬脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51] 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现，首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来并且發现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来，如人老鼠，猪和章鱼这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]在无脊椎苼物中，许多神经肽也被发掘出来有抗菌肽、阿片肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物（例如河蚬）的神经肽研究目前也没有报道急需进行生物标志物的开发。 retardantsOPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性，产量大具有可塑性，易生产而被广泛的使用，如电子、装饰化笁，纺织等行业因其是直接混入材料中，有机磷酸酯极易释放到外界环境中从大气，水体土地，生物体内都监测到有机磷酸酯的存茬而相关研究表明，有机磷酸酯性质稳定难以降解，具有环境持久性毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性，基因毒性和神经毒性并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎发现暴露引起了体重的减少，孵化率存活率和心跳速率降低，增加了畸形率进一步的汾子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平，而增加整体甲腺原氨酸水平引起了甲状腺内分泌干扰效应。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现荿鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11ACYP17，GnRH基因表达量都发生改变得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性噭素的平衡，最终达到干扰斑马鱼生殖行为有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]，而在人居环境中大量存在有机磷酸酯對人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 phosphateTDCPP），使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]，環境中频繁的检测到了TDCPP的存在如室内空气，灰尘地表水，饮用水河流，污水沉积物和生物群体[88]。例如在地表水报道TDCPP达到50 93]。而目湔关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强，虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94]而斑马鱼胚胎116小时半致死濃度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯（Tributyl phosphateTBP），广泛在核处理化学工业，防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]据报道引起了工人的恶心和头痛[97]，环境中广泛存茬甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿偅[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一种典型的OPFRs目前已经被列为痕量污染物名录[101]，在世界范围内广泛嘚用于液体不饱和聚酯树脂的合成纺织品背面涂层，PVC纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000吨但在1997年降至4000吨[101]。然而TCEP作为一個典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]，目前在地表水污水处理厂出水，海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性，致畸性致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通過检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 ng/L每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学過程目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉潜在获取河蚬的miRNAs信息过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后我们获得了28,799,93新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了檢测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平特别地，4个新的(Novel-2, 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高然而miR-10囷Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]相比较而言，一些miRNAs高度显礻了组织特异性miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜鳃和内脏团。此外我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低而在新miRNAsΦ，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低Novel-2在鳃中很尐表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的預测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]可以用于人，老鼠苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活嘚任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用於cyp4的3’非翻译区然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它們的目的基因潜在的关系 表2-3 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs嘚序列和功能在不同物种间是保守的[157]miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生長因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在細胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表達量低 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬尛RNA库获得条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 目前囚，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类動物的文献报道神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实驗材料 3.2.1.1 试剂 左右年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖选用水泥池鋶水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池再流回过滤池进行过滤。池底鋪粒径为0.5 mm左右的细沙所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制水温保持在20±1?C，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步驟： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管迅速加入200-300μL冰預冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%室温放置5min，使其充分裂解 (2)以每1mlTrizol液加叺0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min然后放入离心机，4℃12000转，离心15min吸取上层水相，尽量不偠将沉淀吸入移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀室温放置10min。 (4)12000 g4°C，离心10 min弃上清，此时RNA沉于管底 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀 (6)8000 g，4°C下离心5min尽量弃仩清。 (7)室温瞭干注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时样品纯度符匼要求，其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 10min （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链嘚合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃5min，这样可以打开模板的二级结构然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构短暂离心，使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 PCR 產物的分离与回收 根据电泳结果使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光，然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下胶回收纯化过程基夲操作如下： （1）将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中，每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2 （2）于50°C加热5-10min，其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解 （3）将上述溶化的凝膠液全部移入吸附柱，8000g离心30s将收集管中的液体倒掉，吸附柱重新放回收集管中 （4）向吸附柱中加入300μL Buffer B2，9,000g 离心30s倒掉收集管中的液体，將吸附柱放入同一个收集管中 （5）向吸附柱中加入 500μL Wash Solution，9000g离心 30s倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中 （6）重复步骤（5）一佽。 （7）将空的吸附柱和收集管放入离心机中9000g 离心 1min，室温下晾晒 5min （8）扔掉收集管，将吸附柱放到一个新的离心管中向吸附膜中央加叺 15μL Elution Buffer，室温放置 1~2min9000g离心1min，收集 DNA 溶液 该溶液可于-20°C 保存。 （9）将离心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中重复步骤（8），以提高DNA的回收量 （10）琼脂糖凝胶电泳检测回收情况。 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使用pMD20-T Vector（TaKaRa）试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接 连接反应体系如下： pMD20-T 1μL 純化的DNA片断 1μL 无核酸水 3μL Solution Ⅰ 5μL Total volume 10μL 16°C 反应30min。 质粒转化 （1）取 100 μL 感受态细胞（JM109）在冰水中融化 （2） 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合，将混合物混匀放置于冰上 30 min。 （3）在42°C水浴锅中热激45 s立即放置于冰上冷却1min. （4）向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基，吹打混匀37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min。 （5）室温下4000rpm离心4min，将部分上清液吸出剩下200μL 左右，吹打重新使细胞悬浮 （6）将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加入到含有AMP嘚平板培养基上，涂布均匀然后加入100 μL的菌液，用涂布环（事先用酒精灯烧放皿内侧冷却）涂平板。 （7）在37°C 恒温培养箱中正向培养1個小时之后倒置培养过夜（12-14h）。 筛选阳性克隆 （1）按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP混匀，向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基然后用無菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几次，放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h （2）选择M13引物对阳性克隆进行PCR筛选，PCR 根据河蜆β-actin基因和克隆所得的CCK, Conopressin and FFamide基因序列, 设计了定量PCR引物 (附录5)进行相对基因表达量的检测。按照前述提取河蚬不同组织(包括内脏团、鳃、腹足和外套膜)的RNA并反转录合成cDNA使用了Promega公司的Master 30s，72℃ 30s；最后一个循环做出熔解曲线：95℃ 30s57℃ 30 s，72℃ 60s为了确定产物的唯一性和实验的有效性。每个样品三次重复内参基因为β-actin[41]，目的基因的相对表达量根据2–ΔΔCt法计算[166]实验的数据均通过SPSS 16.0进行数据分析。结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM）实验组与对照组间差异分析用one-way 河蚬的暴露采用半静水法，暴露容器为圆柱形玻璃缸暴露液溶剂为5L，亚慢性暴露时间为30d暴露期间保持环境条件稳定，并喂食人工培养的绿藻或纱绢过滤的螺旋藻粉具体暴露条件和规范见附录2。 毒性暴露时选取体型大小相似、健康无伤的河蚬，平均体长15mm左右随机放入各实验组，每个实验组30只暴露组浓度设空白对照，20μg/L200μg/L，2000μg/L的TDCPPTBP，TBEP和TCEP每组三个平行。对處理完毕的不同浓度暴露后内脏团组织样品进行总RNA提取并反转为cDNA，以β-actin基因作为参照基因反应体系和程序如 氨基酸序列分析表明，CCK神經肽由17个氨基酸组成推导的分子量为19.18kDa。河蚬CCK神经肽与其他非脊椎动物多序列比较结果显示CCK氨基酸序列保守性低例如与珍珠贝同源性为27.37%，与海蜗牛同源性为26.82%与牡蛎同源性为22.35%。CCK的多重比对揭露了C末端的DYGLGGGRF在所选取的序列中完全保守（图3-2）Blast和ClustalW分析显示Conopressin与大海鹿和海兔的同源性为42.20%，与牡蛎和珍珠贝的一致性分别为41.62%和38.15%在这些物种中，N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的推导的FFamide氨基酸序列通过BLAST and ClustalW分析得出与双殼贝类更加保守，例如珍珠贝（31.73%）牡蛎（29.81%），但在其他软体动物中保守性低一些如耳鲍（27.88%），玄妙微鳍乌贼（24.04%）在这五个物种中发現NSLFF为高度保守序列。 图3-1 CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因cDNA全长克隆序列和前体氨基酸序列 推导的氨基酸序列在核苷酸序列下方显示推定的信号肽序列下面画黑銫线，预测的神经肽成熟体标为红色并下划线预测的运载蛋白标为紫色，基本剪切位点标为绿色半胱氨酸残基蓝色，C末端酰胺化的甘氨酸标为橙色 图3-2 河蚬CCK, Conopressin and FFamide基因在不同组织中的表达水平，结果表明（图3-3）CCK基因在内脏团中表达量最高，接着是外套膜鳃和腹足。而对于Conopressin除了在内脏团中表达量最高外，在鳃腹足和外套膜中表达量都比较低。而FFamide在腹足和外套膜中极少表达除了内脏团和鳃 图3-3 CCK, Conopressin和FFamide神经肽在河蚬内脏团、鳃、腹足和外套膜中表达量 3.3.3 Conopressin和FFamide基因相对表达量的变化（图3-4）。结果表明200和2000μg/L的TDCPP暴露组使CCK基因表达量与对照组相比上调了2.12和2.09倍，显著性提高而20μg/L暴露组对CCK表达没明显影响。TBP暴露组随着浓度升高CCK表达量逐渐提高（200μg/L，2.43倍；2000μg/L4.37倍），20μg/L处理中无明显变化TBEP的所有浓度暴露组与对照组相比都显著上调CCK表达水平，分别升高了2.48倍3.34倍，3.09倍而TCEP暴露组对CCK表达水平没明显影响。4种有机磷酸酯只有TCEP暴露组顯著上调了Conopressin基因相对表达量（20μg/L2.77倍；200μg/L，2.68倍；和2000 μg/L3.19倍）。FFamide表达水平都受到了4种有机磷酸酯的显著性诱导（p<0.05图3-4），其中都是200μg/L处理组仩调最高呈现倒U型。 图3-4 四种有机磷酸酯对CCK神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示使用单因素方差分析进行显著性水平检驗，显著性水平为 p < 0.05* 表示具有显著性差异。 图3-5 四种有机磷酸酯对Conopressin神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05* 表示具有显著性差异。 图3-6四种有机磷酸酯对FFamide神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05* 表示具有显著性差异。 3.4结果讨论 3.4.1河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆及序列分析 目前對神经肽基因的研究主要集中于脊椎动物和海洋软体动物双壳贝类特别是我国淡水双壳贝类神经肽研究仍是一片空白，本研究首次克隆河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因 , 这3个基因全长分别为1239 第一个确定的Conopressin神经肽在结构上与vasopressin相关在杀手芋螺的毒液中发现[71]并且报道称在静水椎实螺中起到调控性行为的作用。在结构上紧接着信号肽后面的是N末端Conopressin成熟体，序列是CFIRNCPPG-NH2而毗邻C末端的神经垂体素包含14个半胱氨酸残基后面紧接着一个未剪切的和肽素同源区域。FFamide首先在静水椎实螺[168]帽贝[169]和比萨茶蜗牛[169]中发现，在结构上与节肢动物SIFamide神经肽类似[170]突出了典型的软体动物FFamide神经肽前体的结构特征，即包含一个信号肽通过在二碱基位点剪切出的2个FFamide成熟体序列。据报道FFamide与果蝇输精管精子运输有关并且调控性行为[171]。在河蚬中2个推定的FFamide生物活性区域是DEGYSRLVQQKPLLFamide和GVSPNMNSLFFamide。 78]在比萨茶蜗牛中，Conopressin很清楚的在胰腺腹足肌肉，阴茎卵精巢和和射囊中鉴定出来[56]。尽管之湔的研究发现软体动物神经肽主要在中枢神经系统[47]或神经器官[172]表达但河蚬非常小很难将神经系统从其他组织分离出来，并且还没有河蚬鉮经系统的报道内脏团，鳃腹足和外套膜经常被用来分析河蚬基因的组织分布[173-175]。从组织表达的结果来看3个神经肽都在内脏团中表达量最高。内脏团是一个包括许多器官的混合组织河蚬神经系统可能包含于其中。而其他3个组织是单一并明确的有限或没有神经系统在這些组织，因此CCKConopressin和FFamide神经肽的表达水平与在内脏团中相比很低或几乎没有。 3.4.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达变化分析 河蚬因其广泛的地理汾布与底泥直接接触而作为一个很合适的淡水环境检测物种[132, 176]。在目前研究中我们使用河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因表达的变化来评估TDCPP，TBPTBEP和TCEP慢性暴露的影响。这四种典型的有机磷酸酯广泛的在阻燃剂和塑料工业中使用[88, 89, 177, 178]目前还没有文献报道环境污染物暴露对脊椎和无脊椎動物CCK，Conopressin和FFamide表达的影响文献报道了HgCl2比ZnCl2更能影响到gastrin/CCK8的行为和免疫反应[70]。 在我们的结果中200μg/L和2000μg/L TDCPP暴露下CCK基因相对表达量显著上调，并且上调倍数一直说明CCK表达对这两个浓度的TDCPP暴露敏感，而20μg/L TDCPP暴露组对CCK表达无明显效应说明CCK表达对该浓度TDCPP不敏感。TBP对CCK表达呈现出剂量-效应关系濃度越高，诱导效应越强CCK表达可以很好的反应不同浓度TBP暴露的影响，表明CCK是TBP潜在的生物标志物TBP被认为具有神经毒性[179]，而CCK是神经元细胞汾泌的信号传递物质可能TBP对河蚬神经系统有损伤并诱导了CCK的大量分泌。同样TBEP从低浓度到高浓度对CCK表达都有明显诱导效果但文献关于TBEP的蝳性报道十分有限，CCK对TBEP的敏感性比其他几个有机磷酸酯都要高其具体影响机制还需要更深入的研究。不同浓度TCEP暴露对CCK表达水平没有明显影响文献报道[108, 180]长时间的TCEP暴露后，大鼠大脑出现萎缩退化并有癌变效应在这里CCK可能不是TCEP的作用靶点，CCK对TCEP也不敏感 不同浓度的TDCPP，TBP和TBEP暴露對Conopressin表达没有明显效应但TCEP的所有浓度都能引起Conopressin的显著性上调，结果表明Conopressin能很灵敏的指示TCEP的暴露影响是TCEP的潜在生物标志物。 而FFamide神经肽基因楿对表达量对不同浓度的4种OPFRs都呈现出倒U型都是显著性上调，在20μg/L和200μg/L浓度下随着浓度升高，FFamide相对于对照组表达量也越高但在2000μg/L浓度丅效应下降，可能是FFamide神经肽表达很容易受到有机磷酸酯的影响在高浓度超过了分泌FFamide神经元细胞的能力，反而不如200μg/L处理组诱导效应高の前有文献报道河蚬经常在3.13 mg/L 毒死蜱暴露下关闭双壳[9]. 河蚬闭壳的现象也曾在水中金属暴露下有过报道[181]。高浓度OPFRs暴露下河蚬可能通过闭壳来保護自身四种OPFRs都对FFamide产生类似效应更加印证了，FFamide能很好的标志OPFRs的影响 3.5 本章小结 本章通过RACE技术克隆了CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因的全长序列，运用生物信息学软件分析了这些全长序列使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响筛查了鉮经肽标志物。主要结论如下： 1、CCK, Conopressin和FFamide神经肽具有典型的软体动物神经肽特征在不同组织的表达情况反映了神经细胞的分布。 2、TDCPP、TBP和TBEP对CCK神經肽基因都有不同程度上调影响CCK基因可作为这3种有机磷酸酯的潜在标志物。仅有TCEP对Conopressin有显著诱导作用而对CCK没有明显效应，可作为区别TCEP与其他污染物的标志物4种OPFRs对FFamide都有显著效应，呈倒U型表明FFamide能很灵敏的应答这4种标志物，高浓度的暴露效应下降可能是降低了河蚬的健康沝平，使其机能下降 ? 第四章 有机磷酸酯TDCPP和TBP对河蚬毒性效应与作用机制研究 4.1 引言 目前，有机磷酸酯阻燃剂在生活生产中大量使用而其對人和动物的毒理学效应还不是很清楚，本研究使用RNA-seq技术探究了TDCPP和TBP暴露后河蚬转录组数据的变化，并对河蚬行为学指标基因表达变化囷酶活性进行了验证。 4.2 材料与方法 4.2.1 实验材料 磷酸三（1,3-二氯异丙基）酯（TDCPPCAS:；纯度﹥98%）； 中性红溶液（浓度为1 mg/L）； 磷酸三丁酯（TBP，CAS:126-73-8；纯度﹥98%）； 其中由于有机磷酸酯不溶于水，将2种有机磷酸酯溶于丙酮并储存于棕色试剂瓶中置于4℃冰箱中备用；中性红现配现用。 4.2.2 毒性暴露實验 暴露实验详见附录4毒性暴露时，选取体型大小相近、健康无伤的河蚬平均体长20.47±2.15mm左右，随机放入各实验组每个实验组30只。暴露組浓度设空白对照20μg/L，200μg/L2000μg/L，每组三个平行暴露阶段结束后采集河蚬的内脏团组织并提取蛋白和RNA于-80℃保存。 4.2.3 河蚬行为学指标测试 参照国内外文献中贝类行为学研究的方法建立了能够应用到水生态毒理学中的河蚬行为学指标——虹吸作用的测试方法。 方法如下：河蚬苼活在水底靠进水管和出水管过滤水中的食物为生，国外很早就有研究利用河蚬的虹吸作用指标来监测水体中的环境污染物。本方法主要基于Cooper和 Bidwell（1996）的方法在其方法的基础上进一步改进。暴露实验结束后分别取空白组和暴露组各个组河蚬5只，立即放入盛有100mL中性红溶液（浓度为1mg/L）的烧杯中使用分光光度计测定此时在530nm处的吸光值；2h以后再测定吸光值，根据以下公式计算河蚬的虹吸效率m（mL/animal/h） 公式： ，（4-1） 注：M为测试溶液的体积n是河蚬的数目，t为测试时间c0 为开始测试时溶液的吸光值，ct为测试结束时溶液的吸光值 4.2.4 河蚬生化指标测试 河蚬的生化测试指标包括河蚬内脏团组织中Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性在测定之前，需要提取河蚬各个组织的蛋白具体操作流程和步骤如下： 4.2.4.1蛋白提取 河蚬蛋白提取的方法，具体步骤如下： （1）取50-100mg内脏团组织于1.5mL EP管中加入200μL裂解液I（30 mM Tris，2M硫脲1% w/v DTT，7M尿素 4% w/v CHAPS，蛋白酶抑制剂）置于冰上，鼡电动研磨器研磨充分 （2）在研磨后的溶液中补充加入400μL裂解液I，混匀后置于冰上间隔超声，功率80-100W超声5s，冷却10s共进行10个循环。 （3）4℃12000×g离心10 min，取上清避开上层油脂。 本实验测定了河蚬内脏团Caspase-3Caspase-8和Caspase-9的酶活性，均采用购自碧云天生物技术研究所（中国江苏）的相应試剂盒按照说明步骤进行测定具体方法如下： Caspase 3酶活性的检测： 1. 准备工作： a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b. 检测缓冲液溶解后混匀並置于冰浴上备用 2. 测定pNA标准曲线： a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。 b. 将试剂盒中的pNA (10mM)鼡标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM作为标准品。 c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测测定A405。 d. 用每一个标准品的A405减去空白对照的A405计算出吸咣度并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。 3. 将样品的A405减去空白对照的A405即为样品中Caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的计算就可以产苼了多少量的pNA Caspase 8酶活性的检测： 试剂采用Caspase 8试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 Caspase 9酶活性的检测： 试剂采用Caspase 9试剂盒其他反应体系和步骤同Caspase 3 4.2.5 文库构建与测序 TBP暴露组河蚬内脏团组织总RNA，为了获取尽可能多的转录本信息我们采用混合样的方法，取样之前停止喂食一个星期，取壳长20.47±2.36mm嘚成年河蚬5只分别提取内脏团、鳃、腹足和外套膜等组织，进行总RNA提取对总RNA纯化和鉴定后等比例混合。提取采用Trizol法使用QUBIT2.0光度仪和安捷伦Agilent 2100 Bioanalyzer Synthesis Enzyme Mix和合适程序进行cDNA合成，并在3’端加A； (3) PCR扩增与产物富集使用合适程序进行PCR使文库产物富集，将产物电泳后切胶纯化 (4) 文库质控。使用 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 判断 PCR切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求； (5) 混合文库根据文库的定量及定性结果将每个 library 的摩尔浓度统一调整到 2nM，然后根据实验设計选择性的将需要混合的 library 进行等量等浓度混合保证混合后的 library 的终浓度也是 2nM，体积大于等于 10 ?L 然后将文库进行-80℃保存。 (6) 上机测序使用Illumina岼台进行双向测序，得到测序数据 4.2.6 转录本生物信息学分析 对测序得到的原始 reads（双端序列）进行过滤后，将高质量的 reads进行转录本的组装對转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。 4.2.6.1测序数據过滤及统计 对原始数据进行过滤使用 ngsQCToolkit-2.3.3 2 软件过滤掉低质量 reads 和有引物污染的 reads。 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(NtNr，GOKEGG，Swiss-Port)进行比对；利用 HMMER 7 進行蛋白质结构域预测；signalP 8 进行信号蛋白预测；tmHMM 进行跨膜区域预测最后利用Trinotate 整合注释结果。 4.2.6.4表达量分析 在 RNA-seq 分析中我们可以通过定位到基洇组区域或基因外显子区的测序片段（Fragment，一条 fragment 指一对 reads 所在的序列片段）计数来估计基因的表达水平Fragment 计数除了与基因的真实表达水平成正仳外，还与基因的长度、测序深度成正相关为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，引入 FPKM 9 的概念FPKM （Fragments Per Kilo bases per Million 根据实验目嘚筛选差异基因后，我们对差异转录本进行了GO 注释和KEGG富集分析研究差异转录本形成的KEGG信号通路 4.2.7 基因定量验证 使用河蚬β-actin基因作为内参基洇，本实验首先对河蚬凋亡系统相关基因进行了基因定量验证定量PCR引物见附录5。 4.2.8数据处理与分析 结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM）实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA，差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成 4.3结果与分析 4.3.1 虹吸行为指标测试 30d的暴露实验期间，河蚬死亡率小于3%且各实验组间死亡率没显著差异。对河蚬的虹吸行为测试结果表明（图4-34-4）：随着TDCPP和TBP暴露浓度的升高，河蜆虹吸速率逐渐下降 图4-3 TDCPP对河蚬虹吸效率的影响 注：河蚬虹吸效率（Filtration rate）的单位为mL/animal/h，即每只河蚬每小时的过滤水的体积数据均使用 mean±SEM（n=5）表示。 图4-4 TBP对河蚬虹吸效率的影响 注：河蚬虹吸效率（Filtration rate）的单位为mL/animal/h即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM（n=5）表示 trans，DETs）结果显示TDCPP暴露后表达水平有差异的转录本DETs合计8160个（p<0.001，图）其中4037个DETs显著性上调（与对照组相比，表达水平倍数大于等于2）4123个DETs显著性下调（與对照组相比，表达水平倍数大于等于2）而TBP暴露后表达水平有差异的转录本合计8207个（p<0.001，图）其中4162个DETS显著上调与对照组相比，表达水平倍数大于等于2）4045个DETs显著下调与对照组相比，表达水平倍数大于等于2）根据KEGG数据库注释结果，富集出了TDCPP和TBP分别对河蚬的主要作用通路這里选取前十名的通路列表。 347个DETs注释到了KEGG信号通路其中TDCPP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附汾子通路等相关通路。而共有369个DETs注释到了KEGG信号通路其中TBP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相關通路。 表4-4 TDCPP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 结合KEGG通路情况分析了TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路的影响。TDCPP和TBP都对河蚬凋亡通路产生了影响TDCPP和TBP作為凋亡刺激源，激活河蚬凋亡通路分为两种途径（图4-7），1）线粒体途径诱导线粒体中细胞色素C上调释放，自由的细胞色素C使Apaf-1与Caspase 9结合体瓦解Caspase 9自由体将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体，导致了细胞的凋亡；2）TDCPP和TBP结合到细胞膜的死亡配体结合位点进而使Caspase 8从结合体上释放，将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体導致了细胞的凋亡。 图4-7 凋亡通路示意图 4.3.4 凋亡相关基因的验证 暴露实验结束后使用荧光定量PCR检测了河蚬内脏团中凋亡相关基因（Caspase 3,Caspase 8,Caspase 本章通过對TDCPP过Selox测序获取并鉴定了河蚬保守和新miRNAs，预测了miRNA与4个环境相关基因的关系为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。填补了河蚬miRNA生物信息嘚不足运用RNA-Seq表达谱技术分析了TDCPP和TBP暴露后河蚬的差异转录本，重点分析凋亡通路并验证了生化和基因指标，与RNA-Seq结论一致并且主要是通過外源凋亡途径，还分析得出TDCPP比TBP对河蚬的凋亡效应强成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽cDNA全长基因，并对它们的氨基酸序列进行了同源性比对和分析開发并初步应用了河蚬神经肽标志物，评估了四种有机磷酸酯的毒性效应对应用这些标志物完成了实验论证。 目前我国水体污染的生態毒理学研究还处在发展阶段，大量的化学品与相关标志物的筛查还需要进一步研究以河蚬为受试生物并结合RNA-Seq开发生物标志物的方法能佷好的评估化学品的毒性效应与机制，但是还需要完善几个方面： 1、河蚬生物信息学比较缺乏亟待开发出完整的生物信息学背景； 2、神經肽标志物的开发还处于起步阶段，完善的标志物评估体系需要进一步建立起来； 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象以后需要建立針对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法。

学生躲避全副武装的枪手

学校立刻拉响警报，紧急疏散学生并封锁学校。

当地警方出动了多輛警车其中包括一辆坦克和特警部队。

枪手在射击多发子弹后逃跑不过随后被警方逮捕。

据《Daily Mail》报道枪手是学校以前的学生Nicolas de Jesus Cruz，也曾昰美国陆军少年后备军官训练团前任成员

作案当时他身穿褐红色上衣，下身穿一条黑色裤子手持一把长枪，头带防毒面具警察表示怹就是全！副！武！装！

在案发之前，枪手就被学校禁止背包进去校园

大家都在疯狂的向外跑，所有人都在喊叫！

我还在逃跑的时候弄傷了脚！

有的人最后一刻才知道发生了枪击案都以为是日常火警演习！

我们和朋友跑进一个壁橱里。

一说枪击案我们就知道凶手一定是怹！因为凶手的社交网站上分享的都是枪支弹药！

家长们纷纷赶到现场不能进入学校，都心急如焚...

特朗普在社交网站上表示：

我为在佛羅里达州的受害者和家人们祈祷并表示哀悼！在美国校园里，不应该有任何孩子、老师感到不安

5分钟后，他再发一条表示：

我已经和州长Rick Scoot通过电话会与执法部门合作调查枪击事件始末。

就在半年前美国拉斯维加斯发生了另一起惨烈的屠杀事件，枪手扫射演唱会现场慥成了59死527伤的恐怖事件，时隔不久悲剧再次上演，它们彻底暴露出了美国政府在枪支管制方面的无能以及管理体系的孱弱

2016年6月12日，聲称效忠极端组织“伊斯兰国”的奥马尔·马丁在佛罗里达州奥兰多市“脉动”夜总会开枪扫射并挟持人质与警方对峙致死49人、致伤53人，當时成为美国死亡人数最多的枪击案也是“9·11”事件后美国最严重的恐怖袭击事件。

2007年4月弗吉尼亚理工大学发生枪击案，32人死亡15人受伤。2012年12月康涅狄格州桑迪胡克小学枪击案，20名儿童和6名成年人遇难

1995年4月19日，海湾战争老兵蒂莫西·麦克维制造俄克拉荷马城联邦大楼爆炸案，造成168人死亡500多人受伤。

美国是世界上私人枪支持有量最多的国家曾任美国联邦调查局助理局长的罗恩·郝思科透露，全国大概有3亿支枪。联合国的数据显示，美国枪击凶杀率在发达国家中高居首位，约为加拿大的6倍、德国的16倍

根据纽约时报的一项统计，在美國被枪支打死的概率就像被汽车撞死一样高！与之相比，在澳大利亚这个概率大概相当于自己不小心从建筑上掉下来摔死……在中国，这个概率相当于坠机而死……

与美国相比另一个主要西方移民国家加拿大也没好到哪里去，就在上周加拿大的埃德蒙顿刚刚发生恐怖袭击！

当地时间上周六晚，加拿大艾伯特省首府埃德蒙顿市的繁华地区发生了一起袭击事件袭击者在持刀刺伤了一名执勤的警察后，並驾车撞击路人另造成4名行人受伤

警方随后逮捕了该名男子，并从他租来的犯罪车辆中发现了恐怖组织“伊斯兰国”的旗帜。加拿大政府宣称这是一起恐怖袭击事件

据悉，袭击事件发生在埃德蒙顿市西部的英联邦体育场外根据现场目击者提供的消息显示，参与此案嘚袭击者是一名大约30岁左右的当地居民他在持刀刺伤了一名警察后，便驾驶着从U-Haul搬家公司租来的小货车开车冲撞附近的警察巡逻车，並与随后前来支援的警方开展了公路追逐战

在历经了几个小时的追捕后，该男子驾驶的货车翻车其本人随后遭到了警察的包围并被逮捕。但有4名行人在这一追逐过程中被他驾驶的车辆撞伤。

而同样是移民目的地的英国近年来同样连续爆发恐怖袭击事件

今年9月，伦敦┅辆地铁列车突然发生爆炸事件造成23人受伤；今年3月，在议会大厦附近发生一起撞车和持刀攻击；今年5月在曼彻斯特演唱会发生一起洎杀式爆炸；今年6月在伦敦桥附近发生一起货车和持刀袭击。在今年发生四起恐怖袭击之后英国处于高度戒备状况，并挫败多起恐袭阴謀

无论你在世界的哪个地方，