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氨氧化细菌的分子生态学研究进展
应 用 生 态 学 报! B##C 年 * 月! 第 &$ 卷! 第 * 期! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 9F&E:J: ILG,E;& LW &SS&&:O 1RL&LMT，IGE) B##C ， 89 （*） ： &AC&@&ACC氨氧化细菌的分子生态学研究进展 !董莲华! 杨金水! 袁红莉!!（ 中国农业大学生物学院农业部农业微生物资源及其应用重点开放实验室，北京 &###$% ）摘! 要! 氨氧化细菌 （ &’( ） 在全球氮循环中具有重要作用) 本文综述了目前 &’( 的分子生 态学研究进展) 主要介绍了 &’( 的种类和系统发育， 基于 &*+ ,-.& 的系统发育分析表明 &’( 的系统发育比较简单， 均属于变形菌纲的 ! 和 & 亚纲) 还介绍了目前研究 &’( 主要采用 的分子生态学方法， 如变性梯度凝胶电泳 （ /001 ） 、 末端标记2限制性片段长度多态性 （ 32 -456） 、 荧光原位杂交 （ 47+8） 和实时定量 69（ ,:;&2=&?: 69- ） 等， 总结了生态因子的改变对 &’( 群落结构和数量的影响， 并对今后氨氧化细菌的应用分子生态学研究方向进行了展望) 关键词! 氨氧化细菌! 氨单加氧酶! !&#$! 末端标记2限制性片段长度多态性 ! 变性梯度凝 胶电泳! 实时定量 69-! 生态因子 （ B##C ） #*@&AC&@#C! 中图分类号! +&D%! 文献标识码! & 文章编号! &##&@$AAB !&#&$%&’ $()$*&&# +* ,-.&&/.$% &&-.-01 -2 $,,-*+$ -3+(+4+*0 5$&6&%+$7 /’.0 5&;E2FG;， H&.0 I&E2JFG&，HK&. 8LEM2&&（ %&’&()*+ #, $-*&./0)/*1 21+ 3!4#*!)#*+ #, $-*#5%&.*#4&!0 61(#/*.1 !’7 $880&.!)&#’ ，9#001-1 #, :&#0#-&.!0 ;.&1’.1(，9&&’! $-*&./0)/*!0 =’&&1*(&)+，:1&?&’- &###$% ，9&&5 ’!） @ 59&&’@ A@ $880@ B.#0) ， B##C ， 89 （*） ： &AC&@&ACC) :5#6%$&6 ：&??LE&; LN&O&P&EM Q;R=:,&;（ &’( ）S&;T ;E &?SL,=;E= ,L&: &E M&LQ;& E&=,LM:E RTR&:) 3F&J S;S:, ,:U&:V:O =F: ,:J:;,RF ;OU;ER:J LE ?L&:RG&;, :RL&LMT LW ;??LE&; LN&O&P&EM Q;R=:,&;) 3F: ;2 E;&TJ&J LW JTJ=:?;=&R :UL&G=&LE LW &’( Q;J:O LE &*+ ,-.& ,:U:;&J =F;= =F: :UL&G=&LE LW &’( &J XG&=: J&?S&: ，VF&RF Q:&LEMJ =L ! ;EO & JGQM,LGS LW 6,L=:LQ;R=:,&;) 3F&J S;S:, ;&JL &E=,LOGR:O =F: ?;&E ?L&:RG&;, :RL&LM&R;& ?:=FLOJ &E =F: J=GOT LW &’( ， VF&RF &ER&GO:O O:E;=G,: M,;O&:E= M:& :&:R=,LSFL2 ，=:,?&E;& ,:J=,&R=&LE W,;M?:E= &:EM=F SL&T?L,SF&J?（ 32-456 ） ，W&GL,:JR:ER: &’ (&)/ ,:J&J（ /001 ） FTQ,&O&P;=&LE（ 47+8） ，;EO ,:;&2=&?: 69-，JG??;,&P:O =F: :WW:R=J LW :RL&LM&R;& W;R=L,J LE =F: RL?2 ?GE&=&:J ;EO SLSG&;=&LEJ LW &’( ，;EO S,LJS:R=:O =F: ,:J:;,RF O&,:R=&LEJ LE ?L&:RG&;, :RL&LMT LW &’() ;&1 &-%(#：;??LE&; LN&O&P&EM Q;R=:,&;；;??LE&; ?LELLNTM:E;J: ；!&#$；32-456；/001 ；,:;&2 =&?: 69-；:RL&LM&R;& W;R=L,J) ! ! 硝化作用是全球氮循环中非常关键的一个环 节， 包括两个转化过程) 第一步是将氨氧化成亚硝酸 （ .’B @ ） ， 第二步是将亚硝酸氧化成硝酸 （ .’A @ ） ) 在整个氮素的转化过程中由氨氧化细菌 （ &’( ） 进 行的第一步氧化过程， 是生态系统中氮素循环的一［ &］ 个限速步骤， 具有重大的全球效应 ， 其研究受到8= :&? 的种类及系统发育 &’( 是一类化能自养型的微生物， 广泛存在于 土壤、 湖泊及其底泥及海洋等环境中) 在伯杰氏细菌 亚硝化单胞菌 鉴定手册第九版中将其分为 D 个属： 属 （ C&)*#(#&#’!( ） 、 亚硝化螺菌属 （ C&)*#(#(8&*! ） 、 亚 硝化叶菌属 （ C&)*#(#0#4/( ） 、 亚硝化弧菌属 （ C&)*#(#5 &&4*&#） 和亚硝化球菌属 （ C&)*#(#.#../(） ) 基于 &*+ ,-.& （ ,/.&） 基因序列同源性的系统 发育分析表明， 所有的氨氧化细菌 （ 亚硝化细菌） 的 系统发育都比较单一， 均属于变形菌纲 （ D*#)1#4!.)15 *&! ） 的 ! 和 & 亚纲 （ 图 &） ) 其中属于 ! 亚纲的亚硝化 细菌又可以分为两个类群： 亚硝化单胞菌群 （ C&)*#5广泛的关注) 然而， 由于 &’( 极难培养， 采用传统的 方法很难对其进行深入的研究) 近年来随着分子生 态学的发展， 该领域取得了突破性的进展， 本文就相 关研究成果进行了简要的概括和总结)（ B##*&&&#&B&A ） ) !国家高技术研究发展计划资助项目 !!通讯作者) 12?;&&：F&TG;EY R;G) :OG) RE B##Z2#Z2#D 收稿， B##C2#A2&$ 接受)=7C5应Z 用Z 生Z 态Z 学Z 报Z Z Z Z Z Z ZZ Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z Z =D 卷!&#&$%!） 和亚硝化螺菌群 （ !&#$%&%&’&$( ） & 目前已发 现的土壤和淡水中的 ’() 均属于这两个类群& 进一 步的分子类型分析表明 !*+,&-.&/%0-.,1% 亚纲至少可［ 5］ 以分为 2 个 034!-., & 其中亚硝化单胞菌群包括：［ ;］ -%3.!） & 经过科研工作者的大量努力， 目前已经得到了 ; 个属共有 2 个种的厌氧氨氧化菌纯培养物，［ A］ 、 @%$&1* 包括 @%$&1&%-4!“ 7$%0(8&( (*())%9&8(*&”&%-4!“ 7$%0(8&( :,13&8(” 、 @%$&1&%-4!“ ;,+*+*&( &#,##2［ B］ ［ 2］ 3($#&+*&&& ” 、@%$&1&%-4! “ &0(1&*8,( &%$%=&*&& ” 、!&#$%&%)%*(& +,$%’(+( - +,#$%’.( 、 !/ 0%)),*&&、 !/ %1&2［ 7］ 3%#$%’.(、 !6 )($&*( 和 !/ 0$4%#%1+$(*& / 亚硝化螺@%$&1&%-4!“ &0(1&*8,( 5$%8(+ ” 、 @%$&1&%-4!“ &0(1&*82［ C］ ,( &(3*+$ ” 和 @%$&1&%-4!“ ?*())%9%31%5,& ’$%’&2 ［ D］ ［ =E ］ %*&0,&” & 另外， 徐昕荣等 也分离到一株与目前菌群包括亚硝化螺菌属 （ !&#$%&%&’&$( ） 、 亚硝化叶菌 属 （ !&#$%&%1%5,&） 、 亚硝化弧菌属 （ !&#$%&%6&5$&% ） ， 从进 化距离看这 7 个属应该属于同一个属/ 亚硝化球菌 属 （ !&#$%&%0%00,&） 属于变形菌纲的 ! 亚纲， 目前只在 海洋中了发现属于该属的两个种： !&#$%&%0%00,& %0+(2 *,& 和 !/ .(1%’.&1,&/ 另外， 近几年有关厌氧氨氧化的报道逐渐增多， 该过程是由一些厌氧或兼厌氧微生物在厌氧条件下 以 8(5 为电子受体， 以 8:; 为电子供体， 将 8:;9 9 & &报道的所有厌养氨氧化微生物同源性较低的厌氧氨 氧化细菌 ’5 ， 但其分类地位仍未确定& !& 对 #$% 进行定性定量分析的分子生态学方法 由于 ’() 生长非常缓慢， 使得对其分离纯化相 当困难， 从而影响了对这类微生物研究的深入， 但这 类微生物的重要性及其生态作用是不言而喻的& 随 着分子生物学技术的发展、 进步， 基于 F8’ 指纹技 术的分子生物学研究手段， 例如变性梯度凝胶电泳 （ &.$%-4,1$G G,%&1.$- G.3 .3.0-,&HI&,.!1!，FJJK ） 、 温 度梯度凝胶电泳 （ -.#H.,%-4,. G,%&1.$- G.3 .3.0-,&HI&* ,.!1!，LJJK ） 、 末端标记限制性片段长度多态性分 析 （ -.,#1$%3 ,.!-,10-1&$ M,%G#.$- 3.$G-I H&3?#&,HI1!#， L*NOP+） 、 单链构象多态性分析 （ !1$G3. !-,%$& 0&$M&,* #%-1&$ H&3?#&,HI1!# ， QQ@+ ） 、 构 建 环 境 = B Q ,F8’和 8(5 转变为氮气的生化过程& 因此， 该反应对于 无机含氨氮废水或有机电子供体不足的废水的脱氮 具有重大意义， 而且与传统的硝化反硝化工艺相比 可以节省大量的供氧能耗& 然而这些微生物生长极 其缓慢， 最短的倍增时间也需 == &， 所需生理条件也 比较特殊， 最初很难分离到其纯培养物& 但是通过分 子生物学手段证实了这类微生物的存在， 并确定了 它们的系统发育地位属于浮霉状菌目 （ +3%$0-&#?0.*图 && 依据 =BQ ,N8’ 基因序列构建的氨氧化细菌的系统发育 ’()* && Q?!-.#%-10 .R&34-1&$ &M %##&$1% &S1&1T1$G /%0-.,1% /%!.& &$ -I. !.U4.$0. &M -I.1, =BQ ,N8’&=BQ ,N8’ 序列来自 J.$/%$V， 序列号由上至下依次为： ’)E2EDC7 、 ’O525;=7 、’O525;=; 、 ’O525;=C 、 ’O5C25D2 、 ’W5DC252 、 ’W5DC275 、 ’W5DC27B 、 W5DC27C 、 ’W5DC2;B 、 ’W5DC2;C 、 ’WB5=E52 、 ’XB7=52E 、 ’XCABE2D 、 ’XCAB72B 、 8LP=BQN 和 8LQ=BNN8’’ LI. !.U4.$0.! &M =BQ ,N8’ Y.,. M,&# J.$* /%$V，%$& %00.!!1&$ $4#/.,! M,&# 4H -& &&Y$ Y.,. ’)E2EDC7 ，’O525;=7 ，’O525;=; ，’O525;=C ，’O5C25D2 ，’W5DC252 ，’W5DC275 ，’W5DC27B ， W5DC27C ，’W5DC2;B ，’W5DC2;C ，’WB5=E52 ，’XB7=52E ，’XCABE2D ，’XCAB72B ，8LP=BQN %$& 8LQ=BNN8’’，,.!H.0-1R.3?&C 期Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 董莲华等： 氨氧化细菌的分子生态学研究进展Y Y Y Y Y Y Y!EKE基因克隆文库等逐步被引入到环境微生物分子生态 学研究中， 并将环境微生物领域的研究带入一个革［ !! & !# ］ $ 命性的新时代列密切相关， 所以当某一双链 0B% 序列迁移到变性 凝胶的一定位置并达到其解链温度时， 即开始部分 解链， 部分解链的 0B% 分子的迁移速度随解链程度 的增大而减小， 从而使不同序列的 0B% 片段滞留于 凝胶的不同位置， 结束电泳时， 形成相互分开的带 谱$ 理论上认为， 只要选择的电泳条件如变性剂梯 度、 电泳时间、 电压等足够精细， 则仅有一个碱基差 异的 0B% 片段都可以被分开， 从而能比较准确的反 映 %&’ 的种群组成$ 目前多数研究均采用巢式 ()* 法扩增 !&#$ 基因， 一般先采用没有 1) 夹子的引物 对 （ !&#$-#* + !&#$-!. 或 者 !&#$-G* + !&#$-#. ） 进 行扩增， 然后将 ()* 产物作为模板， 再用含有 1) 夹［ !Q ］ 子的引物对 （ !&#$-#* + !&#$-!.-1) ） 进行扩增 $!& #$ 定性分析 %&’ 的方法 目前采用较多的是应用 ()* + ,-*./( 和 0112 技术对 %&’ 群落结构进行定性分析$ ,-*./( 技术 原理为首先根据比较基因组学的研究结果选取一段 具有 系 统 进 化 标 记 特 征 （ ;&= &?@A9@ ） 的 0B% 序列作为目的分析序列$ 目前， 对 %&’ 分析时 所选取的分子标记基因一般是 !CD @0B% （ @*B% ） 或 !&#$， !&#$ 是编码氨单加氧酶的基因$ 氨单加氧酶 是 %&’ 所 特 有 的 一 种 胞 内 酶， 由 !&#$、 !&#% 和 !&#& E 个亚基组成， 其中 !&#$ 的基因产物包含该［ !E ］ 酶的活性位点， 可以催化铵使其氧化成羟胺 ， 为对 %&’ 的 !CD @0B% 基因进行分析时， 也采用巢式 ()* 法先用引物对 !-%H&L + !-%H&@ 进行扩增， 然后 将 ()* 产物稀释后作模板， 用引物对 ),&!KIL-1) +［ !K ］ ),&CGF@ 进行 ()* 扩增 $ 采用 0112 分析 %&’%&’ 生长提供能量$ 因此， 通过对编码氨氧化过程 中直接涉及到蛋白酶 （ 氨单加氧酶） 的 !&#$ 基因的 定性分析， 可以反映出环境中 %&’ 的种类、 数量和 活性， 而且由于 !&#$ 基因序列差异程度预计超过 !CD @*B% 基因序列， 因此对 %&’ 群体遗传差异的 分辨力更高$ 确定了目标序列后， 根据序列的保守区设计引 物， 对其中的一条引物进行荧光标记， 目前也有将两 条引物分别采用不同的荧光进行标记的［ !F ］群落结构的优点是可以同时分析多个样品， 但也存［ !I ］ 在一些缺点， 如 R?66?95N 等 发现 0112 法并不能 ［ #T ］ 对样品中所有的 0B% 片段进行分离； HO5S9@ 等指出， 0112 法 只 能 对 微 生 物 群 落 中 数 量 上 大 于 !U 的优势种群进行分析； 此外， 不同的 0112 实验 条件很可能导致不同的带型谱图$ 这无疑会对序列 信息的探针设计和系统发育分析都产生一定的影 响$ 每种方法都各自有其优缺点， 在实际研究中要 想得到准确的定性信息还需要将两种甚至两种以上 的方法结合起来互相印证$ !& !$ 定量分析 %&’ 的方法 为了能进一步深入研究 %&’ 的生态意义， 从环 境中获得 %&’ 群落的数量信息也是至关重要的$ 过 去， 普遍采用传统的依赖于可培养的方法对环境样［ #! & ## ］ 品中 的 %&’ 进 行 定 量 ， 比如最大或然数法 ［ #E & #F ］ （ &7N; 3@7J?J69 :O&J9@，H(B ） ， 然 而， 这种方$ 分析!&#$ 基因时 一 般 采 用 巢 式 ()*： 先 用 引 物 !&#$#. + !&#$-G* 扩增， 然后将第一轮 ()* 产物适当稀 释后 作 为 模 版， 用 荧 光 标 记 的 正 向 引 物 !&#$-!..%H 以及反向引物 !&#$-#* 进行扩增得到末端标 记的 FI!J3 大小的片断［ !G ］； 分析 %&’ 的 !CD @0B% $ 进行 ()* 反应后， 产基因时一般用引物 ),&!KIL + ),&CGF@ 进行扩增得 到 FCGJ3 大小的基因片断［ !C ］物用合适的限制内切酶 （ 至少要采用 E 种内切酶） 进行消化、 电泳分析， 再根据标记片断的大小以及荧 光信号强弱与 &:;9@:9; （ 4;;3： + + @M3$ =&9$ &NO$ 9MO + ） 中 的 核 糖 体 数 据 库（ @&J7N7&?6 M?;?J?N9 3@7P9=;， *0(） 的数据进行比较分析， 可以来确定其系统分类 地位， 分析群落的结构及组成多样性$ 随着核酸测序 技术的发展， 数据库中核酸序列的不断丰富， 用分子 手段进行微生物群落结构分析已成为不可缺少的手 段， 而且必将得到更加广泛的应用$ 0112 技 术 原 理 是 根 据 0B% 序 列 的 不 同， 即 %、 ,、 )、 1 四种碱基的组成和排列不同， 使得不同序 列的双链 0B% 分子具有不同的解链温度$ 当双链 0B% 分子在含有变性剂 （ 尿素和甲酰胺） 的聚丙烯 胺凝胶中进行电泳的， 因其解链速度和程度与其序法非常耗时， 而且由于该方法依赖于纯培养， 而环境 所以经常会 样品中绝大部分 %&’ 都是不可培养的，［ #G & #C ］ 过低地估计样品中 %&’ 的数量 $ 随着分子生物学的发展， 已经形成了一些不依赖于纯培养的分 子手段对环境中的 %&’ 进行定量分析， 例如 H(B［ #Q & #K ］ ()* 、 荧光原位杂交 （ L6O7@9N=9:=9 &: N&;O 45［ #I ］ J@&M&S?;&7: ，.VDW） 、 竞争性单克隆抗体酶联免疫检测 （ 9:S5&9-6&:A9M &&&O:7N7@J9:; ?NN?5 ON&:8 &7:7=67:?6 ()*）［ ET］ ?:;&J7M&9N ） 、 竞 争 ()* （ =7&39;&;&X9 ［ E# & EE］ 和实时定量 ()* （ @9?6-;&&9 ()*） 等$ ［ !E， E!］+796应W 用W 生W 态W 学W 报W W W W W W WW W W W W W W W W W W W +1 卷!&#$ 是根据已知微生物不同分类级别上种群 特异的 %&’ 序列， 利用荧光标记的特异寡聚核苷酸 检 片段作为探针， 与环境基因组中 %&’ 分子杂交， 测该特异微生物种群的存在与丰度( 目前研究 ’)* 的 +,# -.&’ 基因所用的探针普遍有： 针对变形菌 ! 亚纲的 &/0+12 和 &/0+334 ， 针对亚硝化螺菌群的 &/5667 ， 针对亚硝化单胞菌群的 &/8+4, 、 &803+9 和 &8!等［ 76 ］类群时， 尤其是该样品中有可能存在一些新的 ’)* 类群， 或 者 开 发 一 些 新 的 ’)* 基 因 资 源 时， 选择 #L*. H-::B 法会更为合适， 这样还可以扩充现有的 ’)* 基因序列的数据库( 如果能够针对环境中所有 ’)* 的序列开发出更多地探针从而拓宽 ?@A8@B 探 针法的 应 用， 具 有 高 灵 敏 度 的 该 方 法 应 比 #L*. H-::B 法具有更广的应用前景( 因此， 有必要研究开 发出覆盖环境或土壤样品中所有 ’)* 类群的探针， 但具体应用时要根据实验样品和目的综合考虑选用 何种方法( !& 生态因子对 #$% 群落结构和功能的影响 由于 ’)* 生理特征上的局限， 比如生长缓慢， 对环境因子敏感等使得氨氧化步骤成为整个氮素循 环过程中的限速步骤( 因此， 为了更好地理解生态环 进而保持生态系统 境与该系统中 ’)* 之间的关系， 的稳定性， 研究生态因子对 ’)* 的影响已经受到越 来越多的关注( 目前多数研究集中在一些生态因子 对硝化势及 ’)* 群落结构和数量的影响， 例如铵浓［ 71 M 6+ ］ ［ 63 ］ ［ 67 M 66 ］ 度 、 温度 、盐度 、 施 肥、 废 水、 废料处 ［ 64 M 6, ］ ［ 6& ］ ［ 69 ］ ［ 61 ］ ［ +7 ， 42 ］ 理 、 氧 、 光 、 硫 和重金属污染 等(( 该方法的特点是可以进行样品的原位［ 74 ］杂交， 对环境中特定微生物种群进行鉴定、 种群数量 分析及特异微生物的跟踪检测 ， 但是该方法既耗 资费时， 又很难用于土壤中 ’)* 的分析， 而且要求 所检 测 的 须 是 活 细 胞( 针 对 土 壤 ’)* ， $://:;/0:［ 7, ］ 等 采用密度梯度离心法进行分离， 通过在生物膜上培养形成菌落， 然后结合 !&#$ 染色、 计数( 但是 该方法不可能分离到土壤中所有的 ’)* ， 而且并不 是所有的 ’)* 细胞都可以在实验室条件下培养形 成单菌落( 竞争 &=. 要求在 &=. 反应中加入由突变克隆 产生的带有内切位点的竞争序列作为内标， 反应完 后用内切酶进行消化， 再通过电泳或高效液相色谱 将内标与目标序列分开， 通过内标的荧光强度对目 标序列进行定量( 由于所用引物对目标序列和竞争 序列不可能有相同的亲和性， 所以这种定量往往会 导致较大的误差( 实时定量 &=. 则克服了竞争 &=. 的缺点， 即在 &=. 反应体系中加入荧光基团， 利用 荧光信号的积累实时监测整个 &=. 进程， 最后通过［ 7& ］ 标准曲线对未知模板进行定量分析 ， 从而使定量!& ’& 土壤中的铵浓度 铵作为氨氧化细菌的间接底物， 其浓度与 ’)* 的数量和种类有直接的关系： 铵浓度的增加可以直 接导致 ’)* 数量的增加( 土壤中施用不同浓度 （ +I 4 和 &I 4 880;? N M + ） 的硫酸铵， 培养 39 O 后， 采用实 时定量 &=. 技术研究发现， ’)* 的数量可以分别增［ 77 ］ 加 1 倍和 +,I 4 倍 ( 另有研究表明， 增加铵浓度可分析更为准确( 目前对 ’)* 的定量大多借助实时定 量 &=. 技 术， 采 用 ?@A8@B 探 针 法 对 ’)* 的 +,# -.&’ C3 区或 !&#$ 的定量分析来进行的， 所用的 （ 探针 ?G&+ ） 引物分别是 =?)+91DE’ F .?+［ 73 ， 79 ］以导致 ’)* 硝化活性的增加， 但是经短期的培养 （6 P , 周） ， 土壤中不同的铵浓度并不能影响氨氧化细［ 71 ， 4+ ］ 菌的群落结构 ， 其原因可能是由于 ’)* 生长和［ 77 ］ ’+91 F !&#$E3.E?H （ 探针 ’7&& ） ( 标准曲线一般缓慢， 要想检测到其群落结构的变化需要一个较长 的培养过程 （ +, P 32 周） ( 因此硝化活性的增加是由 于铵的存在使 ’)* 在数量上的增加所导致( !& (& J$ 土壤 J$ 是影响 ’)* 群落结构的一个主要因 素， 其中包括对 ’)* 的直接影响和对土壤活动过程［ 43 ］ 的间接影响两个方面 ( J$ 直接决定土壤中氨的用 引 物（ ’+91 F !&#$E3.E?H ） 扩 增 标 准 菌 株 %I &’(#)!&! ’?== +1&+9 的 !&#$ 基因， 然后连接到 载体 JK=+9 ， 提 取 质 粒 后 用 引 物 .?3D F .?3-、 探针 ?G&3 进行荧光定量 &=.［ 77 ］( ’)* 的细胞数按照每个细胞平均含有 3I 4 个 !&#$ 拷贝数计算( 除了用 ?@A8@B 探针法还可以采用荧光染料法 （ #L*. H-::B ） ， 该方法与 ?@A8@B 探针法相比费用 较低， 因为它不用合成任何探针， 只依赖 &=. 引物 的专一性， 没有了探针的特异性作保证， 所以准确性 较低， 但也正是如此， 使得采用该方法时可能会检测 到一些采用 ?@A8@B 探针法无法检测到的 ’)* 类 群， 因此在研究不同土壤或不同环境样品中的 ’)*存在形 态， 当 J$ 降 低 时， 氨 （ &$7 ） 会转变成铵 ， 影响到 ’)* 的底物 &$7 的获得， 从而影 （ &$6 Q ） 响 ’)* 的活性和丰度甚至种类( 研究表明， 酸性土［ 47 M 46 ］ 壤中的优势种群是 %*+(#,#,)*(!E;RS: T;U/V:- 3 ， ［ 44 M 4& ］ 中性土 壤 中 以 T;U/V:- 7 为 主 ( 而 不 同 的 %*-+(#,#,)*(! #V-@RB/ 对 尿 素 吸 收 也 有 不 同 的 最 适? 期P P P P P P P P P P P P P P P 董莲华等： 氨氧化细菌的分子生态学研究进展P P P P P P P［ #$ ］ !& %1K$#［ #0 ］ 和氨氧化势 ， 施用堆肥的土壤中 &’( 数量比施 ［ /? ］ 用无机肥的土壤高两倍 % 施肥体制对土壤中微生!& !# 温度 温度可能直接或间接地影响 &’( 的群落结构， 间接的影响是温度通过对土壤中铵浓度、 !& 和土壤 湿度 等 的 影 响 来 影 响 &’( 的 群 落 结 构% &)*+,+-. 等［ /0 ］耕作 物的活性和群落结构也有明显的影响% 据报道， 措施的不同会导致 &’( 的优势种群具有特异性， 例 如： %&’(#)#)*&(!CG.M7 FG;HI7* / 在没有施过肥的土壤中 占优势， 而 %&’(#)#)*&(!CG.M7 &*5;! K 在施用铵肥的土［ 0K ， #/ ］ 壤中最多 %认为， 在保证土壤湿度、 铵浓度和 !& 相对稳定的情况下， 温度对 &’( 的直接影响表现为在中等［ /0 ］ 温度 （ 1# 2 0# 3 ） 下其硝化活性最高 ， 这与 45667在干旱和半干旱地区， 由于污水灌溉比淡水灌 溉更经济， 因此是农业上常用的灌溉措施% 但是污水［ /1 ］ 灌溉可能会导致公共健康和环境方面的负效应 % ［ 1］ ’)76 等 应用 @ABCD44E 技术研究污水灌溉对土等［ #8 ］报道的 90 ’ 释放率在低温时高而中温时低的结论相反， 其原因在于铵浓度的不同： 当土壤中铵浓 度较低时， 由于中温时消耗铵的速度比低温时快， 使 得铵浓度成为中温环境下 90 ’ 释放的一个限制性 因素% :;&6=7*& 等［ /? ］壤中 &’( 群落的结构影响， 结果发现污水灌溉改变 了土壤中 &’( 的优势种群， 灌溉后期， 污水灌溉的 土壤中 %&’(#)#&#,!)CG.M7 和 %&’(#)#)*&(!CG.M7 均存在， 而非污水灌溉的土壤中优势菌群只有 %&’(#)#)*&(!C G.M7， 即污水灌溉系统中， 土壤中 &’( 的多样性高% &’( 和硝化势对土壤有机污染物很敏感， 比如油烃［ ?K ］ ［ ?/ L ?# ］ 类 和多环芳烃 等% 研究表明， 被石油污染的应用 @ABCD44E 研究发现， 随着温度的升高， !&#$ 的指纹多样性与培养初期有所 不同% 一些条带随着温度的增加而增加， 另一些则减 少甚至消失% 但是大部分的变化都发生在 %&’(#)#)*&+ (! 的各个不同的 FG;HI7* 之间% 然而， 随着由夏季到 冬季温度的逐步降低， 硝化势并没有明显降低， 推测 土壤中的硝化细菌群落能够适应温度的变化并且在 低温下仍能够保持较高活性， 即微生物对气候的代［ ?J ］ 谢调节不受渐变的温度的影响 %农田土壤中 &’( 数量随着季节的变化不大， 在每克 干土 / N 1J # 2 8 N 1J # 个细胞， 优势菌是 %&’(#)#)*&(!C［ ?? ］ G.M7 FG;HI7* 0 和 K % 这表明一些 &’( 对石油和多!& $# 盐度 多数研究报道盐度对于湖泊底泥中 &’( 的群 落结构和硝化势有显著的影响， 但其具体的机理还 不清楚% 推测其可能原因为： 盐度对于底泥中铵的吸 附有很重要的作用， 随着盐度的增加， 游离铵也会增 加， 影响 &’( 的生理过程， 从而影响 &’( 的群落组 成和硝化活性% 高盐度环境下， &’( 的多样性明显减少， 但是 其数量明显增加［ /K L // ］环芳烃污染物形成了抗性% 多数研究均发现废水处［ ?O L ?$ ］ 理系统中的优势菌是亚硝化单胞菌 % 但是最新研究表明， 垃圾、 污水处理系统中的优势菌除了亚硝 化单胞 菌 之 外 还 有 亚 硝 化 螺 菌 （ %&’(#)#)*&(! -&,.!+［ 1/ ， /? ］ /.)） ， 从而拓宽了我们对污水处理系统中 &’(的多样性的认识% 由于 &’( 对诸多生态因子敏感， 使得对 &’( 的深入研究面临较多困难， 但同时我们也可从中得 到启发： 在实验室深入研究某一因子对其影响时必 须有一个全面的实验设计， 例如控制其他因子的变 化； 在自然环境下研究 &’( 则要全面考察该生态系 统中的所有生态因子， 结合单一因子的影响进而深 入分析其综合效应% $# 总结与展望 氨氧化细菌与土壤中氮素的转化及其利用有直 接关系， 与生态因子的改变密切相关， 研究氨氧化细 菌的生态结构和生态机制， 可以有效地保护土壤肥 力， 维持生态系统的稳定， 对环境变化进行预示预 警% 虽然目前还无法通过传统微生物学的方法对其 进行深入研究， 但是分子生态学方法的引入使得该 领域的研究已经进入了一个崭新的阶段： 由对好氧 氨氧化的研究扩展到对厌氧氨氧化的研究， 以及一% 一般认为， &’( 的丰度 （数量） 大小能够粗略地反映硝化势的高低， 即硝化势 和 &’( 数量呈正相关% 但研究发现， 高盐度环境下 的硝化势比中、 低盐度环境下的硝化势低， 其原因可 能是： 1） 高盐度抑制了 &’( 的硝化活性； 0） 目前所 用的方法不能完全将中、 低盐度环境下所有具有硝 化活性的 &’( 检测到； K） 高盐度位点有较低的细胞 C氨氧化率% !& %# 施肥、 灌溉、 有机污染物 基于 D9& 技术的分子方法揭示了土壤生态系 统中的极其丰富原核生物多样性， 而保护性耕作土 壤中的微生物多样性直接关系到生态系统的稳定% 因此耕作体系和施肥对土壤中微生物的影响已经受 到很多关注% 有机肥， 如家畜粪便、 堆肥、 活性污泥都 能够提高微生物的活性［ ?1 L ?0 ］， 提高 &’( 的多样性&$OE应% 用% 生% 态% 学% 报% % % % % % %% % % % % % % % % % % % &U 卷些特殊生境中新菌种的分离鉴定! 相信随着分子生 态学技术的进一步发展， 还会有大量未被发现的新 物种、 新机制不断被揭示! 因此今后仍需广大科研工 作者不懈努力的是： &） 对传统的微生物学方法进行 改善， 结合现代分子生态学方法分离鉴定出更多对 去除含氮污水有实际应用价值的氨氧化细菌! # ） 研 究污水处理系统中厌氧氨氧化细菌和好氧氨氧化细 菌之间的协作、 竞争机制， 阐明硝化过程中微生物种 群间的生态结构及调节机制， 开发出更为高效处理 含氮污水的工艺! $ ） 开展自然环境 （ 农田、 森林、 湖 泊、 海洋等） 中氨氧化细菌系统的分子生态学研究， 阐述生态结构变化与环境因素改变之间的相互关 系， 从而对环境变化进行预警!参考文献 ［&］ % &’() *，+,-’.’ /，012)3-4, *，!& #$!
(7729: (64 .33.;-4.16 16 81&&96.4= 81&&1?.4.16 -6)
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