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化学还原法制备纳米银颗粒及纳米银导电浆料的性能纳米银调控自噬在肿瘤治疗中的作用及初步机制研究--《中国科学技术大学》2014年博士论文
纳米银调控自噬在肿瘤治疗中的作用及初步机制研究
【摘要】：作为目前被应用得最为广泛的纳米材料,纳米银在光学、电学、力学、磁学、催化、生物学等方面都展示了良好的应用前景。由于具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、消炎等特性,纳米银在医学领域的应用也引起了广泛的关注。同时,目前有很多报道显示纳米银可以在癌细胞里面导致很多生物学效应,比如氧化应激、DNA损伤、凋亡、坏死。自噬是细胞内一种溶酶体依赖的细胞内物质进行周转的机制,对生物体正常状态的维持至关重要。多种纳米颗粒都被证明可以诱导细胞自噬,比如上转换发光材料、C60、金纳米颗粒、量子点,并且这种自噬在大多数情况下是促进细胞死亡的。而纳米银是否能引起细胞自噬,以及其可能引起的自噬对细胞命运有怎样的影响都未见报道。这里我们发现纳米银可以通过激活PtdIns3K信号通路引起癌细胞内自噬。并且纳米银引起细胞自噬是通过促进上游自噬体的形成,而非通过阻断下游自噬体的降解或造成溶酶体的功能损坏,这就表明纳米银引起了完整的细胞自噬。
由于纳米银具有很大的癌细胞毒性,并且已经被证实对道尔顿淋巴腹水瘤、黑色素瘤有很好的治疗效果,另外,纳米银还可以抑制肿瘤血管的生成,所以有潜能被用于抗肿瘤治疗。我们进一步对纳米银引起的自噬在抗肿瘤过程中所起的作用进行了探究。实验发现无论通过自噬抑制剂wortmannin或者bafilomycin A1处理细胞,还是通过转染ATG5siRNA来减弱细胞内自噬水平,都会进一步增加纳米银处理导致的细胞死亡。这就表明纳米银引起的自噬可能起着保护癌细胞生存的作用。目前已经报道的大多数无机纳米颗粒引起的细胞自噬都是促进细胞死亡的,所以纳米银引起的自噬属于“少数”的那一类。这也暗示我们可以将自噬抑制剂与纳米银联用,以取得更好的抗肿瘤效果。因此,我们用B16黑色素瘤荷瘤鼠开展了实验,结果表明自噬抑制剂wortmannin可以显著增强纳米银对B16黑色素瘤的抑制效果。
由于纳米银引起的为保护性的细胞自噬,我们接下来对纳米银导致保护性自噬的机制进行了进一步探究。我们发现纳米银可以引起一个调控自噬非常重要的转录因子——TFEB进核,TFEB进核后可以调节一系列自噬以及溶酶体生成相关的基因表达。但是纳米银引起TFEB进核的机制不同于现在已经报道的机制,我们正在寻找一个新的机制来解释我们观察到的现象。另外,由于金铜合金和量子点也能导致TFEB进核,很巧的是量子点和氧化铜都已经被报道可以引起细胞内保护性自噬,所以我们推测TFEB进核可能是纳米材料引起保护性自噬很重要的一个机制。
我们的研究证实了纳米银的一个新的生物学效应——引起细胞保护性自噬。我们还发现抑制自噬可能是一个有用的增强纳米银抗肿瘤治疗效果的方案。另外,我们有希望进一步阐明纳米材料引起保护性自噬的机制。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学技术大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：R73-36;TB383.1【目录】：
摘要5-7ABSTRACT7-11第一章 绪论11-44 1.1 细胞自噬11-31
1.1.1 自噬的定义及分子机制11-13
1.1.2 细胞自噬的调节机制13-20
1.1.3 完整自噬及非完整的细胞自噬20-22
1.1.4 细胞自噬检测方法22-28
1.1.5 利用自噬促进肿瘤治疗28-31 1.2 纳米材料引发自噬31-36
1.2.1 纳米材料引起自噬31-33
1.2.2 纳米材料引起自噬与细胞命运的关系33-35
1.2.3 利用纳米材料自噬效应促进抗肿瘤效果35-36 1.3 纳米银概述36-44
1.3.1 纳米材料的特殊性质可用于肿瘤治疗36-39
1.3.2 纳米银简介39-41
1.3.3 纳米银抗肿瘤治疗41-44第2章 纳米银引发肿瘤细胞保护性自噬44-72 2.1 实验结果和讨论44-68
2.1.1 纳米银合成以及表征44-47
2.1.2 纳米银引起细胞发生自噬47-51
2.1.3 纳米银引起完整的细胞自噬51-53
2.1.4 纳米银处理不会导致溶酶体功能受损53-55
2.1.5 纳米银引起自噬的通路探究55-57
2.1.6 纳米银引起自噬不是因为银离子的释放57-61
2.1.7 自噬抑制剂增强纳米银对HeLa细胞的杀伤61-65
2.1.8 ATG5基因敲减增强纳米银对HeLa细胞的杀伤65-68 2.2 结论及讨论68-72第三章 调控自噬增强纳米银对肿瘤的杀伤72-80 3.1 实验结果和讨论72-78
3.1.1 纳米银在B16细胞中引起自噬72-73
3.1.2 自噬抑制剂增强纳米银对B16细胞的杀伤73-74
3.1.3 自噬抑制剂增强纳米银对黑色素瘤的杀伤74-78 3.2 结论及讨论78-80第四章 纳米银促进TFEB进核与保护性自噬的关系80-88 4.1 实验结果和讨论80-85
4.1.1 纳米银导致TFEB进核80-82
4.1.2 纳米银导致TFEB进核为mTOR非依赖的82-83
4.1.3 纳米银导致TFEB进核与ERK信号通路无关83
4.1.4 TFEB进核与保护性自噬的关系83-85 4.2 讨论及展望85-88参考文献88-98附录 实验原理及方法98-111致谢111-113在读期间发表的学术论文与参加的学术活动113-114
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。所以很多女人生完孩子以后身材就走样了 ，不会再有1尺9的小蛮腰了，逐渐向横向发展 。　　　　　　　　就是因为肚子里有一个那么大的子宫，那么大家想一下 　　　　子宫不能复原了，是不是内部就不再光滑了 ？　　　　就跟我们的肠道的结构一样了 ， 充满了皱褶和隐窝，那么每个月再来的例假，就不可能100%的排干净，里面至少会有10%的经血停留 。　　　　　　　　大家可能都有过便秘的经历吧 ？一天一次的大便，是不是就很臭 ？　　　　　　　　两天的是不是更臭 ？那三天的呢 ？一星期的呢 ？据说一周的宿便产生的毒素可以杀死一头牛 。那么我们的月经呢， 在我们的体内可不是一天三天、一周 ，至少是一个月的时间 。　　　　　　　　那么那个地方，有温度，有湿度，经血很容易腐烂，变质，变成垃圾，产生毒素 ，这些毒素，被人体反吸收以后，就会进入血中，走遍我们的全身 。在我们没有生小孩之前，我们的血液比较干净，所以流动的速度就比较快一些，有了毒素以后，血液粘稠了，流的速度就比较慢了，那么血液里的垃圾，就会停留在所有的脏器 ，达到一定的量，就会造成淤症 　　　　 　　　　所以我们中医讲，内有淤，外才会长斑，就是这么来的。 　　　　那么今天的女性，我们从健康的角度都需要清理我们子宫里的这些垃圾 　　　　那么有一些没有生过小孩的女人可能会说 ，太好了 ，我可以不使用水肤兰了 ，因为我还没有生小孩呢 ！别着急 告诉你，你照样需要用！为什么呢？ 　　　　　　　　大家有没有关注到 ：最近这些年新生的婴儿畸形率相当高 ，并且呈逐年上升的趋势！ 　　　　　　　　为什么呢 ？就是因为我们的子宫里还有产生一些生活的垃圾。 　　　　是哪些呢？主要是男人的精子 。现在我们的社会开放了 ，人们已经不拔贞洁看得那么重了　　　　但是17,8岁的小姑娘有了男朋友，又有几个会白头到老呢？所以现在的女孩子都会有好几个性伙伴 。那么很少会有人采取积极地避孕措施的 　　　　　　　　那么男人每次射出的精子大概在50万到几千万个 ，每次会有2000只左右的精子会通过宫颈口进入到子宫里面 。　　　　我们小的时候都有学过生理卫生的课，知道精子是像小蝌蚪的形状 ，那么每个精子的成活时间都是非常短的。大概在5分钟到24小时 。他们进入子宫里以后会缓慢的游动，当遇不到卵子，也游不动了就会一头扎进子宫内膜里 ，那么精子去世以后就变成了垃圾 。　　　　　　　　而现在的女孩子已经开始越来越早额接触性了 ，结婚生子却越来越晚了 。大家想一下，我们的子宫是不是无形当中就变成了一个大垃圾场 。那么一个婴儿在一个大垃圾场中要度过漫漫的十个月，在吸收营养的同时，是不是也把垃圾给吸收了 ？　　　　所以现在的新生儿出现了医学上都无法解释的各种怪病 ，所以今天在这里我呼吁所有还没有生小孩，打算生小孩的姐妹们，赶紧打扫一下你的子宫吧！　　　　从优生的角度来讲，你比生过小孩的女人更需要水肤兰所以，有一些可以使用水肤兰的美容师我建议，强烈建议他们使用 ！他们会更有说服力！　　　　　　　　聊完子宫我们再来聊聊卵巢 　　　　有人曾把女人的容貌比作花 ，百变天后梅艳芳唱过一首歌 《女人花 》　　　　想必大家都听过。　　　　从仿生学的角度来讲 ，女人的容貌确实像花一样 。　　　　但是这个花要想娇艳，美丽 ，离不开一个健康的花根 。　　　　那么花根在哪里呢 ？就是女人的卵巢 　　　　　　　　一个女人她所有的器官中，只有卵巢是最晚发育成熟的，却又是最早开始衰老的。 　　　　所以，一个女人如果想不衰老，一定要保护好自己的卵巢 。　　　　　　　　但是在现实生活中 ，卵巢不但容易衰老、更容易生病 ！　　　　 　　　　卵巢的主要功能不只是分泌卵泡，形成为成熟的卵子 。　　　　在完成生育的大任之后，她还有更重要的功能，那就是她分泌的三种激素　　　　第一，雌激素 　　　　　　　　应该说女人的一生是卵巢的一生，因为，卵巢分泌的最多的一种激素就是雌激素 　　　　我们所说的内分泌，荷尔蒙，指的都是雌激素的衍生功能 。　　　　　　　　大家都是搞美容的，应该知道，一个女人要想年轻，不长皱纹，靠的是什么 ？　　　　　　　　就是雌激素！因为雌激素是合成胶原蛋白的一种酶；而胶原蛋白是维持细胞形状的唯一物质。 　　　　　　　　当我们体内的自由基越来越多，就会破坏掉大量的胶原蛋白，而如果这个时候，你的卵巢功能已经开始衰退，分泌的雌激素不足了，那么后果可想而知，就会产生胶原蛋白链的断裂 ，可怕的皱纹就会产生了！ 　　　　所以无论男人，女人，不管你保养的多么好 　　　　谁都逃脱不了皱纹的困扰 ，那么今天水肤兰的诞生，至少可以延缓女人的衰老在20年以上 　　　　　　　　那么雌激素减少的一个最主要的表现就是 　　　　不知道大家有没有发现 ：当你们还是小姑娘的时候，你们对什么都感兴趣，每天好像有很多精力 ；但是随着年龄的增长 ，对什么都不是很感兴趣了。 　　　　　　　　有好姐妹说，逛街去 ！你说没劲累！ 看电影去， 没劲，还不如在家看电视呢 ！人就会变得很懒 ，就是雌激素下降的缘故。　　　　雌激素参与我们人体八大系统，800多个器官的正常运转那么雌激素随着年量的增长，也不是一定会下降的 ，也有增多的 。增多了，可就不好了，人就会向疾病的方向发展了 。　　　　　　　　所有的乳腺增生啊，卵巢囊肿啊，子宫肌瘤啊，妇科的癌症啊，都跟增多有关，所以女人千万不能随便乱补充雌激素，你一定要确切的知道自己的雌激素有没有减少。 　　　　　　　　如果不少你补了，那可就是肚脐眼拔火罐——没病找病了！　　　　 　　　　卵巢还分泌的一种激素就是孕酮激素，它是干什么的呢？ 它一方面促使女性的子宫内膜破裂，就是例假。同时还是一种保胎药；如果量大量小，都会导致流产 。 同时还控制着月经的量，所以当有一天你发现自己没有来例假，一定是孕酮激素的问题。 　　　　　　　　当有一天你发现，亲戚再也不光临了，跟你断交了，你就会心中烦闷了！ 　　　　你说这女人啊，真麻烦 ：来例假吧，烦 ，不来吧 更烦 ！因为一旦不来了，就说明你已经步入了老女人的行列了。　　　　那么卵巢分泌的最后的一种激素，就是雄性激素。 　　　　之前我在讲课的时候，好多人都会表示怀疑 ：女人会分泌雄激素吗 ？　　　　男人都可以分泌雌激素 ，女人为什么就不能分泌雄激素呢？ 　　　　而且，你千万不能小看了雄激素，她是决定一个女人一生性福的最重要的东西。　　　　因为雄激素的功能其一是掌管我们的毛发 ，我们的头发，眉毛，腋毛等等；　　　　女人除了捣鼓脸以外，最爱折腾的就是头发 所以当女人的雄激素不足以后，头发的质量就不好了 。　　　　那么雄激素更重的功能就是掌管女人的性欲 ，有 大概20%左右的女人会因为雄激素减少而患上性冷淡 。这是很可怕的 　　　　　　　　而一般这样的女性一般是在30岁左右 。　　　　大家都知道有这样一个说法“三十如狼，四十如虎 ”　　　　女人如果得了性冷淡 ，那么男人怎么办啊 ？　　　　你让他憋着吗 ？不可能！ 　　　　　　　　男人的花花肠子就是在这个时候被逼无奈的形成了 ，一旦当男人的出轨行为形成习惯了那么就很糟糕了！ 　　　　你放心这样的男人一定不会喜欢上别的女人 　　　　但是又有几个女人可以睁一只眼，闭一只眼呢 ？所以我发现我们的美容院院长有很多都是已经离异过了，或者现在都独身 。因为我们就不平衡 ，我那么努力地挣钱 ，你们臭男人还在外面胡搞乱搞 。　　　　　　　　但是姐妹们，今天我告诉今天我告诉大家，我们一定要找找咱们自己身上的不足。　　　　　　　　到底原因出在哪里 　　　　　　　　以前我们老说一句话，要想留住男人的心，先要留住男人的胃 。我告诉你这句话早就过时了 ，我想说的是，不是男人太花心，而是女人没缩阴 ，一个是，女人生完孩子，很自然的就会产道的松弛 ，再者，由于年龄的关系，产道也会松弛 ，夫妻的性生活再也不可能像没生孩子之前那么和谐，那么激情了！ 　　　　那么这个时候，男人就会抱着，很好奇的心理，想尝试一下别的女人是不是跟自己的老婆不一样的心理，开始跃跃欲试 所以，我再次呼吁：我们要把中国的离婚率降到最低 　　　　　　　　那么首要的就是夫妻的性生活要和谐，把婚后出轨率降到最低 ，靠的也是和谐的夫妻性生活 。而在同类的缩阴产品当中，几乎没有可以达到彻底根治的。 　　　　　　　　而咱们的水肤兰，只要你会使用上一年，我就可以保证你达到没有生小孩的状态 。　　　　就这三个功效 ，大家说是不是所有的女人几乎没有拒绝它的理由？ 　　　　　　　　那么第四个，就是美容养颜，祛斑止痘　　　　第五个是，预防和治疗妇科疾病　　　　第五个大家一定要把他的功能弱化 。　　　　为什么这么说呢 　　　　是不是咱们的产品治疗的效果不好啊 ，不是 ！　　　　　　　　我们的产品对于妇科疾病有三个特点 　　　　　　　　第一，100%安全 ！第二，100%有效，第三，100%治愈！ 　　　　那朋友们可能就问了，既然咱们有这么大的把握，为啥不让宣传治疗的效果呢 　　　　　　　　妇科疾病多么得多啊 ，是的，但是我告诉你 ，我们的美容院是干什么的地方？ 　　　　　　　　不是治病的地方 ，是给人制造美丽的地方　　　　如果你硬要宣传治疗的效果 ，那么我帮你分析一下你家的人群 ：　　　　　　　　第一 种，你家一定会有一些人，告诉你，我妇科非常健康，啥病也没有 。　　　　　　　　那么你怎么办？这个顾客是不是就不会使用咱们的产品了。 　　　　　　　　那么还有一种人，也知道自己有病，但是他不相信你，因为你不是学医的，所以你不专业， 　　　　他们会相信医院，宁可，做手术，挨刀，人家也认 。这类人也不会用上你的产品。　　　　　　　　那么好了，还剩下一小部分人，也承认自己的妇科不好，也不想去医院，但是他一定会问你，我现在有2度的宫颈糜烂 　　　　　　　　用几盒能好啊 ？你说我们能承诺她几盒能好啊 ？再说了就算10盒全都好了 ，那么他也不可能在使用了。那么水肤兰在你家根本就走不上量来。　　　　因为中国人固有的观念就是，既然能治病，肯定是药。 　　　　 　　　　今天咱们感冒了，我们可以吃药，但是感冒好了，还会在吃药吗 ？不会 ！　　　　所以，大家不能在宣传治疗的效果了 ，一定要以保养的效果为主。 　　　　那么剩下的就是产品的安全性的问题 。　　　　　　　　很多顾客包括我们美容院的院长，美容师都会问到这个问题 　　　　毕竟是往咱们的私密花园放的，万一有副作用怎么办？ 　　　　　　　　告诉大家，这个产品的安全性非常高，比我们美容院的任何产品都安全， 　　　　比我们的水，洗面奶都安全！ 　　　　因为首先，她拿到了美国FDA的认证 ，这个组织是国际上最权威的对于食品的安全级别的认证 。　　　　可以说他们认证完的产品都是100%的安全，比我们喝的矿泉水都安全 ！　　　　　　　　大家说，今天我们吃的米面，蔬菜水果是不是含有少量的化肥和农药 ，但是我们是不是也顿顿都在吃？ 　　　　　　　　但是这些中国产的东西是不可能拿到FDA的认证的 ，但是我们的水肤兰的原材料都是从国外进口过来而在我们国内灌装的 ，所以，我们的产品非常安全。　　　　那么第二个方面的安全性是，她的几种成分 　　　　虽然纳米银属于金属，但是也是纯天然的，没有任何杂质的 。　　　　其他均为纯植物的提取物，所以对人体没有任何的副作用。 　　　　第三个方面的就是他是全世界范围内唯一的一款纯物理疗法的产品，而不是化学疗法 。　　　　　　　　纳米银起作用的原理，在咱们的包装盒上都有，我就不多讲了 。金属银的特性是不被人体真正的吸收，他还会再排出来，所以，我们需要每天使用。 　　　　　　　　第四个方面，连孕妇都可以使用。　　　　大家想一下，连孕妇都可以使用，这个产品有多安全？ 　　　　第五个方面是不进入血液循环，不参与新陈代谢！ 　　　　　　　　我们的产品是透皮吸收的，所以也只在皮肤层停留 ，那么我们的产品可以非常有效地预防各种性病，但是却不治疗性病，就是这个原理。但是告诉大家，我们的产品可以治疗尖锐湿疣，别的性病都不治疗。　　
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