克隆启动子 起始密码子需要考虑终止密码子吗

启动子_百度百科
和结合的DNA序列。 启动子是(gene)的一个组成部分,控制(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”,决定基因的活动。既然基因是成序列的(nucleotides),那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动,而是通过与称为转录因子(transcription factor)的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。就像一面“旗子”,指挥着酶(enzymes)(RNA polymerases) 的活动。这种酶指导着RNA合成。
启动子简介
启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”,决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides),那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动,而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”,指挥着酶(enzymes)(polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。一般分为广谱表达型启动子、、肿瘤特异性启动子等多种形式。基因的启动子部分发生改变(突变),则导致基因表达的调节障碍。这种变化常见于恶性肿瘤。
含有3类不同的RNA聚合酶,根据其对的敏感性不同,分为RNA聚合酶Ⅰ(A)、RNA聚合酶Ⅱ(B)、RNA聚合酶Ⅲ(C),如下:
酶的种类[1]
对抑制物的敏感性
RNA聚合酶Ⅰ
合成rRNA前体
RNA聚合酶Ⅱ
合成mRNA前体及大多数snRNA
低浓度敏感
RNA聚合酶Ⅲ
合成5S rRNA前体、tRNA前体及其他的核和胞质小RNA前体
高浓度敏感
[1]真核细胞还具有线粒体RNA聚合酶,存在于线粒体,能产生线粒体RNA;叶绿体RNA聚合酶,存在于叶绿体,能产生叶绿体RNA。
如RNA聚合酶Ⅱ识别Ⅱ类启动子,催化mRNA和大多数核内小RNA(snRNA)合成,它的启动子很复杂,主要包括4个部位:第一个部位为转录的起始部位其碱基大多为A;第二个部位是TATA框(TATA box),其共有序列为TATA(A/T)A(A/T),是富含AT的7个核苷酸。TATA框是类似于原核启动子的Pribnow框,位于-25;第三个部位为CAAT框(CAAT box),其共有序列为GGNCAATCT(其中N为C或T),位于-75附近;第四部分为增强子(enhancer),增加转录的速率
启动子启动子区的基本结构
启动子是一段位于5'端上游区的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物,故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是过程中首先要解决的问题。有实验表明,对许多启动子来说,RNA聚合酶与之相结合的速率至少比中的随机碰撞高100倍。
转录的起始是基因表达的关键阶段,而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用:启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力,从而影响了基因表达的水平。
为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合,就好像酶与其底物的构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较,发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序,称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下,-35区“TTGACA”,-10区“TATATT”。大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence),只有少数几个核苷酸的差别。
启动子转录单元
转录单元(transcription unit) 是一段从启动子开始至(terminator)结束的DNA序列,RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进,直到终止子为止,转录出一条RNA链。在细胞中,一个转录单元可以是一个基因,也可以是几个基因。
启动子转录起点
转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基,研究证实通常为一个。常把起点前面,即5’末端的序列称为上游(upstream),而把其后而即3’未端的序列称为下游(downstream)。在描述碱基的位置时,一般用数字表示,起点为+1,下游方向依次为+2、+3……,上游方向依次为-1、-2、-3……。
启动子启动子区
启动子区是RNA聚合酶的结合区,其结构直接关系到转录的效率。关于其结构特点,Pribnow设计了一个实验,他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后,用DNase lDNA,然后用酚抽提,沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段,约有41~44个。他先后分离了fd、T7噬菌体的A2及A3启动子、h噬σ菌体的PR启动子及大肠杆菌的UV5启动子等5段被酶保护的区域,并进行了序列分析,以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现,在被保护区内有一个由5个组成的共同序列,是RNA聚合酶的紧密结合点,称为Pribnow区(Pribnow box),这个区的中央大约位于起点上游10bp处,所以又称为-10区。
许多原核生物都含有这两个重要的启动子区:RNA同启动子结合的区域称为启动子区。将各种同RNA聚合酶全酶结合后,用DNase I水解DNA,最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段,这些片段有一个由5个核苷酸(TATAA)组成的共同序列,以其发现者的名字命名为(Pribnow box),这个框的中央位于起点上游10bp处,所以又称-10序列(-10 sequence),后来在-35 bp处又找到另一个共同序列(TTGACA)。Hogness等在中又发现了类似Pribnow框的共同序列,即位于-25~-30 bp处的TATAAAAG,也称TATA框(TATA box)。TATA框上游的称为上游(upstream promoter element,UPE)或(uptream activating sequence,UAS)。另外在-70~-78 bp处还有一段共同序列CCAAT,称为CAAT框(CAAT box)。
在真核生物基因中,Hogness等先在中发现了类似Pribrow区的Hogness区(Hogness box),这是位于转录起始点上游-25~-30 bp处的共同序列似TAAA,也称为TATA区。另外,在起始位点上游-70~-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT,这是与中-35bp区相对应的序列.称为CAAT区(CAAT box)。
启动子-10位区和-35位区
提纯被保护的片段后却发现,并不能重新结合或并不能选择正确的起始点,表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。果然,科学家不久就从的左、右启动子PL及PR和SY40启动子的-35 bp附近找到了另一段共同序列:TTGACA。经过数年的努力,分析了46个大肠杆菌启动子的序列以后.确证绝大部分启动子都存在这两段共同序列,即位于-10bp处(……T89A89T50A65A100……)的TATA区和-35 bp处(……T85T83G81A61C69A52……)的TTGACA区。现已查明,-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点,能与相互识别而具有很高的亲和力。
原核生物中-10区同-35区之间核苷酸数目的变动会影响活性的高低,一般为17±1 bp,当间距小于15 bp或大于20 bp时都会降低启动子的活性。
以下是出现的:[1]
核苷出现的概率表格
在真核基因中,有少数基因没有TATA框。没有TATA框的真核基因启动子序列中,有的富集GC,即有GC框;有的则没有GC框。GC框位于-80~-110bp处的GCCACACCC或GGGCGGG序列。
TATA框的主要作用是使转录精确地起始;CAAT框和GC框则主要是控制的频率,特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。如在TATA框同相邻的UPE之间插入核苷酸,也会影响转录使之减弱。
-10序列又称为()。在中相应的序列位于-35bp处,称为TATA盒,又称为Goldberg-Hogness box,是RNA聚合酶Ⅱ的。-10和-35这两个部位都很重要:【1】RNA聚合酶能和-35和-10序列中的和DNA主链中的磷酸基相接触;【2】离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱;【3】最重要的是,破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基,其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp,即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面,可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像,它能&感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。&
原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列(-35和-10)之一。在这种情况下,RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子,而需要有辅助蛋白质的帮助。可能是这些蛋白质因子与邻近序列的反应可以弥补启动子的这个缺陷。
在中,在上游70-80bp处有CAAT顺序,也称为CAAT盒。这一顺序也是比较保守的共同顺序:GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以识别一顺序。在对家兔β珠蛋白基因CAAT顺序的研究中发现,用人工方法诱导CAAT顺序发生突变使家兔β珠蛋白基因的转录水平降低。
启动子中的-10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序。但是附近其他DNA顺序也能影响启动子的功能。例如,在合成的起始位点的上游50到150核苷酸之间的顺序就是对启动子的完全活性所必需的。如果这一段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代(例如克隆在DNA中的rRNA基因),则的频率将降低10倍。同样,在其他情况下,远隔部位的富有AT的DNA顺序被认为能增进转录起始的频率。有时候上游顺序可以是某些能直接激活RNA聚合酶的&激活蛋白&的结合部位。但是,上游顺序往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引,后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离,因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。
启动子启动子功能变异的疾病
以下是从人类遗传学(OMIM)证实与启动子故障有关,不论是因启动子序列直接突变或是转录因子或转录共激发因子的突变。而多种癌症都没有列下是因为从产生嵌合基因:
β 鲁宾斯坦泰比
要留意的是在病原学上大部份的疾病都是异质的,而在分子层面上一种疾病往往是指多种疾病,纵然它们的病征及治疗方法一致。疾病对治疗有不同的反应,是因背后分子源头的差异,这会是的范畴。[1]
.医学百科[引用日期]
企业信用信息重组质粒上的 启动子 终止子 复制原点 抗性基因 都有什么作用_百度知道反密码子是不是有61三个终止子,那么启动子去哪了?_百度知道启动子终止子起始密码子终止密码子区别_百度知道pet载体原核表达基因的终止密码子要加吗
主要是看载体谱图和你自己需要的,一般pET系列载体有时候会为了表达的蛋白纯化方便,会在你的蛋白C端后面添加一些标签(如His Tag),这些标签后面都带有终止子.如果你觉得你不需要载体所自带的这些标签,你可以自己添加上终止子.如果你需要载体后面的一些东西的话,你可以不添加.当然,有些早期载体是没有带终止子的,需要你自己添加.对于要不要添加终止子,还是那句话,先研究具体载体的图谱结构,根据自己需要来选择添加或者不添加,如果实在看不懂载体结构,那么你就直接添加终止子上去,因为载体如果本身带有终止子的话也在你的序列后面,对你的蛋白本身并没有影响.
你的回答,我用的是pET-32(a+),他的图谱在T7启动子后有一个His tag 标签,在酶切位点后还有一个HIS tag标签,我想问我未去除终止密码子会导致只有N端有HIs tag标签,而C端没有,这样影响后面的纯化吗?
这个载体我用过,这个载体是融合表达的蛋白,his tag有两个,分别在融合蛋白的C端和你的目标蛋白的C端,你终止了你目标蛋白C端后的His tag后还有一个his tag对目标蛋白纯化是没有影响的。一个his tag就可以顺利的进行蛋白纯化。
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