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基于时间分辨和空间分辨化学发光策略的多组分免疫分析方法.pdf 48页
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--------------------------Page1------------------------------lIMMllllllllllllllIIIY2309145独创性声明学位论文题目：基王吐闽佥羞丞空闽佥趁丝堂塞羞筮坚鲍垒组佥鱼疫佥堑友洼本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：韩精签字日期：2彬年j月2)日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：韩导师签名：'匀森码祷啪，孚旧签字日期：319rfl年j月签字日期：a口l≥年g惆7Ⅵ--------------------------Page2------------------------------目录摘要…………………………………………………………………………………．IABSTRACT……………………一……………………………………………………………jjj……………．．III缩写符号对照表………………………………………………………………………．V第1章绪论……………………………………………………………………………．11．1引言……………………………………………………………………………．11．2化学发光基本理论……………………………………………………………．11．2．1化学发光反应的基本理论………………………………………………11．2．2化学发光分析法原理……………………………………………………21．3常用的化学发光反应体系……………………………………………………．．21．3．1鲁米诺类化学发光体系…………………………………………………21．3．2吖啶酯类化学发光体系…………………………………………………31．3．3过氧化草酸酯类化学发光体系…………………………………………41．3．4二氧杂环丁烷类化学发光体系…………………………………………51．4化学发光免疫分析……………………………………………………………．51．4．1化学发光免疫分析原理…………………………………………………51．4．2化学发光免疫分析的类型………………………………………………61．5多组分免疫分析法及其应用…………………………………………………．71．5．1多探针标记模式…………………………………………………………71．5．2空间分辨模式…………………………………………………………．101．6本文研究思路及创新点………………………………………………………12参考文献：………………………………………………………………………．．14第2章基于时间分辨化学发光策略的多组分免疫分析……………………………192．1引言……………………………………………………………………………192．2实验部分………………………………………………………………………202．2．1仪器与试剂……………………………………………………………．．202．2．2化学发光免疫分析法检测CLE和RAC……………………………一20--------------------------Page3------------------------------2．3结果与讨论……………………………………………………………………2l2．3．1基于时间分辨策略的多组分免疫分析………………………………．212．3．2不同化学反应的发光动力学特征……………………………………．222．3．3免疫反应的条件优化…………………………………………………．232．3．4化学发光检测条件优化………………………………………………．242．3．5交叉干扰性考察………………………………………………………．252．3．6交叉反应性考察………………………………………………………．262．3．7对CLE和RAC的化学发光检测……………………………………．282．3．8实际样品检测…………………………………………………………．282．4结论……………………………………………………………………………………………………．29参考文献…………………………………………………………………………．．30第3章基于空间分辨化学发光策略的多组分免疫层析法…………
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基于化学发光动力学分辨策略的多组分免疫研究方法检测免疫球蛋白.pdf 41页
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--------------------------Page1------------------------------DissertationforMasterDegreeofSouthwestUniversitydetectionofMultiplexedimmunoassayareactionkinetics—resolvedbystrategyWenwenCandidate：WangAdvisor：Prof．FuZhifengDiscipline：PharmaceuticalAnalysisMajor：BiopharmaceuticalAnalysisChongqing，China一一一J2015May万方数据--------------------------Page2------------------------------独创性声明学位论文题目：基王位堂筮左边左堂金羞筮喳鲍垒玺金鱼疫佥堑友洼捡型鱼疫韭蛋鱼本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：之／缆签字日期：≯fj年6月名日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：形久碧一导师签名：／f‘＼勿形1学位论文作者张≥’嫂导师张储参钎J。，，J签字日期：为fy年匕月严日签字日期：了口fy年6月f戈日万方数据--------------------------Page3------------------------------西南大学硕士学位论文目录目录摘要…………………………………………………………………………………．IAbstract．．…．．．．．．．．．………．…．．．．．．．．…．．…．…．．……．．……．．…．……．．．．．．．．．．…．．…．…．．．…．．．．…．．．．．…．…I】[主要的缩略语对照表………………………………………………………………一IV第1章绪论…………………………………………………………………………．．11．1引言………………………………………………………………………………………………………．11．2化学发光基本理论……………………………………………………………．．11．2．1化学发光反应的基本原理………………………………………………l1．2．2化学发光分析原理………………………………………………………21．2．3常用的化学发光体系……………………………………………………31．3化学发光免疫分析……………………………………………………………．．81．3．1免疫分析的原理…………………………………………………………．81．3．2化学发光免疫分析方法的建立…………………………………………．81．3．3化学发光免疫分析的类型………………………………………………91．3．4常用检测方法……………………………………………………………lo1．4多组分免疫分析法及其应用…………………………………………………111．5本文研究思路及创新点………………………………………………………14参考文献……………………………………………………………………………15第2章基于化学发光动力学分辨策略的多组分免疫分析方法检测免疫球蛋白222．1引言……………………………………………………………………………222．2实验部分………………………………………………………………………232．2．1试剂与仪器……………………………………………………………．．232．2．2化学发光免疫分析步骤………………………………………………一242．3结果与讨论……………………………………………………………………242．3．1基于化学发光动力学分辨化学发光策略的多组分免疫分析………一242．3．2化学发光多组分检测的条件优化……………………………………．．252．3．3特异性的评价…………………………………………………………一272．3．4对于MIgG和MIgM的化学发光检测………………………………．．27万方数据--------------------------Page4------------------------------西南大学硕士学位论文目录2．3
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MHC-肽四聚体的构建及技术改造的分析.pdf 74页
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--------------------------Page1------------------------------摘要MHE一肽四聚体的构建及其技术改造研究生物化学与分子生物学专业硕士研究生李绍飞指导教师：谢和芳教授杨怀义副研究员摘要背景和目的T细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic的作用，它通过识别靶细胞表面的MHC．肽复合物而对靶细胞进行杀伤。检测和监测抗原特异性CTL，是了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一，也是评价特异性免疫疗法的基础。抗原特异性CTL的体外检测方法有多种，但MHC．肽四聚体技术是目前唯一能够直接对其定量检测的方法。然而，MHC一肽四聚体构建过程复杂，价格昂贵，这在一定程度上限制其大规模应用，这就要求我们一方面要构建针对不同抗原表位的MHC一肽四聚体，另一方面也要求我们开展MHC．肽四聚体技术改造研究，简化MHC一肽四聚体制备过程，提高其实用性和可操作性，开发具有自主知识产权的产品，以适合和满足我国医学飞速发展的需要。另外，慢性HBV感染是一个全球性的重大健康问题。HBV有多种抗原成分，而每种抗原成分包含有多个抗原表位，构建HBV不同抗原表位的MHC一肽四聚体很有必要。体，一方面可以为检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcA表位特异性CTL打下基础，另一方面摸索和掌握MHC．肽四聚体构建技术，可以为构建其它抗原表位的MHC．肽四聚体或为建立抗原特异性CTL检测的技术平台打下基础：其次将SCT改造为HBcAgl07．115表位的MHC．肽四聚体，以期为MHC．肽四聚体技术改造提供新思路。试验方法(1)HBcAgl07-115表位的MHC一肽四聚体的构建进行培养和用IPTG诱导，表达出包涵体蛋白；提取两种包涵体蛋白，经SDS—PAGE电泳分抗原肽共同稀释复性，以组装成MHC．肽复合物单体：用超滤器浓缩复性产物；用凝胶过滤层析技术纯化MHC．肽复合物单体，经SDS．PAGE电泳分析表明获得了目的蛋白：MHC．肽复合物单体在BirA酶的作用下生物素化：用超滤管离心去除生物素化产物中游离的生物素；用直接ELISA法定性鉴定生物素化产物；用BCA法测定生物素化蛋白浓度，并将生物素化蛋白和PE标记的链亲和素以4：1的量混合作用，从而得到MHC．肽四聚体。--------------------------Page2------------------------------两南大学硕十学位论文(2)HBcAgl07．115表位的MHC．肽四聚体活性的检测取免疫的转基因鼠两只，其中一只为对照；取出脾脏，分离出脾脏细胞并调节浓度；先细胞染色，使用流式细胞术分析CD3+、CD8+和MHC．肽四聚体+的细胞群频率。(3)SCT改造为HBcAgl07．115表位的MHC．肽四聚体蛋白酶切位点、SCT和BirA酶底物的基因序列；获得的基因序列用BamHI和X'hoI酶后，与同样酶切过的载体pET32c(+)连接；连接产物用电转化法转化大肠杆菌JMl09中；先进行抗性筛选，对获得的克隆再进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定，获得重组载体：用化学法将重组载体电泳分析，表明蛋白以包涵体存在，大小与预期一致；提取包涵体，进行稀释复性；用超滤合表达的标签；酶切产物经SDS—PAGE电泳分析表明大部分蛋白被切开；酶切产物先后经Ni离子亲和层析和GST亲和层析纯化，经SDS．PAGE电泳分析表明获得了纯的目的蛋白；对目的蛋白再进行和MHC一肽四聚体构建的基本方法一样的生物素化等过程，最后得到MHC．肽四聚体。(4)对比分析构建MHC一肽四聚体的两种方法，得出基于SCT构建MHC．肽四聚体的优越性。结果和结论107．115表位的MHC．肽四聚体，可以将其用于检测和监测乙(1)构建了有活性的HBcAg15表位特异性CTL。型肝炎患者或实验动物@HBcAgl07—1(2)构建了重组载体pSBI，为今后进一步研究SCT．BSP可溶性表达打下了基础。(3)将SCT．BSP构建成了MHC．肽四聚体，其方法相比构建MHC．肽四聚体的基本方法具有方便、快捷、节约成本和适合规模化生产等优势，为MHC一肽四聚体技术改造提供了新思路。关键词：细胞毒-性T淋巴细胞主要组织相容。陛复合体乙型肝炎病毒MHC．肽四聚体Il--------------------------Page3------------------------------onConstructionofMdeStudyTetrameranditstechnicalnMasterCandidate：LiShaofeiXieSupervisor：ProfiHefangAssoc．Prof．YangHuaiyiandMolecularDiscipline：Biochemistr
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2型糖尿病合并急性脑梗死患者血糖波动对神经功能缺损及短期预后的影响
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炎症浸润细胞及基质金属蛋白酶参光老化发生机制研究.pdf 67页
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--------------------------Page1------------------------------北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文MMP-3、姗P一9在曝光和非曝光部位均表达，曝光部位皮肤组织中删P-I、脚卜3、发展中均起作用，但作用机制可能不同。第三章外周血单一核细胞活化及对成纤维细胞的影响目的(conditionedmedia，CM)对培养的皮肤成纤维细胞增殖活性、分泌MMPs的影响。方法抽取、分离外周血单一核细胞，用活化剂PHA及CD3、CD28抗体活化细胞，水平，RT-PCR法检测细胞姗P一1、MMP一3mRNA表达水平，采用单因素方差分析等方法进行统计学处理。结果不同处理组PBMC的增殖能力、活化后上清液中IL一6和MMP-3浓度比较有显著性差异(尺O．05)，删P—lmRNA表达有显著性差异(尺O．01)，以PHA刺激组最强，不加活化剂组最弱，删P一3mRNA无表达，活化后上清液中未检浓度随着CM刺激浓度的增加而增加，但均低于基础CM，上清液中未检测到删P—l、MMP-9蛋白，不同处理组成纤维细胞的增殖能力及删P—l、删P一3mRNA表达无显著性差异(P&O．05)。结论PBMC活化后可分泌l删P-3及表达删P一1mRNA，PBMC活化自身分泌删Ps参与光老化。4--------------------------Page2------------------------------北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文AbstractisdescribedasaskinduetoPhotoagingprematureagingrepeatedtocharacterizedexcessiveexposureultraviolet，histologicallybyofelastoticmaterialanddepositiondegenerativebasophilicdegenerationofofIandIlIcollagen，andaccompaniedbydegradationtypesprocollagen．Thisistoresultfrombreakdownofincreasedimpairmentthoughtcollagenbymatrixwhichinvolvemetalloproteinases(MMPs)expression，maymultiplematerialssuchasandthemechanismsandcells，cytokinesmetabolites，butofarenotwellunderstood．PreviouspathogenesisphotoagingevidencehasindicatedthattheultravioletirradiationMMPspromotesproductionbyactivationofcellsurfaceonandmultiplereceptorskeratinocytesfibroblastsanddownstreamalteredtransductionsignalwhichand一9arethemostrecenttheeffectMMP一1，一3significant．Inyearsofcellsinthehasbeeninfiltratingphotoagingprocessincreaseininfiltrateinskin．Inhistologicalinflarmatorysun—exposedordertofurtherwhetherandhowthecelIsinvolvedexploreinflammatoryintheofnumberofinficellsandprocessphotoaging，theltratingexpressionof},IMPsinandskinsun—unexposedwouldbethesun—exposedcompared，andinductionofMMPsandtheeffectonthehumanfibroblastsafteractivationofbloodmononuclearbeperipheralcell(PBMC)wouldstudied，whichafundamentalbasisforandtreatmentofprovidingoccurrence，preventionconsistsofthreephotoaging．Thepaperchapters．ImanifestationofcellsinChapterHistologicalinfiltratingandskinsun—‘exposedsun—‘unex
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