酶切后切胶回收(酶切,切胶回收,条带,质粒) - DNA技术 - 生物秀
标题: 酶切后切胶回收(酶切,切胶回收,条带,质粒)
摘要: [酶切后切胶回收(酶切,切胶回收,条带,质粒)] 请教各位大虾，本人PCR产物酶切后回收总是不成功，有时候条带微弱根本没法回收，有时候回收后电泳看不出条带，我已经重复一个月了，每次都卡在这一步，实在不知道该怎么办了。双酶切应该没有问题，因为酶切后5μL电泳条带还可以，但是等我用1%新胶把所有酶切产物加入准备回收时条带就几乎看不见了，我跟质粒一起做的，质粒每次都很好。我的PCR产物200多bp，PCR后产物不是很亮。请求各位帮忙分析一下原因，谢谢！ 关键词:[酶切 条带 切胶回收 质粒 电泳条带 酶切产物 电泳]……
请教各位大虾，本人PCR产物酶切后回收总是不成功，有时候条带微弱根本没法回收，有时候回收后电泳看不出条带，我已经重复一个月了，每次都卡在这一步，实在不知道该怎么办了。双酶切应该没有问题，因为酶切后5μL电泳条带还可以，但是等我用1%新胶把所有酶切产物加入准备回收时条带就几乎看不见了，我跟质粒一起做的，质粒每次都很好。我的PCR产物200多bp，PCR后产物不是很亮。请求各位帮忙分析一下原因，谢谢！
回复1，PCR产物大小对不？产量如何？2，大小没问题，产量低的话。一，调整PCR参数。二，多做几管，合并产物做下一步。3，直接酶切还是对PCR产物纯化后再酶切？纯化后再酶切效果好些。有PCR纯化盒，或者跑胶切胶回收。4，酶切目的片段多大，我估计和PCR产物大小差不多，对吧，无法从胶上分辨出来。5，双酶切不行，就一个一个切。可以一个切完了，调整盐浓度后再加另一个酶。或者一个切完了用盒纯化一下，再切另一个。6，你意思好像说是酶切完，用5微升测试性的跑胶，可以看到条带。而上了所有酶切样品后就看不到条带了。奇怪。不过你可以把切完的样品用试剂盒纯化一下再上胶回复200bp产物不亮属于正常情况。楼主的问题是因为回收损失太多。建议先进行TA-clone。不要直接连接载体。或者pcr产物纯化后酶切，酶切70度灭活15分钟后直接做连接，不要再做回收了。当然前提保护碱基设计没问题。回复首先谢谢两位！我的PCR产物酶切只是在两端加上酶切位点，然后与酶切后的质粒连接（目的加上末端十几个bp），我都是直接酶切的，不知道两位所说的纯化具体怎么做？我昨天再次回收，切胶的时候还是有条带的，但回收后电泳pcr产物又没有条带了，可能还是损失太大的缘故。因为我的载体6000多，需要用的PCR产物量较少，我就先尝试连接了，希望可以转出来吧。回复唉，奇迹没有出现啊，菌落pcr全部无条带，快急疯了。请问一下我的理解是不是错误的，我用200多bpPCR产物去跟6kb的载体连接，PCR产物是不是需要很多啊，这个比例应该是怎么算的呢？急盼高手指点！回复长度相差这么大（6和0.2，30倍），只要一点片段就够了（比如100ng载体加10ng片段，就已经是3：1了）片段加太多了可能造成自身的聚合，反而连不上回复谢谢，那我再试试吧回复我做过300bp左右的片段，也经常卡在回收这一步。小片段确实容易损失，而且似乎开始的样品越少损失就越大。我不知道你是怎么回收的，我用的是胶回试剂盒，感觉除了protocal上的注意事项外，最后一步最好12000rpm 1min,另外胶一定要溶解完全，反正每一步都小心点，多做几次，应该能做出来的回复pcr产物酶切之后就不要跑胶了，用试剂盒回收以后直接连，我都是这么做的，没问题回复我用的天根公司的胶回收试剂盒，质粒一起回收都没问题，还是PCR产物太少了，再加上回收过程中的损失，我想再跑PCR时多加模板，看能不能多点产物回复跑PCR时多加点引物，效果应该比多加模版更好有专门的PCR回收试剂盒，效率很高的，肯定比你这样跑胶损失的要少。连接反应不需要特别高的纯度的，或者也可以乙醇沉淀就足够了。回复用PCR回收产物做模板，再PCR，产量不就高了么。别怕麻烦，多扩增点。另外，计算连接前两者的比例方法是（以1000 bp 插入5000bp的载体为例）：100ng：5000÷所求的基因片段质量ng：或1：3或1：6或1：10（连接梯度）。不知我表达的明白否。回复谢谢，我会尝试两位的建议提高PCR产量。三立老师所说的“用PCR回收产物做模板，再PCR”是指怎么回收？能否再指教一下？回复可以直接取0.5或1微升PCR产物液做二次PCR，但若不怕麻烦，也可PCR回收试剂盒或者跑电泳，胶回收盒回收后产物做模板。回收后测一下浓度。PCR回收试剂盒用于不存在非特异扩增的时候。如果有非特异条带，最好跑胶回收。回复PCR产物作模板容易导致突变率提高，如果有其他办法的话，一般不这么做吧？回复PCR产物作模板容易导致突变率提高？今天真从您那学习了！谢谢！回复咳咳，不好意思了……准确地说，据我的理解，应该是容易导致突变的积累，因为每一次扩增都有突变的可能。而且PCR产物作模板会更容易产生的非特异的产物回复现在好好分析一下你的酶切位点吧，再检查一下是否可以从PCR结果上切下来。可以参考NEB网站上面关于寡聚的酶切保护位点。另外，可以看出你的PCR的量始终不是太高，所以，最好还是采用第二位站友给你的建议，采用TA克隆的方法先连接后再酶切连接。祝你好运。回复可能有一点你没有提到，大家也没有注意到，就是你把大量的PCR产物加到了很宽的加样孔中，以致单位面积分布的PCR产物量比上小样时少，所以跑出来的条带很淡看不清，我建议你用小的加样孔多加几个孔，电泳跑出去的溴芬兰条带离加样孔约1－1.5cm时即可看胶，割胶。你试试吧，我想应该是这个问题，祝你好运！回复谢谢大家了，我昨天跑了四趟PCR，加模板、加引物、PCR产物稀释500倍后二次PCR，结果都不理想，甚至更淡！最后我还是按原先的体系把循环数加到34，5μL跑电泳还是不到50ng，没办法只得拿了100μL做酶切了，我现在怀疑是不是模板有问题，我的模板是基因组cDNA经过TA克隆后的菌液抽提的质粒，1：10稀释后2μL，我打算重新抽提一下看看。另外葬羚羊所说的问题确实存在，我切胶回收做加样孔之前都是用两块玻璃，做的时候要用手扶一会，再加上用的是1%的胶，跑了之后真的淡得看不见了，我最近已经注意到这个问题了，找了两个很薄的，做胶的时候也很小心，回收前能看得到条带，但回收后10μL也辨不出来，所以还是要加大PCR产物量。回答晓风晨露，我的酶切位点应该没问题，但两个酶的buffer不同，可能效率不太高，但是从载体酶切后电泳看是能切开的，PCR产物的看不出来，我也挺担心这个问题的。另外小片段一般不是不做T-A克隆吗？我这方面也不太懂，之前曾经考虑过，后来也没做。回复还没做好？好好分析你的试验吧。别老盯着一个问题，可能会忽略了真正的问题所在。我的经验：1 正常的200bp的pcr产物量也会很大，电泳条带也非常亮。如果引物设计不恰当，引物dimer都会产生很亮的条带，更别说200bp的扩增带了。如果pcr后电泳检测目的扩增带不太亮，建议先分析引物和pcr条件。2 我一般是先回收pcr产物，再进行酶切。有很多kit都可以，不过一般建议<500bp的都要使用异丙醇以提高回收率。照kit说明书操作，200bp扩增产物回收率至少大于75％。一般情况下，足够进行后续操作。回收后取样进行电泳检测，如果回收率低，请确认回收kit、操作步骤没问题，否则重新考虑pcr问题。3 正常酶切后，可进行电泳检测及胶回收，也可直接用kit回收。记住加异丙醇，以提高回收率。同2。4 如果你有转化子，可以采用其它方法鉴定一下。我对转化子一般采用酶切的方法进行鉴定。如果是采用双酶切（非互补粘端）重组的，挑5个转化子，正常重组一般可有4－5个。用pcr方法鉴定没做过，不敢妄评。5 总的意思是做一步检测一步确认一步。步步为营哈。回复你不要电泳了再做胶回收,这样常常会丢掉很多的.可以直接用PCR产物回收试剂盒就可以了.然后再酶切...回复谢谢各位的关注，看来还是要从PCR着手，一步步来了。因为我的载体之前已经插入了一个amp抗性基因片段，但是末端少了十几个bp，所以现在相当于是要将这十几个bp补进去，现在PCR产物太少，转化子鉴定不出来实在说不清是哪一步的问题。快折腾两个月了，心急如焚啊！！！回复再问一下，PCR条带单一、特异、位置也对，就是产量太少，主要应该从哪些方面考虑解决呢？回复好办！调整模板和引物的浓度！回复适当降低退火温度，以提高扩增效率回复请问luotx 用Kit回收 <500bp片段时，哪一步加异丙醇？不是说加乙醇吗？回复我和你做的实验一样,也是PCR后跑胶回收,但我是大的用0.8,小的用0.6浓度的胶,而且切后用吸尽液体,累计再提.产量较好.具体请问孤叶扁舟.他回收的产量很大.回复异丙醇是在溶胶后，上柱子之前加的。takara家的胶回收试剂盒是要求终浓度20%。效果还是不错的。回复谢谢“谁”的回答，异丙醇是在溶胶后加的，混匀后再过柱。要求终浓度20%。回复适当降低退火温度，以提高扩增效率那是不是引物也得换掉啊？回复小片断回收率很低的，我发现生工的回收试剂盒没有华舜的好，我300bp的，用华舜的都回收个50%左右，异丙醇每次都家，但没有做过比较。可以尝试酶切后不回收直接连接，但是阳性率有点高回复说错了，是假阳性比较多。但是我做过一回还真做成了，那时候也是总是回收没条带，买新试剂盒又耗时间，就尝试了一下不回收直接连接。回复谢谢iptgxgal，我之前也想过直接连接，但就是怕假阳性太高，筛选难度太大了，而且我的载体中已经有1K多的片段连进去了，本来就有很高的假阳性，所以一直没有这样做。但是现在更郁闷的是，我同样条件差不多同样体系PCR干脆出不来了，我已经没有勇气做下去了，休几天再做做吧，将近两个月了，死的心都有了！！回复请问PCR产物跑电泳时模板比目的条带还亮是正常现象吗？模板过多会影响扩增效率吗？
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电话：021-PBI121载体酶切后回收 - 实验交流 - 生物秀
标题: PBI121载体酶切后回收
摘要: [PBI121载体酶切后回收] 各位虫友，最近小虾我在做表达载体的构建，要用到PBI121这个表达载体，进行双酶切后要对其胶回收，这两个酶切位点相距很近，中间就隔了BamH1，前段时间用OMEGA胶回收试剂盒做预实验没有回收到这么大片段的DNA，所以在这寻得帮助，怎样才能回收这么大片段的DNA,大小将近13kb。另一个问题是我用N 关键词:[酶切 双酶切 大片段 乙醇 失活 酶切位点 试剂盒]……
各位朋友，最近小虾我在做表达载体的构建，要用到PBI121这个表达载体，进行双酶切后要对其胶回收，这两个酶切位点相距很近，中间就隔了BamH1，前段时间用OMEGA胶回收盒做预实验没有回收到这么大片段的DNA，所以在这寻得帮助，怎样才能回收这么大片段的DNA,大小将近13kb。
另一个问题是我用NEB家的酶，用Xba1和sma1进行双酶切，但是温度不统一，所以先进行了Sma1 25度单酶切，后没有电泳胶回收，而是直接将sma1 65度失活，再进行了xba1 37度酶切，同时加了BSA。这两个酶有通用的buffer，所以第二次的xba1酶切没再加buffer。NEB网站上介绍了这种分开酶切，不知道是因为上面介绍的原因，还是我自己理解问题，我就是没有弄明白中间是不是需要纯化再进行第二次的酶切，还是按我这用方式，希望得到大家的帮助回复对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。回复
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉 ... 谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧:hand:回复
谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧:hand:... 如果两个酶的buffer相同，不用再加buffer，还用原来的体系就可以了。回复大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。回复
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。 请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分析一下呗？谢谢回复
请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分 ... 首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品电泳看酶切效果。做克隆不要怕麻烦，每一步验证正确后再往下做，应该没有问题的。回复
首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品 ... 谢谢，坚持不懈~回复
请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分 ... 我用的是Takara限制酶，NEB的不清楚，不过按照你说的情况，这两个酶切位点很近，是不是应该考虑保护碱基，有时保护碱基不足，酶活性只有20y要延长酶切时间甚至可以过夜酶切,如果不存在保护碱基问题可以尝试换别的公司限制酶试试。回复
我用的是Takara限制酶，NEB的不清楚，不过按照你说的情况，这两个酶切位点很近，是不是应该考虑保护碱基，有时保护碱基不足，酶活性只有20y要延长酶切时间甚至可以过夜酶切,如果不存在保护碱基问题可以尝试换别的公 ... :hand: 我再试一下延长酶切时间~回复大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。回复大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。回复对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。回复
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。 900的片段可不可以用乙醇回收呢？我双酶切质粒，Ecorl和Xhol酶切位点，有共用buffer，温度也一样，为啥每次切完后都是两条在5000以上的条带？回复
首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品 ... Ecorl和Xhol双酶切切不开，每次都是两条5000以上的条带，目的片段是900的，什么情况啊回复
Ecorl和Xhol双酶切切不开，每次都是两条5000以上的条带，目的片段是900的，什么情况啊... 确定质粒上带XhoI位点吗？回复
900的片段可不可以用乙醇回收呢？我双酶切质粒，Ecorl和Xhol酶切位点，有共用buffer，温度也一样，为啥每次切完后都是两条在5000以上的条带？... 首先，900bp的片段用Axygen(非托勿疑:D)回收效果很好，酶切问题可以分步酶切，检测到底是哪个酶（位点）没切开，再进行后续改进。回复PBI121很常用，正常的方法就行，没必要什么大片段。我们实验室就是这样的。用的TAKARA的酶。和普通的载体构建一样的回复最好用同一个体系酶切吧，反正不建议分步酶切，我没用过这样的方法。我一般就用TAKARA的酶，TAKARA的酶一般都有公用的，一个体系就行。回复
确定质粒上带XhoI位点吗？... 片段是用加酶切位点引物扩出来的，然后连到pMD-18T载体上，测过序结果是对的，就是菌液时间有点长，有半年了，但每次都是新摇的菌
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电话：021-DNA回收不出!如何解决啊?急 !(条带,割胶回收,质粒酶切,酶切) - DNA技术 - 生物秀
标题: DNA回收不出!如何解决啊?急 !(条带,割胶回收,质粒酶切,酶切)
摘要: [DNA回收不出!如何解决啊?急 !(条带,割胶回收,质粒酶切,酶切)] 我做DNA回收都做烦了 质粒酶切后所需的目的片段经EB染色 有明显的条带,在紫外灯下割胶回收(用的是安徽优晶生物公司的凝胶回收试剂盒)每次纯化玩跑百分之1的琼脂糖电泳鉴定 结果是 要么隐约见得点点条带 要么就干脆什么都没有 , 这是怎么回事啊 !我纯化其他DNA的时候都挺好的
不知道是DNA的问题还是酶切的问题 关键词:[条带 质粒酶切 割胶回收 酶切 琼脂糖电泳 凝胶回收试剂盒]……
我做DNA回收都做烦了 质粒酶切后所需的目的片段经EB染色 有明显的条带,在紫外灯下割胶回收(用的是安徽优晶生物公司的凝胶回收盒)每次纯化玩跑百分之1的琼脂糖电泳鉴定.结果是 要么隐约见得点点条带 要么就干脆什么都没有 , 这是怎么回事啊 !我纯化其他DNA的时候都挺好的. 不知道是DNA的问题还是酶切的问题
回复回收必然有损失.如果要提高回收的量, 在酶切时加大量, 比如用50ul的体系, 每管10-15ulDNA做4-8管(根据情况了, 如果你的质粒DNA 浓度高, 适当调整, 做2管就够了, 如果你需要的回收量很大, 比如做线性片段的整合, 可以切很多管).回收的时候, 检测胶就上4-6ul, 看酶切是否完全, 如果切好了就可以回收了.回收胶还是根据你的情况了, 可以一个梳孔加100--200ul, 如果需要可以把所有的都加到一个梳孔, 当然你要调整你的梳齿了.如果是小片段回收, 100bp左右, 回收率低, 一般盒会有一些相应措施, 比如入其他有机溶剂等等.回复我也遇到过同样的问题。我用的是和你一样的试剂盒，回收有十几次吧。可是结果不理想，怀疑是回收试剂盒的问题。建议你改用玻璃奶回收试剂盒！回收一次，电泳带就很亮！！回复我的片段是400bp的 我想不至于这么的失败吧 我用的酶是EcoR1 和sal1 的双酶切 用的Buffer是H 质粒43ul（大约浓度是1.5-2ug）酶是用的Takara的酶 今天我又做了酶切 彻底失败啊没有切出来 我还是试一下大家给我的建议吧做好了 我要好好谢谢大家回复回收之后的得率的确比较低的，我感觉只有30-50％左右。400 bp 比较小，就更容易损失了。我认为回收之后不用再次跑教鉴定了，估计一下所得DNA的量以及浓度，直接进行下面的实验即可。如果你要连接DNA片断的话，就直接连接－－转化好了。另外，胶回收的时候，有些试剂盒在某一步骤让你添加异丙醇（针对小的DNA片断）的，不知注意了没？回复回收之后的得率的确比较低的，我感觉只有30-50％左右。400 bp 比较小，就更容易损失了。我认为回收之后不用再次跑教鉴定了，估计一下所得DNA的量以及浓度，直接进行下面的实验即可。如果你要连接DNA片断的话，就直接连接－－转化好了。另外，胶回收的时候，有些试剂盒在某一步骤让你添加异丙醇（针对小的DNA片断）的，不知注意了没？这样做不严谨, 试想如果这样做, 给后边的操作带来多大的筛选工作量, 用酶切产物直接连接, 那么在你的连接体系里有多少干扰因素, 光DNA, 就有载体切开的两种, 他们直接连接的效率就高了.回复推荐使用胶回收试剂盒:国产：上海华舜进口：OMEGA
Qiagen回收效率主要看柱子而不是试剂本身，回收效率最高的是OMEGA，其次是上海华舜，然后是Qiagen，但是这三个试剂盒回收效率都足以满足实验需要了，但是他们的价格由高到低分别是Qiagen（一千多） OMEGA（300左右） 和上海华舜（200-300），Qiagen的优势在于能回收70bp的片断，重复性最好。性价比最高的当然还是OMEGA2. 如果要用你现在手里面的试剂盒，要富集也很简单，首先确认你的柱子回收的最小片断是好多，如果确信400bp没问题的话就多切几管，水浴溶化后挂在同一个柱子上，然后再Wash，最后用30ul洗脱绝对没问题的！3.强烈建议使用相对较好较稳定的试剂盒，特别是对于实验技术不是很熟练的，要不然不好分析试验失败原因，在这上面节约完全没有必要！回复hu145165：你好！既然“质粒酶切后所需的目的片段经EB染色 有明显的条带”,那么你的问题可能还是出在胶回收上。的确，胶回收的劣势之一就是损失太大，尤其对于小片段，更是如此，有的试剂盒甚至只能回收30％左右。这时胶回收试剂盒的质量就很重要了，华舜的我用过，的确不错。但是你说"我纯化其他DNA的时候都挺好的",如果其他的DNA和你的目的片段大小类似，那么你就要注意是否是操作中存在问题。试剂盒说明书要多看几遍，注意一些细节的问题。batistutay朋友所说的"多切几管，水浴溶化后挂在同一个柱子上"我觉得是可行的，在柱子可以吸纳的范围内可以这么做。但是你也要注意不能过多，试剂盒说明上应该是有柱子容量的介绍的。另外介绍一个小窍门，我使用过程中的经验。最后一步用洗脱柱子的时候，可以用洗过柱子的TE或者水再次上柱洗脱，可以重复2－3次。对于小片段，我推荐这种操作，回收效率会得到提高。你可以试一试，祝好运！回复推荐使用好一点的回收试剂盒，对比试验花的时间与精力还是很合算的像宝的个人感觉还不错，推举！回复谢谢大家给我提供这么宝贵的意见，今天纯化了采用了原儿茶 的推荐和batistutay感到欣慰的是终于纯化出一点点，由于定的试剂盒还没有送到，感谢大家对我的帮助，做出来了我回告诉大家的回复看一下buffer的颜色，要是不是淡黄色，结合效率都很低了。其实，U-gene的还可以的，我们这里都用这个。以前用Omega，后来改U-gene了回复u-gene的我一直用，我觉得质量还是可以的你把你的详细步骤贴出来看看你这样说，谁也不知道你的问题在哪里还有，如果你下来做连接什么的，看不见也无所谓，直接连接转化，照样能得到重组子回复我的Buffer一直都是淡黄色的看了上面两位仁兄的讨论和我结合楼上4位的意见我已经用U-gene纯化出比较亮的条带了,但是感觉上400kd的还是比较难的纯化出来一些. 我把我纯化的电泳发出来 回复我打算在多切几管质粒 放入同一柱子上回收试剂盒的操作是没问题,其注意事项我都做好了.我怀疑还是试剂盒的问题吧
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电话：021-酶切、连接、转化请教 - 实验交流 - 生物秀
标题: 酶切、连接、转化请教
摘要: [酶切、连接、转化请教] 我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109 如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家：（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 关键词:[酶切 细胞 转染 质粒 白斑]……
我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家：
（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？
（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。
（3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？
（4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？
（5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？
（6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？
（7）转染一般多少次重复？
（8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？
(9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？
Thanks！回复（1)酶切前后都要 胶回收
（2）0.5ul
（4)1ul Takara的T4连接酶
（5）连接之后直接转化，不需要纯化
（6）（7）98)我没做过，回复（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？要
（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 按酶的活性单位和你酶切产物的量，适当加大用量或酶切时间
（3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？参考酶公司提供的目录上的双酶切使用Buffer列表
（4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？按各个酶的说明书，可适当加大酶量和连接时间
（5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？一般不需要纯化，连接产物直接可以转化，也可以醇沉后转化回复我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考：
（1）PCR之后、酶切之前 这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。其次，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提去质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。
（2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。
（3）加0.5 ul。
（4）不用提纯，直接转化。
以下请高手继续解答。回复我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考：
（1）PCR之后、酶切之前 这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。然后，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提取质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。
（2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。
（3）可以。
（4）加0.5 ul。
（5）不用提纯，直接转化。
以下请高手继续解答。回复（6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？-------Invitrogen的lipo 2000咯，很经典，HepG2还是可以用这个转的
（7）转染一般多少次重复？--------24孔设3个复孔，96孔至少6个
（8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？----------24孔都可以，看你要做的下游实验是什么。western的话60皿，纯看形态24孔板
(9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？---------绝对要！无论做什么操作，如传代、换液等，都要预热培养基回复（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。
-------以上所有答多少ul的酶的答案都是不到位的。按照NEB的体系，50ul一般需要2个单位内切酶。这里的50ul是含有≤2ug的质粒DNA。根据酶活定义，一小时消化1ug DNA为一个单位。
（4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？
-----------同（2），是需要根据酶活定义来看的。建议使用快速连接kit
（5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？
-----------化学感受态是不需要的
这里的任何一种工具酶都不要用takara的。内切酶星号活性严重，酶活低，T4酶活也很低。回复真是很受帮助
小虫初来！
谢谢！回复takara的内切酶还好，酶切效率挺不错的，就是千万不要加太多了，50ul的体系双酶切每种酶加1ul即可，不可过多。连接酶，takara的效率不是很高，建议用全氏金的，10分钟即可连接完成。回复谢谢各位了，我也学习学习
:)回复谢谢了。。回复（3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？
两种酶在同一种buffer下酶活是否一样？
如果不一样，最好先加酶活低的酶，混匀再加酶活高的酶。
再或者先加酶活低的酶酶切2.5-3h后，再加另外一种酶酶切同样长的时间。回复楼主遇上高人了，好运气回复
我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家：
（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？
（2）酶切的时候，要 ... 双酶切你去查公用buffer 在公用buffer里活性都不错的话就一起加进去，不要做2个单酶切了，回收2次损失很大。
HepG2细胞贴壁不是很容易消化下来，通常我0.1%Trip需要用2min来消化
所以你开始传细胞的时候就把培养液拿出来放在酒精灯附近就行了
消化细胞不建议放到培养箱里去，很容易过头，而且效果不那么好，不缺那一点时间，而且从超净台拿到培养箱还增加污染的机会。
可以不预热，因为肿瘤细胞比较皮实，我们在不转染只是维持细胞的情况下都是不预热的，但是要转染之前几天会好好调整一次细胞状态
另外 建议用6well板 比较好种匀回复看看酶的说明书，公用BUFFER可以去网站查。自己可以设计下回复提个建议：在的说明书都有比较好的方案，可以根据说明实验
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