质谱计扫描速度是什么？
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质谱计扫描速度是什么？
这是安捷伦公司提供的一幅两种质谱检测结果表示方法的对照和说明：
Quadrupole
Description
Profile versus
spectrum scans
the upper plot, a profile scan of an ion at m/z 109 is shown. In a
typical benchtop mass spectrometer, abundance measurements are
collected at 0.10 m/z increments as shown.
this data is presented in a mass spectrum, a single line is shown.
The height and position are derived from the profile scan. Notice
that in the plot of the spectrum, a single line is used to indicate
that a single mass is present.
四级杆简介&
峰截面轮廓曲线图与与之相对应的各质谱图数据子集扫描
在上面的图中， 展示了对m/z 109离子的扫描结果。
在标准的台面型质谱计中， 丰度测得值是以0.1 0
m/z为单位步进收集的。
当这一数据集以质量谱图的形式表达时， 我们只能看到一根直线。
直线的高度和位置来自对峰截面轮廓线式扫描结果的解释。 注意在谱线式图形中，
只用了一根直线表示只存在一种质量数。
这段文字说明了什么意思呢？ 说明了一般所讲的质谱计扫描速度，
指的是“驱动不同质量离子的动力变化速度”。
什么东西能以“0.1m/z”为单位步进呢？ 击中探测器的离子数不行，
离子的质量数都大于1。 在高分辨质谱图中最少也是一点几几几，
在低分辨率质谱图中就是1（氢）、 2（氦）、 ...
... 、 12（碳）， 等等之类。 探测器也只会记录电脉冲数， 分不出来离子质量。
“机器的检测时间（莫专家语）”不行， 时间的单位是时、分、 秒、 毫秒（ms）、
纳秒（ns）等等之类。
只有使不同质量的离子分开的加在四级杆和离子阱（念斌投毒案中只涉及了这两种质谱计）上的电压可以。 电压是可以“步进”并被精准记录的，
可电压的单位是伏特（V）， 那么，
只有将可以只驱动0.1m/z质量的微粒进入四极杆飞向探测器，
或者只可以将0.1m/z质量的微粒驱出离子阱飞向探测器的电压伏特数， 在质谱计中可能是“纳伏数”，
计算转换表达为m/z值， 就有了“以0.1
0m/z为单位步进收集”的“丰度测得值”。
为什么上面的“峰截面轮廓线图”会变成下面的“直线图”呢？
这是因为在电压以0.1m/z步进到到109m/z之前，
因为没有107.99、 108.00、 108.10、
108.20的离子， 高分辨力质谱计的高灵敏探测器能测到108.***的离子和109.***的离子，
低分辨力质谱计的探测器啥也测不到， 所以这时没有“丰度”被探测器收集到； 在109m/z之后，
同样没有109.10、 109.20、 ... ...、
110.00、110.10之类的离子， 探测器又啥都收集不到了，
只有在电压步进到109.00m/z时， 探测器才能收集到m/z 109的离子，
在低分辨力质谱计中将109.00左边的108.5**以上的离子和右边的109.500以下的离子（大致是这样吧）统统归入这个m/z109离子的计数值（丰度），
再将其与质量数对应起来， 就是下面的“直线图”或曰“柱状图”。
我们知道，
质谱计的探测器只能记录电脉冲数，1amu的氢离子是一个脉冲，
几千amu的蛋白质分子也是一个电脉冲， 如果只从探测器的结果记录，
则只有时间-电脉冲数记录， 而这些电脉冲是多大质量的离子产生的， 则无法分辨。
那么只有让一种质量的离子在一个时间段到达探测器，
才能分辨出来时间序列上的每组计数的离子质量（m/z值）。
用什么办法使不同质量的离子在一个时间段有序到达探测器呢，
只有改变施加在四级杆和离子阱上的控制电压， 射频（RF）或者直流（DC），
才能做到， 而电压的变化是能被仪器精确记录的， 精确记录的电压与粒子质量是精确对应的， 所以就可以将由小到大变化的，
驱动质量由小大的离子顺序飞向探测器的电压变化速度表达为单位时间内质量数的变化率，
也就是质谱计的以amu/秒为单位的“扫描速度”， 质谱计的5600amu/sec的扫描速度的意思，
就是仪器可以在一秒钟之内顺序将质量数从1amu到5600amu的离子顺序驱离出阱或者分质量过杆，
只是这个扫描速度是驱动离子分质量“过杆”或者“弹出离子阱”的电压变化速度，
不是探测器实际测到的脉冲数。
安捷伦公司的文章作者和译员喜欢将“驱动离子出阱”写成“扫描离子出阱”，
在这里， 我不愿意用“scan”这个词。
在念斌投毒案的律师辩护词中只涉及到四级杆和离子阱两种质谱计，
所以只讲这两种质谱计。
（传上来请读者们批判指正）
2015年3月25日
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质谱m/z中的z如何确定,比如质谱实测到m/z398.1,如何确定电荷数的?低分辨质谱和高分辨质谱这两者在确定z值时有不同吗?要具体详细的回答,
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一般z=1,极少情况会有出现带上两个电荷的,即使有也不是主要的波峰
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的质子的数目/电荷比的数目，一般质谱质量范围是确定的质量电荷比。
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质谱分析习题
一、简答题
1．以单聚焦质谱仪为例，说明组成仪器各个主要部分的作用及原理。
2．双聚焦质谱仪为什么能提高仪器的分辨率?
3．试述飞行时间质谱计的工作原理, 它有什么特点?
4．比较电子轰击离子源、场致电离源及场解析电离源的特点。
5．试述化学电离源的工作原理。
6．有机化合物在电子轰击离子源中有可能产生哪些类型的离子？从这些离子的质谱峰中可以得到一些什么信息？
7．如何利用质谱信息来判断化合物的相对分子质量？判断分子式？
8．色谱与质谱联用后有什么突出特点？
9．如何实现气相色谱－质谱联用？
10．试述液相色谱－质谱联用的迫切性。
二、选择题
1．3,3-二甲基戊烷： 受到电子流轰击后, 最容易断裂的键位是:
2．在丁烷的质谱图中，M 对(M ＋1) 的比例是
3．下列化合物含 C、H 或O 、N ，试指出哪一种化合物的分子离子峰为奇数？(
4．在下列化合物中, 何者不能发生麦氏重排?
5．用质谱法分析无机材料时，宜采用下述哪一种或几种电离源?
化学电离源
电子轰击源
高频火花源
6．某化合物的质谱图上出现m /z 31的强峰, 则该化合物不可能为
7．一种酯类（M =116），质谱图上在m /z 57（100%），m /z 29（27%）及m /z 43（27%）处均有离子峰，初步推测其可能结构如下，试问该化合物结构为
(CH3) 2CHCOOC 2H 5
CH3CH 2COOCH 2CH 2CH 3
CH3(CH2) 3COOCH 3
CH3COO(CH2) 3CH 3
8．按分子离子的稳定性排列下面的化合物次序应为
苯 & 共轭烯烃 & 酮 & 醇
苯 & 酮 & 共轭烯烃 & 醇
共轭烯烃 & 苯 & 酮 & 醇
苯 & 共轭烯烃 & 醇 & 酮
9．化合物 在质谱图上出现的主要强峰是
10．溴己烷经β均裂后，可产生的离子峰的最可能情况为：
m /z 93和m /z 95
m /z 71和m /z 73
11．在C 2H 5F 中，F 对下述离子峰有贡献的是
-1-112．某化合物的M S 图上出现m /e 74的强峰，IR 光谱在3400～ 3200c m
有一宽峰，1700～ 1750c m
一强峰，则该化合物可能是
R1－（CH 2）3－COOCH 3
R1－（CH 2）4－COOH
R1－CH 2(CH3) －CH 2－CH －COOH
13．在质谱图谱中若某烃化合物的(M＋1) 和M 峰的强度比为24: 100，则在该烃中存在碳原子的个数为（
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首先确定LC分析条件包括: mobile phase,gradient及column等,并自备solvents,solvent/waste bottles,sample vials (1.8 ml).每次操作时: 分析前及完成后,需清洗管线至少半小时以上,确保无残留污染.MS分析条件已知或已找到相关参考资料.进入chemstation后,首先需check tune为pass才可进行以后之操作,否则立即通知仪器中心助理.条件设定,质谱解析及报告A. LC设定1. Column2. 液相条件 - 移动相的选择3. Set up Pump4. Set up Injector 5. Set up DAD Signals B. MS设定条件参考1.电喷雾(ESI)之3个基本步骤2.化学电离(APCI)之3个基本步骤:3.MS 雾化室(MSD spray chamber)4. Set up MSD signals 1- MSD Control (方框左方)5.Set up MSD Signals 2 - MSD Signal Settings (方框右方) 6.选择离子检测(SlM)/ 扫描(scan)模式C. MS说明与解析:1.四极杆质量分析器有两种扫描方式:2.质谱常用术语3.质谱图相关概念4. LC-API/CID/MS5. MS解析规则与条件说明6. API电离步骤及过程:7. ESI 及APCI 最佳化条件8.将现有的 LC方法改编为 LC/API-MS方法9.萃取离子层析图(EIC) 10. 建立校正表D. ReportA. LC设定1. Column :(1)通常填充物质的粒径3-10 μm的管柱是可用的.(2)大於10 μm的填充物不适合LC/MS分析,因为峰扩散很大.(3)粒径3-5 μm的填充物是较理想的.5 μm管柱可能更适合扫描模式,其峰宽度会比较小粒径的管柱宽.峰出现花费较少时间,可以有足够扫描速度和扫描整个峰.如果数据采集太快,损失谱图质量.3.5 μm管柱具有增加层析分辨率和灵敏度的优点.提高的分辨能力可更可靠地分离同分异构体.(4)根据实验需要选择Column的长度,对高流量简单分析用短Column.总分析时间会较短,当为复杂样品时,需要较长Column的分离能力.2. 液相条件 - 移动相的选择(1) 非挥发性的酸,碱,盐 =& 挥发性的酸,碱,盐(2) Positive Ion ( pH 5.0 ; 9 preferred)●Acetic acid●Formic acid●Tri-fluoroacetic acid●Ammonium hydroxide●TEA(3) Post-column addition of acid or base may be used to adjust the pH if the chromatography won't work at the desired pH(4) 溶剂适用性Suitable for ES and APCl Suitable for only APCIMethanoI AcetonitriI *Water E P lsopropanoI ; ButanoI DMF(1) ; DMSO(1) Acetic A Formic AcidAcetoneCH2C12 ; CHCI3 THFTolueneBenzeneHydrocarbons (e.g Hexane)StyreneCCl4CS2Cyclic Hydrocarbons (e.g Cyclohexane)(5)许多常规的HPLC溶剂适合於API-MS.较好的电喷雾溶剂将在溶液中保持离子.因此,如甲苯这样的溶剂,在溶液中不会保持离子,不能用於电喷雾.虽然水是对离子极好的溶刹,但它的溶剂化能太高,去溶剂困难.(6)常用的LC/MS溶剂一般为高质量的甲醇,乙睛,水和挥发性添加剂,如甲酸,乙酸,甲酸铵和乙酸铵等.如果这些常规溶剂能满足分析的需要,可不考虑其他溶剂.(7)层析类型与离子源适用性ESIAPCIReversed phase*****Normal phase****p.s. Main compatibility problems: ions in solution are favorable for electrospray, but may lead to poor retention in reversed phase. High ionic strength and/or nonvolatile buffers may be hard to electrospray (8)ESI/APCI与HPLC的移动相之正反模式的相容性: (a)电喷雾有利於溶液中的离子.但是反相液相层析条件通常会抑制离子化,增加分子疏水性质.之后添加可用於克服这种类型的不相容性.样品通常挥发性低.(b)电喷雾对正相分离不是很有用,因为在正相移动相中通常不会形成离子.而APCI可处理非极性移动相,非极性样品通常较易挥发,因此正相层析可用於APCI.(c)以凝胶过滤形式的体积排阻层析与电喷雾相匹配.水相移动相和蛋白质样品是很好的匹配.凝胶过滤层析不适合APCI.通常样品不易挥发,而且缓冲液会引起APCI问题.然而,凝胶渗透层析由於移动相为有机性的,不太适合於电喷雾.3. Set up Pump(1)流速(flowrate) : 流速就是溶剂沿著管柱流动的速度.保持流动速度为常数对确保精确的保留时间和峰面积测量是很重要的.(2)溶剂(solvent) : 设定分析的溶剂组成.可选择一元分析或梯度流洗分析.设定通道B的百分比为从0到100%的任何值.通道A为剩下的体积100-(%B).当运行反相层析分析时,建议把水相放在通道A.(3)压力界限(pressure limit) : 设定压力限制的上限和下限,最高压力限是pump的自行停止的界限,保持分析系统压力避免过大.如果压力低於最低限以下,例如移动相走空以后,pump也将自动停止.(4)停止时间(stop time) : 设定一个分析的时间.停止时间后,所有的梯度都会停止,并且pump参教返回初始值.pump是一个完整分析系统停止时间的掌握者.(5)驻留时间(post time) : 驻留时间是分析结束和下一个分析开始之间的最小时间间隔,可以利用驻留时间在改变移动相组成后平衡Column,例如梯度流洗以后.(6)时间表(time table) : 时间表用於建立pump的梯度洗脱程序.pump时间表的值从时间表中定义的终值应随时间线性地变化.4. Set up Injector (1)标准的进样体积为0.1~100μL(标准配置).如果使用洗针功能,指定洗针所用的溶剂瓶号即可.其余参数一般不需要改变.(2)选择Use Injection programs可以按照使用者要求,安排程序进样.(3)如果希望两次进样取样间隔时间,可以选择Optimization选项:(a)Overlap Injection cycle:在前一针样品进行时,就提前把下一针的样品吸入定量瓶中,做好进样准备.要注意一定要改变后面的时间内定值,以保证前一针样品能够顺利进入液相系统,同时保证下一针样品的扩散最小.一般建议该时间选择在上一针样品进行停止之前1~2min.(b)Prefetch Sample Vial:在前一针样品进行时,就提前把下一针的样品抓取到针座上等候,做好进样准备.此时预约的时间要比上种选项要少,但没有样品扩散的风险.此时也要注意一定要改变后面的时间内定值,以保证前一针样品能顺利进入液相系统,一般建议该时间选择在上一针样品进行停止之前1~2min.(4)注意要保证Agilent 1200各个模式的Stop Time和Post Time的设定要一致,内定为As pump,即在pump的参数设定画面规定这两个时间即可.5. Set up DAD Signals (1) Signals :规定采集层析图所需的参数,要求样品的检测步长Wavelength(Sam.)设在化合物的最大吸收步长处,且大於溶剂的截止步长20nm以上.参考步长Wavelength(Ref)应设在样品没有吸收的地方,且越靠近样品的侦测步长越好.另外,要求BW(Ref)&BW(Sam.)&Slit,其中样品的谱带宽度Band Width(Sam.)应约等於其紫外吸收峰的半峰宽.注意记得保存所需通道的层析图,否则层析数据将不被保存.(2)Spectrum:规定采集吸收光谱时所需的参数.可保存所需张数的光谱图None, Apex + Baselines, Apex+Slopes+Baselines, Ail in Peak, Every 2nd Spectrum或All.若需要进行峰纯度检测或最佳化完全未知的样品检测条件,建议选择All模式. (3)Peakwidth: 设定影响层析图的数据采集频率,Peakwidth应略小於层析上最窄的层析峰的半峰宽.数据采集速率太快,则层析图的毛刺过多,数据采集速率太慢,则所采集的数据点过少,造成层析峰变形,无法进行准确定量.B. MS设定条件参考1.电喷雾(ESI)之3个基本步骤: 喷雾及带电→去除溶剂→离子蒸发.ESI之雾化气压力,乾燥气流速及温度取决於流动相组成及流速,如流速越快,含水量越高即需越多乾燥气辅助去除液滴中溶剂.ESI需考虑(1)样品 : (a)在溶液中为离子态:儿茶酚胺,硫酸酯共轭物,丁基胺(b)有可诱导电离的化合物:甲醇(c)含杂原子的化合物:氨基甲酸酯类,苯并二氮杂原子类(含O, S, N)(d)溶液中带多电荷:蛋白质,多肽,低聚核甘酸(2)溶液化学参数 : (a)流速(b)样品的pKa,溶液pH(c)溶液导电性(3)应避免的样品 : 尤其非极性的样品PAHs,PCBs2.化学电离(APCI)之3个基本步骤: 雾化→蒸发液滴→气相电离.即蒸发后再进行离子化,用於可被蒸发之样品,且此过程只产生单电荷离子.APCI需考虑(1)样品(a)分子量和极性中等的化合物:PAHs, PCBs,脂肪酸,邻苯二甲酸酯类(b)不含酸性和碱性位点的化合物: 酮,酯,醇,醛,碳氢化合物(c)含有杂原子的化合物:脲,氨基甲酸酯等(d)对电喷雾响应不好的样品(2)溶液化学参数(a)较ES对溶液化学作用不灵敏(b)较ES更耐大的流速(c)适用ES不宜的一些溶剂(3)应避免的样品 : 在气化过程中热不稳定的化合物3.MS 雾化室(MSD spray chamber)(1) Method: API-ES ; APCI(a)乾燥气流速(drying gas flow, L/min) : 范围0-13即最高限值13 L/min.ESI通常为8-10 L/APCI通常为4.(b)喷雾气压力(Nebulizer pressure, psig) : APCI:60ESI与流速有关,最高限值60 psi.(c)乾燥气温度(drying gas temperature) : 与流动相和流速有关,通常为300 ℃以上.水相比较多或高流速时要求较高的乾燥气温度.最高限为350 ℃(d)蒸发温度(Vaporizer temperature)(限於APCI) : 与溶剂和流速有关,通常为350 ℃.水或高流速时要求较高的蒸发温度.最高限为500 ℃.(e)毛细管电压(Capillary voltage) : 最高限为6000 V 正模式(V) 负模式(V)ESI APCI 注: ESI模式负极性时,在高电压时全发生喷针放电.(f)电晕电流(Corona current, μA) (限於APCI) : 对正极性: 通常为4 μA;对负极性: 通常为25 μA.(2) Method: MM-ES + APCI 复合源(a)注意charging voltage : 影响ESI区域离子化重要参数.4. Set up MSD signals 1- MSD Control (方框左方)(1) Use MSD MSD将被用作检测器.在standby状态,不会被作为检测器.(2)停止时间(Stop Time): 质谱停止采集的时间.(a)一般设为As pump:按照LC pump中所设的停止时间,(b)若使用者输入时间:当选到指定时间时,MSD数据采集将停止.(3)FlA状态: 选择FlA时,会显示FIA enabled.非FlA时,显示FIA disabled.(4)调整档案(tune file): 指定采集数据时MSD采用那个调整档案里的参数(5)峰宽度(Peak width): 输入预期的层析峰半宽度 (用分钟表示).典型的层析峰宽为0.05-0.15 min.不确定时使用较小的值.内定值为0.1 min.(6)循环时间(Cycle time): 完成一次所有活性信号扫描的时间(秒).也可想像层析图上一个采样点的时间.循环时间的计算与所输入峰宽有关.(7)快速扫描(Fast scan): (a)当设定的质谱信号参数(如峰宽,质量范围和步长)会导致采集数据点过少时,软体会提醒改变参数或选择快速扫描方式.(b)如果参数设定不需要快速扫描,即使选择快速扫描也不会被执行.在VL系统中没有这个选项.(c)在最佳化扫描速度时,会损失一些灵ㄧㄥㄣㄚㄚ陌性敏度和分辨率.因为四极柱的离子传输效率较低.Data reconstruction (selectable)可选,在此设定下采集的数据进行重组以提高电荷和多电荷质谱图的分辨率.某些需要快速扫描速度的应用,不一定要重组数据.对於这些应用,不选择数据重组.数据重组时应用一个移动平均过滤器以减少由快速扫描引起的质谱杂讯.(8)时间过滤器(Time Filter): 内定为选择时间过滤器.建议使用时间过滤器.(9)扫描数据存档(Scan Data Storage): (a)建议选择保存压缩数据(Condenced),即棒状质谱图,节省磁碟空间.(b)对多电荷样品使用完全数据 (连续质谱图),其它使用压缩数据.(c)Deconvolution只能在完全数据上进行.如果试图在压缩数据或SIM数据上使用Deconvolution,将会产生错误.5.Set up MSD Signals 2 - MSD Signal Settings (方框右方) (1)极性(Polarity): 指定MSD检测离子的极性(positive/negative).必须先进行MSD tune.(2)模式(Mode): 采集质谱数据的方式.(3)扫描(Scan): 从高到低指定的质量范围,并且以指定的间隔(步长)检测强度.在过程中这个程序不断重覆.适於定性分析,例如未知物的鉴定,峰纯度或多电荷样品分子量的确定.(4)碎裂器(ramp): 适用於Scan模式和定义ramp.不同的质量数离子可应用不同的碎裂电压.(5)时间(Time): 进样后质谱参数开始进行生效的时间(min)如果第一行是非零时间,MSD不会采集,直到这个时间到达.质谱选择阀也会将LC流路送到废液瓶,直到开始数据采集.(6)质量范围(Mass range): MSD扫描的质量范围.范围越大,MSD须扫描得越快.要得到高品质数据,应扫描所需范围.(7)增益(Gain): 增益是MSD信号放大因子,将信号强度电子倍增器的电压相关联,增益5会得到增益为1时的信号强度的5倍.通常,检测器会在较低的增益值对工作即能产生合适的离子强度.高增益值同时会增加噪音,产生较差的信噪比.通过增加增益值来提高EMV电压会缩短电子倍增器的寿命.(8)碎裂器电压(Fragmentor voltage): 设定碎裂电压.当进行一个方法(Method)时,控制碎裂器电压优先是:(a)选择FIA时,包括碎裂电压的FIA表;(b)当选择碎裂器ramp时,碎裂器ramp表(FIA未选择);(c)如果以上的都没有选择时,参考下列信号设定表.(9)阀值(Threshold): 阀值是强度值.只有强度等於或大於这个值的数据点才被保留在每个扫描的质谱中.内定值150.(10)步长(Step size): 步长是设定扫描数据点之间步幅的大小.这个参数影响扫描速率.典型的值是0.1,范围为0.05到0.4.Fragmentor值与化合物性质有关: 不同化合物使用不同的Fragmemtor值CompoundMax. Mol. Ion2nd. M/z &50%Acid Red 4 (-) 100 130Alprazolam (+) 100 140Caffeine (+) 70 100Methamphetamine (+) &50 70Nitrophenol (-) 70 100Quinine (+) 90 130Quinine (++) 50 60Reserpine (+) 130 170Salbutamol (+) 200注: 最佳化碎裂电压: 表中数据表示不同化合物获得最强的准分子离子和第一个碎裂离子达到其50%强度的碎裂器电压值.每个化合物均通过FlA模式在碎裂电压50到200 V范围内进行分析的.6.选择离子检测(SlM)/ 扫描(scan)模式(1)Scan采集在特定范围中每个质量上的数据.对定性分析通常采用scan模式采集,例如确定样品的分子量或纯度.(2)SlM只采集预先设定离子的数据.此采集方式具灵敏度和专一性.定量分析通常选择SlM模式.Greater sensitivityBetter peak shapeTrace levels easily detected in complex matricesUsed for routine quantificationUseful when precise ion ratios are desired(a)SlM参数: SlM有三个可用自订的参数 # of ionsm/z of each ionDwell time(b)每组可检测30个离子,每次采集可分50组.(c)每组检测最少数目的离子可获得最大的信噪比和准确度.(d)驻留时间(Dwell Time)是对每个离子检测的时间段.该时间取决於峰宽选择(17+2 cycles/peak).S/N正比於Dwell Time.(e)可以设定同组中每个离子驻留相同时间或设定每个离子相对驻留时间:*组内(group)为同时SIM的离子,组间为不同对SIM的离子.*组内SIM的离子越多,每个离子的驻留时间就越少.*操作者可根据层析峰的分离情况将不同离子设为组内,或组间SIM.*驻留时间是用於采集每个离子的时间.驻留时间与MSD参数对话框中设定的峰宽度值有关系.软体会根据峰宽度值,然后根据每个峰要有17+2个循环的需要以确定驻留时间.除非使用者指定相对的驻留时间,否则驻留时间会在组内的离子间平均分配.(3)选择 SlM 离子(a)定量离子:该离子的响应用於计算待测物的含量.(b)限定离子:该离子的响应值与定量离子响应值之比值用来确认待测物质化合物,以避免假检出.(c)选择相对强度较高的离子可以提高灵敏度.(d)选择质量数高的离子可以避免干扰.(e)选择唯一性高的离子.(f)尽量避免选择基质或背景中存在的离子.(g)如果可能,每个化合物选择多个离子.离子间的比例可以帮助判别化合物,特别是同位素族.(h)对於SIM定量,可以对每个层析峰选择一个定量离子.这个离子应该峰高且唯一.不要选择在基体或背景中相同的m/z.(i)为确定层析峰,选择一或两个限定离子.这些离子也应该峰高且唯一.在LC/MSD分析中,离子的出现和峰高度,缓冲液和碎裂器相关.(4)选择定量/限定离子(a)应用精确质量,不要用名义质量(例如195.2而不用195).(b)为得到最佳效果,用动态校正,即选择如括弧所示的样品质量(195.0,195.1,195.2,195.3,195.4)以选择响应值最佳的离子.(c)为长期的效果,检测前要对质量轴进行校正.(5)定量方法建立首先要扫描采样以确定在SIM分析中所要使用的离子.使用扫描采样数据,得到谱图列表展示有一位近似值的精确质量并输入到SIM表中.使用者应使用列表中的质量,例如195.2,而不是名义上的质量195.如果所选择的SlM质量偏差0.3daltons,则灵敏度会有70%的损失.另一方面,找到SlM分析的最佳m/z,要避免所有离子的SlM实验产生一位近似值.这就是所谓的动态调整.(6)动态SIM校正动态SIM校正可以获得最佳的SIM灵敏度.做SIM 试验:(a)以0.1 dalton为间隔采集多个质量例如:Caffeine 195.2 : 195.0 ; 195.1 ; 195.2 ; 195.3 ; 195.4(b)积分SIM数据并且选出响应值最大的离子作为定量离子(c)进行动态调整,此例子中,全扫描质谱图在195.2 daltons处有离子.(d)咖啡因的SIM实验将包括一组具有五个离子:195.0,195.1,195.2,195.3和195.4 daltons.评估各质量的离子EIC积分结果,或直接看质谱图以找到最大强度的离子.这就是SIM定量的最佳离子.C. MS说明与解析:1.四极杆质量分析器有两种扫描方式:(1)全扫描方式(scan) : 主要用於定性分析,未知化合物的鉴定;(2)选择离子监测(SIM) : 主要用於已知化合物的定量分析.2.质谱常用术语1.分子离子(molecular ion)自由基 (radical)离子M.+.很活泼,易碎裂而产生广义的碎片离子.2.准分子离子*(quasi-molecular ion)由软电离技术产生的质子或其他阳离子加合离子以及去质子化或其他阴离子加合离子.3.碎片离子(fragment ion)电离后具有过剩内能的分子离子以多种方式裂解生成碎片离子.4.奇电子离子(odd-electron ion, OE);偶电子离子(even-eIectron ion, EE)OE含未配对电子,有较高的反应 (碎裂)活性,易生成碎片离子.5.多电荷离子(multiply-charged ion)6.同位素离子(isotopic ion)3.质谱图相关概念(1)总离子层析图(Total Ion Chromatogram, TIC)(2)质谱图 (Mass Spectrum, MS)(3)选择离子监测图 (Selected Ion Monitor, SlM)(4)萃取离子层析图 (Extract Ion Chromatogram, EIC)(1)总离子层析图(Total Ion Chromatogram, TIC)将质谱图上每一个离子的强度的总合对应扫描时间作图产生的.TIC层析图上每一个采样点都对应一张质谱图.(2)准分子离子当用大气压电离技术分析小分子时,通常在质谱中主要的峰是质子化准分子离子.例如苯基保泰松的实际质量308,在质谱图中其基峰即最大强度峰是准分子离子[M+H]+峰,m/z为309.(3)萃取离子层析图(EIC) : 可以(a)提高S/N去除背景(b)分离共流出峰(c)主要用於:寻找目标峰,准确定量注意:EIC是在数据采集后分析时生成的;而SIM是实际信号.4. LC-API/CID/MS : (1)通过调节毛细管出口电压,在毛细管出口处可发生碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation, CID)而产生碎片.利用碎片信息,有助於定性;利用碎片离子定量,可提高方法的专属性.(2)范例: 甘油三酸脂的碎裂电压75V可得谱图中m/z 684.65呈现 准分子离子峰[M+NH4]+.当碎裂电压升高到175V,可用碎片离子m/z 467或 439表示.(3)API是一种相对的软电离技术,产生的主要是准分子离子.CID是用中性气体分子去碰撞离子产生碎片的过程,对定性分析和定量分析都很有用.(4)CID可以通过选择离子传输毛细管出口和第一级分离器之间的离子能量来控制.离子能量可以通过改变软体(chemstation)中所谓的碎裂参数来改变.5. MS解析规则与条件说明(1) [M+H]+离子的氮规则分子量为奇数[M+H]+ 为偶数的离子有奇数个N分子量为偶数[M+H]+ 为奇数的离子有偶数个N或不含N例1. m/z 300的[M+H] + 离子: mw = 299 ; 即化合物一定有奇数个氮例2. m/z 301的[M+H] + 离子: mw = 300 ; 即含有偶数个氮(0,2,4….)(2)API质谱图解释电喷雾和APCI是可提供分子量信息的软电离技术.检测到的离子种类与溶剂添加剂和分析所用的条件相关.正离子检测负离子检测-[M+H]+ 酸性条件-[M+Na]+ , [M+K]+ (有盐时)-[M+NH4]+ 有铵盐缓冲溶液 -[M+X]+, x=溶剂或缓冲溶液中的阳离子-[2M+H]+在高浓度时形成的二聚体-[M+H+S]+ 溶剂添加剂-[M+H]- 碱性条件-[M+X]- , x=溶剂或缓冲溶液中的阴离子-[M-H+S]- 溶剂添加剂(3)样品的储存,准备,移动相和添加剂都将影响最后结果.当建立一个新方法时要注意这些因素.(4)CID (Collision-Induced Dissociation )通过与中性气体分子碰撞将能量传递给离子产生碎片的过程.能量传递足以导致断键和所选离子重排.对定性分析和定量分析都很有用.定性提供有关分子的结构信息.定量特性由限定离子的存在而增强.70年代初McLafferty (JACS,95,)证明ClD使键断开和离子重排,产生离子代表中性分子的结构.结构解析: API过程中,准分子离子以偶电子离子形式出现.通过CID合产生碎片,碎裂过程如下:ABCD+→ ABC+ + D (中性碎片)电荷保留在质子亲和势较高的碎片上(5)ClD 质谱图解析: 常见中性损失( Even LOSS)(M+X)+-18 水 (M+X)+-H2O(M+X) +-20 氟化氢(M+X)+-HF(M+X) +-28 一氧化碳或乙烯(M+X)+-CO or (M+X) +-C2H4(M+X) +-30 甲醛(M+X)+-H2CO(M+X) +-31 甲胺(M+X)+-CH3NH2(M+X) +-32 甲醇 (M+X)+-CH3OH(M+X) +-36 氯化氢(M+X)+-HCI(M+X) +-44 二氧化碳(M+X)+-CO2(M+X) +-46 二氧化氮(M+X)+-NO2(M+X) +-60 乙酸(M+X)+-CH3CO2H(M+X) +-90 硅醇 (M+X)+-HO-Si-(CH3)36. API电离步骤及过程:(1)溶液中电离(样品pKa,溶液pH)→(2)喷雾(表面张力及黏度,气动辅助)→(3)去溶剂(乾燥气温度及流速,热容量Hvap)→(4)离子从溶液中解析(溶解能)→(5)气相中的离子反应(质子亲合力,电荷交换)(1)当分析物在溶液中以离子存在时得到最佳的电喷雾灵敏度 对中性分子,离子相互作用比非离子相互作用大103至104倍(例如:凡得瓦力,氧键).因此分析物离子可以克服液滴的溶解能,从带电液滴中解析出来.(2)在溶液中如何产生离子 (a)酸/碱化学性质: M - NH2 + 酸 → [M-NH3]+ +酸- M - COOH + 碱 → [MCOO]- + 碱+ (b)螯合(对类似糖的中性物质): M.+ Na+ [M + Na]+ (碱金属,如20 M乙酸钠)(c)衍生化: 形成离子或酸/碱产物当分析物溶解在酸或碱之极性溶剂中时,可被离子化或具有强偶极距.对於电离的分析物,ESI通常简单且具有高灵敏度.不存在其它离子-离子相互作用干扰,离子在喷雾前已经存在於溶液中.在喷雾中这些离子易於从液滴中蒸发出来,得到较高的分析物离子强度.形成强偶极距但没有被电离的分析物也可分析.喷雾室中的强电极场驱动离子化过程.这些电场促使喷雾液滴带电荷,使液滴表面引起分析物分子离子化.通过使用特定的化学物质的交互作用,这些分析物也可被化学电离.(3)对电喷雾使用典型缓冲液产生离子的问题 - 离子对的形成(a)对正离子检测,由於离子对的形成,使溶液中或气相中的离子中和![M + H]+ + A- [M + H + A] A = B, S, P : 有利於中性样品; A = 甲酸盐,乙酸盐: 有利於带电物质*离子对强度: B,S,P & 三氟乙酸&乙酸盐,甲酸盐 (B, S, P) = 硼酸盐,硫酸盐,磷酸盐(b)对负离子检测,由於离子对形成,使溶液或气相中离子的中和![M-H]- + C+ [M-H + C]0 ; C = Na,K,Li (中性产品); C = NH4+(带电物质)(4)气相中的离子反应(a)通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会产生质子转移和电荷交换反应.这个高压区允许发生1000次离子/分子反应.(b)质子转移: 与HPLC添加剂相比,如:氨,三乙胺 (质子亲合力分别为206和232 kcal/mole),样品具有较低质子亲和力的会失去一个质子,变成中性或形成复合离子如[M+NH4]+.(c)溶液碱度在气相中会导致分析物离子的去质子化,致使分析物没有电喷雾信号.添加剂如三乙胺这样强气相碱的使用,会导致[M+H]+离子损失.添加剂(乙酸铵,甲酸铵,乙酸,甲酸和氢氧化氨)的使用会减少这些反应.(5)比较电喷雾电离源(ESI) 大气压化学电离源(APCI)离子在溶液中已生成离子在气态条件中生成化合物无需具有挥发性 化合物需具有一定的挥发性是分析热不稳定化合物的首选方法化合物必需是稳定的生成单电荷离子外亦可生成多电荷离子 只生成单电荷离子7. ESI 及APCI 最佳化条件(1)APC-MS添加剂(a)调整PH : 使用乙酸,甲酸,TFA,氨氧化胺(b)一般的缓冲液/离子配对试剂 : 乙酸铵/甲酸铵 ; 三氟乙酸(TFA) ; 七氟丁酸(HFBA) ; 四乙基或四丁基氢氧化铵(TBAH)(c)阳离子化试剂 : 20-50 M的乙酸钠或乙酸钾(d)一般考虑: 挥发性 (污染喷雾室,堵塞喷嘴)导电性 (对离子气化过程减少小液滴的形成)离子配对 (进入气相时中和预带电离子)(e)不能使用在HPLC中常使用的磷酸盐,硫酸盐或硼酸盐(f)在APl-ES中影响添加剂选择的主要因素是离子配对和挥发性.(g)对APCI添加剂选择的主要因素是挥发性.8. 将现有的 LC方法改编为 LC/API-MS方法(1)溶剂: (a)非挥发性缓冲盐 =& 挥发性缓冲盐(b)浓度&10 mM(对於ES)或&100 mM(对於APCI)用醋酸鞍,甲酸,三氟乙酸 (TFA),七氟丁酸(TFBA),羟基四丁基胺取代磷酸盐,硫酸盐和硼酸盐.(Formic acid, acetic acid, TFA, ammonium hydroxide)如果必须使用非挥发性缓冲盐,使用仅阳离子或阴离子部分不挥发性缓冲盐,例如用醋酸钠而不用磷酸钠.(c)挥发性离子对试剂可以使用.(2)样品制备: 通常样品制备或没有样品制备会严重影响API-MS分析.很多情况下APl-MS技术的失败源於样品前处理.前处理不当会导致信号衰减或共同离子干扰.前处理需要考虑以下因素,其为分析成败关键:(a)盐; (b)基质组成; (c)浓度.(a)样品中盐: 存在会导致复合离子的形成,如:[M+Na]+或[M+K]+.各种复合物的强度取决於浓度.它们的存在会破坏SIM分析.要考虑到当你不能确定存在的加合物质而要努力确定末知物的分子量时你会遇到的困难.(b) 基质组成: 特别是移动相中的添加剂对电喷雾和APCI模式中的信号都会抑制.在电喷雾中,相反电荷的移动相添加剂会与样品形成中性物质导致电喷雾离子化过程停止.在APCI中不适当的移动相或添加剂选择合导致移动相或添加剂的离子化而不是样品的离子化.(c)太高的样品浓度会导致二聚体(dimer)的出现.主要的前处理方法:(a)超滤-去蛋白; (b)溶剂萃取-脱盐; (c)液-液萃取; (d)固相萃取(SPE); (e)免疫亲和萃取-高效,高专属性; (f)柱上浓缩; (g)柱切换(LC/LC)简易前处理至少应: 如果样品是粉末或固体时,先溶解在溶剂中,使用微过滤器,微离心将固体与上层清液分离.液体样品,在进样到API-MS前使用保护柱,LC柱或固体萃取滤筒用水清洗样品以去除盐和其它水溶性物质.(3)Column 选择:(a)LC/MSD在特定的流速范围内操作:ESI : 0.005 - l.0 mL/ APCI : 0.2 - l.5 mL/min(b)对於一个特定的方法,流速,所需的灵敏度(特别是当样品有限时)和样品容量将决定所选择层析柱的内径.(c)LC/MSD较适合2.l mm至4.6mm内径的层析柱.*电喷雾是浓度灵敏型的,通常2.l mm内径的层析柱较好.*APCI模式常选择4.6 mm内径的层析柱.(此非浓度灵敏型).因此较大的进样量会有较强信号值.4.6 mm内径的层析柱至少可处理2.l mm内径的层析柱10倍的进样体积,而不损失分辨率.4.6mm内径的层析柱更适合APCI的较高流速.9. 萃取离子层析图(EIC) : (1)可以从MS数据中提取出简单离子或某段质量范围的离子.处理总离子层析图(TIC)的各项功能同样适用於EIC.(2)EIC在确定层析峰的杂质很有用.也是用全扫描定量过程的一部分:提取出定量离子,积分并插入到调整表中.(3)单一个离子可在Ion 1档中指定.当输入一个离子,摘出从-0.3至+0.7 daltons的离子.也可以用Ion 1和Ion 2指定一段质量范围.(4)时间窗口: 如果只希望从某一段时间提取离子,可以使用时间窗口.可选择是否与当前信号同时显示,或者提取离子后是否积分.(5)利用快捷键生成EIC.(a)先开启一张质谱图.(b)点击ElC快捷键(c)将鼠标(已变成十字)移至质谱图上某一质荷比的离子处,即可自动生成此质荷比离子的EIC.10. 建立校正表(1)运行系列浓度的标准溶液,应包含样品浓度范围,一般采用选择离子检测模式采集数据.(2)选用质谱数据文件,运行萃取离子层析图(EIC)功能.对低浓度的标准样,设定合适的积分参数,以获得峰高或峰面积积分数据.(3)选用最低浓度的标准品,从第一级开始建立新的校正表.(4)选用较高浓度的标准品,最佳化谱图和积分后,分别添加到校正表中.(5)检查校正曲线(6)将最佳化谱图选项,积分参数和校正曲线同方法一起保存.上面列出建立一个校正表并最终测定样品中组份实际含量的步骤.化学工作站可以用外标或内标法进行定量.需要准备一系列浓度的标准溶液,应使待测样品的浓度包括在该范围内.运行样品,建议在SIM方式下采集数据,SIM模式可得到较好的精确度和准确度.选用最低浓度标准品,并提取合适的离子,用适当的积分参数对提取TIC图进行积分.通过信号详细资料未确定用於定量EIC和限定离子的EIC,保存积分参数和所用其他浓度标准品的信号详细资料.填写校正表的设定,包括浓度单位.建立新的校正表,填写每一个标准品的浓度和名称.检查校正曲线并将校正表存档为方法的一部分.D. Report1. 从Report菜单下选择Specify Report即可进入报告参数设定界面.2. 注意选择合适的定量方式(Quantitative Results),报告的输出目的地(Destination)及报告类型(Style).3. 在输出报告前还可以进行谱图参数的设定(Signal Options).4. 报告参数:报告输出目的地定量报告可直接在印表机上输出,也可显示在萤幕上或以文件形式输出.5. 报告可以输出成下列格式的文件:(1)TXT- 只输出报告的文本内容,以纯文字形式输出.(2)WMF- 将报告以WMF图形文件形式输出.(3)DIF- 报告以数据交换文件(DIF)形式输出,可用Excel等程序打开该文件.(Data Inter change Format)(4)CSV -将报告以逗点分隔数据库文件(Comma Separated Values)CSW形式输出,可以用Excel等程序打开该文件.(5)XLS- 将报告以EXCEL文件形式输出(6)HTM- 将报告以超文本文件形式输出可以使用IE浏览器打开该文件.LC/MS操作
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