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荧光光谱基础知识
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同步荧光光谱法
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同步荧光技术
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你可能喜欢应用三维荧光光谱和可变角同步荧光扫描分析天然荧光氨基酸的含量 - 百度文库
应用三维荧光光谱和可变角同步荧光扫描分析天然荧光氨基酸的含量
第11期化　　学　　世　　界　　　　　?601?
应用三维荧光光谱和可变角同步
荧光扫描分析天然荧光氨基酸的含量
雍克岚1,　吕敬慈2,　吕　蔚3
(1.上海大学生命科学学院;2.上海大学理学院,上海.上海化学试剂研究所,上海200333)
摘　要:在三维荧光光谱等值线图的基础上,选择折线可变角同步荧光扫描途径,对具有天然荧光的氨基酸混合溶液作一次性扫描,可同时对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸进行定量分析,检测“波长对”:苯丙氨酸为Ex252nmEm282nm,酪氨酸为Ex270nmEm304nm,色氨酸为Ex280nmEm348检测线性范围:苯丙氨酸为0.01～0.40LgmL,酪氨酸为0.005～0.30LgmL,色氨酸为0.002～0.15LgmL;相对标准偏差小于3%。方法快速灵敏,相互干扰较少,测试效果良好。
关键词:可变角同步荧光光谱;三维荧光光谱;苯丙氨酸;酪氨酸;色氨酸
中图分类号:O657.39　　　文献标识码:A
文章编号:00)
UsingthreeDimensionalFluorescenceSpectraand
Variable2angleSynchronousScanning,Analyze
theContentsofAminoAcidswithNaturalFluorescence
1YONGKe2lan,　LUJing2ci,　LUbWei
(1.SchoolofLifeSciences,ShanghaiU
2.CollegeofSciences,ShanghaiUniversity,Shanghai200436;
3.ShanghaiChemicalReagentInstitute,Shanghai200333,China)
Abstract:Basedonthecontourofthreedimensionalfluorescencespectra,amulti2lineseg2mentvariable2anglesynchronousscanningpathwaschosen.Usingthismethod,themixedsolutionofaminoacidswithnaturalfluorescencewasdeterminedbyonescan.Thewave2lengthparisofdeterminationareEx252nmEm282nmforphenylalanine,Ex270nmEm304nmfortyrosineandEx280nmEm348nmfortryptophane.Thesimultaneousdetermination
～0.40ofphenylalanine,tyrosineandtryptophanewascarriedwiththelinearrangesof0.01
～0.10LgmLfortyrosine,0.002～0.05LgmLfortrypto2LgmLforphenylalanine,0.02
phanewithRSDoflessthan3%.
Keywords:variable2anglesynchronousthre
作者简介:雍克岚(1946～),女,副教授,主要从事生命科学及仪器分析教学和科研。
Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd.
All rights reserved.
贡献者：zypazyp紫外可见吸收光谱法_百度百科
紫外可见吸收光谱法
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紫外可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收10～800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法，这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。该方法具有灵敏度高、准确度好、选择性优操作简便、分析速度好等特点。
分子的紫外可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析法。分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构紧密相关。紫外光谱的研究对象大
生色团对分子紫外吸收的影响
多是具有共轭双键结构的分子。如，胆甾酮（a）与（b）分子结构差异很大，但两者具有相似的紫外吸收峰。两分子中相同的O=C-C=C共轭结构是产生紫外吸收的关键基团。
紫外-可见以及近红外光谱区域的详细划分如图4.4所示。紫外-可见光区一般用波长（nm）表示。其研究对象大多在200-380 nm的近紫外光区和/或380-780 nm的可见光区有吸收。紫外-可见吸收测定的灵敏度取决于产生光吸收分子的摩尔吸光系数。该法仪器设备简单,应用十分广泛。如医院的常规化验中，95%的定量分析都用紫外-可见分光光度
紫外-可见光谱区域
法。在化学研究中，如平衡常数的测定、求算主-客体结合常数等都离不开紫外-可见吸收光谱。
紫外可见吸收光谱的基本原理是利用在光的照射下待测样品内部的电子跃迁，电子跃迁类型有：
（1）σ→σ* 跃迁 指处于成键轨道上的σ电子吸收光子后被激发跃迁到σ*反键轨道
（2）n→σ* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的n电子吸收能量后向σ*反键轨道的跃迁
（3）π→π* 跃迁 指不饱和键中的π电子吸收光波能量后跃迁到π*反键轨道。
（4）n→π* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的n电子吸收能量后向π*反键轨道的跃迁。
电子跃迁类型不同，实际跃迁需要的能量不同：
σ→σ* ～150nm
电子跃迁所处的波长范围
n→σ* ～200nm
π→π* ～200nm
n→π* ～300nm
吸收能量的次序为：σ→σ*&n→σ*≥π→π*&n→π*
特殊的结构就会有特殊的电子跃迁，对应着不同的能量（波长），反映在紫外可见吸收光谱图上就有一定位置一定强度的吸收峰，根据吸收峰的位置和强度就可以推知待测样品的结构信息。
1、紫外可见吸收光谱所对应的电磁波长较短，能量大，它反映了分子中价电子能级跃迁情况。主要应用于（共轭烯烃和不饱和羰基化合物）及的分析。
2、由于电子能级改变的同时，往往伴随有振动能级的跃迁，所以图比较简单，但峰形较宽。一般来说，利用紫外吸收光谱进行定性分析信号较少。
3、紫外可见吸收光谱常用于共轭体系的定量分析，灵敏度高，检出限低。
紫外可见吸收光谱仪由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录（计算机）等部分组成
普通紫外可见光谱仪，主要由光源、单色器、样品池(吸光池)、检测器、记录装置组成．为得到全波长范围(200～800-nm)的光，使用分立的双光源，其中氘灯的波长为185～395 nm，钨灯的为350～800nm．绝大多数仪器都通过一个动镜实现光源之间的平滑切换，可以平滑地在全光谱范围
双光束分光光度计的原理图
扫描．光源发出的光通过光孔调制成光束，然后进入单色器；单色器由色散棱镜或衍射光栅组成，光束从单色器的色散原件发出后成为多组分不同波长的单色光，通过光栅的转动分别将不同波长的单色光经狭缝送入样品池，然后进入检测器(检测器通常为光电管或光电倍增管)，最后由电子放大电路放大，从微安表或数字电压表读取吸光度，或驱动记录设备，得到光谱图。
紫外、可见光谱仪设计一般都尽量避免在光路中使用透镜，主要使用反射镜，以防止由仪器带来的吸收误差．当光路中不能避免使用透明元件时，应选择对紫外、可见光均透明的材料(如样品池和参考池均选用石英玻璃)．
仪器的发展主要集中在光电倍增管、检测器和光栅的改进上，提高仪器的分辨率、准确性和扫描速度，最大限度地降低杂散光干扰．目前，大多数仪器都配置微机操作，软件界面更贴近我们所要完成的分析工作．
物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子的特征。如果物质组成的变化不影响生色团和助色团，就不会显著地影响其吸收光谱，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光谱。另外，外界因素如溶剂的改变也会影响吸收光谱，在极性溶剂中某些化合物吸收光谱的精细结构会消失，成为一个宽带。所以，只根据紫外光谱是不能完全确定物质的分子结构，还必须与红外吸收光谱、核磁共振波谱、质谱以及其他化学、物理方法共同配合才能得出可靠的结论。
化合物的鉴定
利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系，如C=C－C=C、C=C－C=O、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。
（1）如果一个化合物在紫外区是透明的，则说明分子中不存在共轭体系，不含有、或溴和碘。可能是脂肪族碳氢化合物、、、醇等不含双键或环状共轭体系的化合物。
（2）如果在210～250nm有强吸收，表示有K吸收带，则可能含有两个双键的共轭体系，如或α，β-不饱和等。同样在260，300，330nm处有高强度K吸收带，在表示有三个、四个和五个共轭体系存在。
（3）如果在260～300nm有中强吸收（ε=200～1 000），则表示有B带吸收，体系中可能有苯环存在。如果苯环上有共轭的生色基团存在时，则ε可以大于10 000。
（4）如果在250～300nm有弱吸收带（R吸收带），则可能含有简单的非共轭并含有n电子的生色基团，如羰基等。
如果有机化合物在紫外可见光区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，则可利用紫外光谱检验化合物的纯度。对于异构体的确定，可以通过经验规则计算出λmax值，与实测值比较，即可证实化合物是哪种异构体。如: 乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇式互变异构
位阻作用的测定
由于位阻作用会影响共轭体系的共平面性质，当组成共轭体系的生色基团近似处于同一平面，两个生色基团具有较大的共振作用时，λmax不改变，εmax略为降低，空间位阻作用较小；当两个生色基团具有部分共振作用，两共振体系部分偏离共平面时，λmax和εmax略有降低；当连接两生色基团的单键或双键被扭曲得很厉害，以致两生色基团基本未共轭，或具有极小共振作用或无共振作用，剧烈影响其UV光谱特征时，情况较为复杂化。在多数情况下，该化合物的紫外光谱特征近似等于它所含孤立生色基团光谱的“加合”。
氢键强度的测定
溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的UV光谱有较大的影响。对于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中R带的差别，可以近似测定氢键的强度。溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的UV光谱有较大的影响。对于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中R带的差别，可以近似测定氢键的强度。
朗伯-比尔定律是紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的理论基础，它的数学表达式为: A = ε b c
影响紫外吸收光谱的因素有：1、；2、超共轭效应；3、；4、溶剂。
各种因素对吸收谱带的影响表现为谱带位移、谱带强度的变化、谱带精细结构的出现或消失等。谱带位移包括（或紫移，hypsochromic shift or blue shift))和(bathochromic shift or red shift)。蓝移（或紫移）指吸收峰向短波长移动，红移指吸收峰向长波长移动。吸收峰强度
效应示意图
变化包括增色效应(hyperchromic effect)和减色效应(hypochromic effect)。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。各种因素对吸收谱带的影响结果总结于图中。