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pRT20-T载体试剂盒使用说明书使用,载体,T,T 载体,说明书,试剂盒,T载体,载体试剂盒,t载体,连t载体
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pRT20-T载体试剂盒使用说明书
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【求助】co-ip负对照的问题
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这个帖子发布于3年零143天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做co-ip，用A-myc钓B-GFP，实验组是在条件1时A和B有结合，条件2时A和B无结合或结合很弱，但负对照（只有B-GFP）信号总是比条件2要强，有时甚至和条件1一样强。请问这可能是什么原因造成的？负对照该怎么做？
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utopwang 最近在做co-ip，用A-myc钓B-GFP，实验组是在条件1时A和B有结合，条件2时A和B无结合或结合很弱，但负对照（只有B-GFP）信号总是比条件2要强，有时甚至和条件1一样强。请问这可能是什么原因造成的？负对照该怎么做？co-ip一定要有一个阴性对照，就是你说的负对照一般是单转其中的一个蛋白，单转A则用B的tag做IP，单转B则用A的tag做IP只有在阴性对照存在并且没有结合的条件下讨论你的条件对AB结合的影响才有意义没有这个对照，那即使做出了条带也不能说明任何问题。
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reyesa co-ip一定要有一个阴性对照，就是你说的负对照一般是单转其中的一个蛋白，单转A则用B的tag做IP，单转B则用A的tag做IP只有在阴性对照存在并且没有结合的条件下讨论你的条件对AB结合的影响才有意义没有这个对照，那即使做出了条带也不能说明任何问题。那请问阴性对照总是有信号可能是什么原因造成的？有这方面经验吗？谢谢
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utopwang 那请问阴性对照总是有信号可能是什么原因造成的？有这方面经验吗？谢谢这个问题的可能原因有很多。。。。最先考虑的应该是你的细胞裂解液的配方（比如去污剂的含量）和你洗beads的次数。其次你细胞的状态也会有影响
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应该是抗体的非特异性结合吧。用的什么抗体？ 我现在也在用myc GFP 做co-ip。 我感觉只表达但一蛋白做对照应该还是不很严格，应该把你其中一个目的蛋白另一个不结合的融合蛋白共表达，然后做co-ip阴性对照。
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reyesa 这个问题的可能原因有很多。。。。最先考虑的应该是你的细胞裂解液的配方（比如去污剂的含量）和你洗beads的次数。其次你细胞的状态也会有影响谢谢！
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michaelwuqingyu 应该是抗体的非特异性结合吧。用的什么抗体？ 我现在也在用myc GFP 做co-ip。 我感觉只表达但一蛋白做对照应该还是不很严格，应该把你其中一个目的蛋白另一个不结合的融合蛋白共表达，然后做co-ip阴性对照。意思是把做bait的蛋白换成其他的蛋白吗？我现在转的是空myc载体，抗体用的是rabbit myc，抗体可以做改变吗？
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utopwang 意思是把做bait的蛋白换成其他的蛋白吗？我现在转的是空myc载体，抗体用的是rabbit myc，抗体可以做改变吗？是 而且应该是亚细胞定位相同的蛋白
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同样求助,CoIP阴性对照总是有,只是相对于阳性实验组弱一点,是怎么回事?怎么消除这种非特异结合?做CoIP 用多少蛋白合适?用盐洗beads管不管用?
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【求助】T-A 克隆：连接转化出问题
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这个帖子发布于11年零88天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
感受态一经验证没有问题第一次平板上菌落很少，就几个蓝斑和1-2个白班。第二次将PCR产物纯化（95%酒精沉淀）后重新连接，做了个正对照（感受态+空载体），负对照（只有感受态细胞）过夜培养后，正对照出现菌落，可是实验板（感受态+载体+DNA）没出现菌落，继续培养5-6小时后，实验板出现2个白色菌落。请教各位这是为什么？ 用的是Promega T-A 克隆试剂盒。连接反应体系是：
2*Rapid Ligation Buffer：5 ul
pGEM-T Easy Vector ：0.5ul
PCR product：
2 ul（ PCR 产物纯化后的量：43.55 ug/ul）
T4 DNA Ligase
Deionized water
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我也是同样的问题,真不好搞呀!
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会不会是T载体的量太少了，我一般用0.7ul
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PCR产物片段有多长？摩尔比是多少？短的话很容易连进去的长度如果大于3kb，就有点难度了我连3kb的产物，效率非常低
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这种影响因素太多了，多试几次吧，另外盒子没问题吧，别以为promega 的盒子不会出问题，呵呵，
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用Invitrogen的TOPO cloning。做不出来我倒贴你钱。呵呵。:)
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感受态一经验证没有问题第一次平板上菌落很少，就几个蓝斑和1-2个白班。第二次将PCR产物纯化（95%酒精沉淀）后重新连接，做了个正对照（感受态+空载体），负对照（只有感受态细胞）过夜培养后，正对照出现菌落，可是实验板（感受态+载体+DNA）没出现菌落，继续培养5-6小时后，实验板出现2个白色菌落。请教各位这是为什么？ 用的是Promega T-A 克隆试剂盒。连接反应体系是：
2*Rapid Ligation Buffer：5 ul
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用Invitrogen的TOPO cloning。做不出来我倒贴你钱。呵呵。:)
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关于丁香园充电式起子电钻电池为什么有3个金属片？分别是“正”负”和“T”。这T里面就一个电子元件连接。。。。充电式起子电钻电池为什么有3个金属片？分别是“正”负”和“T”。这T里面就一个电子元件连接。请问这个元件有什么作用？叫什么的？？
叫热保护器，当电池充电时如果温度过高，充电器会自动切断电源。
T:temperature也就是温度的意思正如楼上所说，是一个热敏电阻，当电池由于某些未知的原因保护板失效或者充电器漏电等，热敏电阻会根据电芯温度增加而阻值增大，并反馈给充电器保护芯片断路信号。
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