乙型肝炎病毒表面抗原和含有这些抗原的杂种抗原的制作方法
专利名称乙型肝炎病毒表面抗原和含有这些抗原的杂种抗原的制作方法
技术领域本发明涉及乙型肝炎病毒抗原和含有这些抗原的杂种抗原，以及利用DNA重组技术将上述抗原的编码基因克隆到酵母中。
A.乙型肝炎疫苗乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的和大范围内的有关键康的问题。感染可从急性或慢性阶段显示出来。在美国，急性肝炎病例的数量估计每年至少100，000例，死亡率达1-2%，取决于年龄及社会层次，在康的成人中，乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带者的普遍程度在0.1-1.0%之间。在南美，MBV慢性携带者约为1-3%，在苏联和南欧，约为3-6%，而在亚洲和非洲则高于10%。
在发达国家中，存在着为有高度受传染危险的人们提供疫苗的需求，例如病人和医疗单位接触血液的全体人员、军人、慢性病毒携带者的配偶，到高HBV地方性流行区域去的旅游者，慢性病毒携带者的新生婴儿，同性恋者，娼妓和吸毒者。在第三世界国家中，也需要一种能够用于公众免疫的便宜的设备。公众免疫项目，不仅能够最大地影响急性肝炎的发病率和慢性肝炎病毒携带者的数量，而且还能够减少慢活性的肝炎和肝癌的发病率及死亡率。
从传染的病人身上分离出来的戴恩(Dane)颗粒，据信为乙型肝炎病毒颗粒，其直径约42nm。每一颗粒都是由一个以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)构成的包膜，一种外壳(HBcAg)，一种由内源多聚酶和一个DNA基因组组成的。它的基因组是环状和双链的具有一个含有约200个碱基的单链区域。在体外，借助于内源多聚酶作用，能把单链区域补齐。较长的链含有约3200个碱基。
长期以来，由于人们知道很难在组织培养中繁殖病毒，并且认为人是唯一已知的寄主，所以制备HBV疫苗是困难的。然而在实验室中黑猩猩也可以被此病毒传染。
Valenzuela等人(Nature，298，347-350，1982)报导在酵母中使用一种表达载体进行了HBsAg的生物合成。载体中HBsAg编码序列是一个835碱基对(bP)的TaqⅠ-HpaⅠ片段，并且其启动子是酵母醇脱氢酶Ⅰ的启动子。几个早期简短报告提及到以前这方面的研究工作，这些是Valenzuela等人(Arch.Biol.Med.Exp.(Chile)，14(1)21-22，1981)报导了在酵母中把一个含有编码与HBsAg相似的蛋白的序列连接到酵母醇脱氢酶启动子区域的DNA片段进行表达;在〔Scrip.No.616.P14(Aug.12，1981)〕中的一个报导述及一个美国研究小组(包括P.Valenzuela和W.J.Rutter在内)已经宣布，从酵母中制备了“蛋白外壳包围的乙型肝炎病毒”;并且Zuckerman(Nature.295，98-99，1982)报导了W.J.Rutter已经报导了糖基化的HBsAg在酵母细胞中的表达。
据报导，HBV的抗原组成成份，如HBsAg已经通过插入一个含有该抗原的编码基因的重组DNA分子，从细菌中制备出来了。Burrell等人(Nature，279，Number.，1979)报导克隆于质粒PBR322中的HBVDNA序列在大肠杆菌(E.coli)HB101中得到表达。
Murray等人在欧洲专利申请公布，第13，828号，1980年(EuropeanPatentApplicationPublicationNumber13，828，1980)中公开了，在大肠杆菌HB101菌株中制备了一种能够为含有HBsAg的HBV抗原编码的重组载体。此载体是从戴恩颗粒(Dane)DNA和质粒PBR322制备出来的。作者指出，虽然在应用中做为范例只用大肠杆菌做寄主，但可使用的寄主还包括细菌，酵母，其它真菌，动物或植物细胞以及其它寄主。
Charnay等人(Nature，286，893-895，1980)报导了一种携带β-半乳糖苷酶基因HBsAg结构基因的融合体的噬菌体的构建。该噬菌体直接合成一种由HBsAg和β-半乳糖苷酶的抗原决定簇组成的融合蛋白。
Tiollais等人在英国专利申请No.2，034，323公开制备了一种含有HBVDNA的大肠杆菌噬菌体。融合的噬菌体一HBVDNA被转化到大肠杆菌C600菌株中。
在英国专利申请2，070，621号中公开了一种质粒是由部分HBsAg基因和启动子以及乳糖操纵子的Z基因组成的，并且可以被克隆到大肠杆菌中。
Rutter等人在欧洲专利申请公布No.20，251，1980公开了含有一种由质粒PBR322和HBVDNA的BanHⅠ酶切片段构成的一些重组载体可被用于转化大肠杆菌。另一种由HBVDNA的BamHⅠ酶切片段以及色氨酸操纵子的一部分组成的载体，也曾在大肠杆菌HB101菌株中得到表达。
Edman等人(Nature，291，Number6，1981)描述了一些质粒的构建，在色氨酸操纵子调控区域的控制下，这些质粒在大肠杆菌中直接合成了一种β-内酰胺酶一HBsAg融合蛋白。
Pumpen等人(Gene，30，201-210，1984)公开了在大肠杆菌中合成了少量的HBsAg单体蛋白和一些融合蛋白。且用变性HBsAg单体诱导产生的抗体进行检测。
其它文献公开了HBVDNA插入到细菌中，包括Charnay等人(Prog.Med.Virol.27.88-92，1981);Mackay等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.78.No.7，，1981);Fritsch等人(C.R.Acad.Sci..287.No.16，);英国专利说明书2，034，323(DerwentNo.46874C)和Pasek等人(Nature.282，No.6，575，1979)。
HBVDNA还被克隆到哺乳动物细胞中，这些细胞包括人类，小鼠和人类癌细胞系。例如Dubois等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，77.No.8，，1980)报导了用含有HBV基因组质粒进行的小鼠细胞的转化和HBsAg的表达;Hirschman等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，77.No.9，，1980)报导由HBVDNA进行转化的HeLa细胞产生了一些类HBV的颗粒。
Funakoshi等人(Prog.Med.Virol.，27，163-167，1981)以及Maupas等人(Prog.Med.Virol.，27，185-201，1981)报导了使用来自人血液的HBsAg制备HBV疫苗的步骤。Funakoshi等人制备的疫苗含有40μg纯化的、福尔马林处理的HBsAg，磷酸盐，氯化钠，20mg甘露醇，且用0.1%的氢氧化铅作为佐剂。在以后的文献中Maupas等人报导一个剂量的疫苗是1ml纯化的、福尔马林处理的HBsAg含有2-10μg/ml的蛋白(Lowry方法)和0.1%氢氧化铝。Maupas等人的研究报导中使用的方案，即免疫一年以后，用注射器以一个月为间隔注射二次进行强化;一些作者们提出了一种以三个月为间隔注射二次浓缩的HBsAg的方案。
另外有关制备HBV疫苗的文献包括Maupas等人，Adamowicz等人;Funakoshi等人，分别在Maupas和Guesry，1981年编写的“乙型肝炎病毒INSERM专题讨论会No.18(Elseriver/North-HollandBiomedicalPress)中的第3，37和57页上。
酵母已经被用来作为某些其它非HBVDNA序列表达的寄主，例如Fraser等人在英国专利申请第2，068，969号中公开了在酵母中制备鸡卵清蛋白，(ScripNo.640，P.11Nov，4，1981)有一篇关于在酵母中制备了一种类型的干扰素的报导。在欧洲专利11，562(DerwentNo.38762C)中报导了含有2μ质粒中的ura酵母基因的杂种酵母质粒。
真正的乙型肝炎病毒表面抗原可以从被传染的个体的胞浆中发现，是一种大约22nm的颗粒，由两种已知为P24蛋白和它的糖基化衍生物GP28组成。此两蛋白认为是S蛋白密码序列的位于HBV基因组上的226个氨基酸密码序列来编码的。直接位于HBV基因组上的S蛋白密码序列前的全部163个氨基酸密码序列被划归为PreS密码序列。直接位于S蛋白密码序列前的PreS密码序列的55个氨基酸被划归为PreS2密码序列，而PreS密码序列剩下的108个氨基酸则划归为PreS1密码序列。PreS密码序列或任何较小区域都划归为HBsAg前体蛋白序列。
从整体上讲，应注意到对于某些HBV亚型(如，ayw)，完整的Pre S密码序列是163个密码子，而对于其它HBV亚型(如adw2)，完整的Pre S密码序列是174个密码子。在此两种情况下，Pre S区域是直接位于S蛋白密码序列前的55个密码子。
从戴思(Dane)颗粒表面和从HBV传染的病人血清中分离到的一些HBsAg颗粒表面上发现的多聚清蛋白偶联或受体位点是由PreS2密码序列编码的。虽然PreS2区域直接位于HBV基因组上的S蛋白密码区域前，但是PreS2区域不涉及HBsAg颗粒的装配。参看，例如Persing等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，，1985)。
Valenzuela等人(Nature，298，347-350，1982)公开了在含有S蛋白密码序列的载体转化的酵母细胞被裂解之后，发现了一些类似于HBsAg的颗粒，并得出结论HBsAg颗粒是在酵母中合成的。
Harford等人(DevelopmentsinBiologicalStandardization，54，125-139，1983)公开了用一种载体转化酵母细胞裂解之后，发现了一些类似于HBsAg的颗粒，此载体含有直接位于S蛋白密码序列前的PreS2密码序列的N-末端42个氨基酸直接前面的鸟氨酸甲酰基转移酶编码序列的18个氨基酸。
Laub等人(J.Virology.，48(1).271-280，1983)公开了包括PreS-S蛋白编码序列的大部分HBV基因组DNA的猴病毒40(SV40)的早期取代载体的构建，和由这载体转化的CV-1细胞(COS细胞)转化的SV40中此部分的表达。
Stibbe等人(J.Virology.46(2)，626-628，1983)公开了一些较小的被称做GP33和GP36的HBsAg多糖蛋白是由PreS2-S蛋白编码序列编码的。Stibbe等(Dev.Biol.Stand.，54，33-43，1983)公开了与几乎缺失GP33和GP36的那些HBsAg颗粒相比，含有大量GP33和GP36的HBsAg颗粒并没有导致较高的抗S蛋白抗体的滴度。
Heerman等人(J.Virol.52(2).396-402，1984)公开了S蛋白编码序列和PreS密码序列组成的全部389个氨基酸编码序列是为多肽-P39编码的，而P39是以在HBV颗粒和病毒表面抗原丝中的其糖基化的形式GP42和与多肽P24，GP27，GP33和GP36相关的其它的HBV表面抗原形式被发现的。
Neurath等人(Science，224，392-394，1984)公开了具有PreS2密码序列的26氨基末端氨基酸序列的多肽作用为免疫原，并且假设，由免疫原诱发产生的抗体可以被用来进行特征实验。
Michel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81.，1984)公开了HBsAg的生物合成，而HBsAg具有由携带PreS2-S蛋白编码序列质粒进行转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中人血清多聚清蛋白的接受子。
Persing等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82.，1985)公开了用PreS2-S蛋白编码序列转化的小鼠L细胞产生三种与多肽(24，000，27，000，和35，000道尔顿)相关的HBsAg。而这三种HBsAg都可以被列为直径22nm，偶联到聚合的人血清清蛋白(HSA)上的复杂免疫反应的HBsAg颗粒类型中。经受了PreS2区域接近3′末端移码突变的PreS2-S蛋白编码序列转化的小鼠L细胞，只能产生能被列为不能偶联HBA的22nm直径免疫反应HBsAg颗粒类型中的24，000和27，000道尔顿的多肽。Persing等人得出结论PreS2-S蛋白密码序列为35，000道尔顿多肽编码，而认为HBsAg的HSA偶联活性需要PreS2蛋白，而对于HBsAg颗粒的装配和分泌是不需的。还认为HBsAg的主要多肽(如24，000道尔顿)并不是由PreS2-S蛋白编码序列所编码的前体物(如27，000和35，000道尔顿肽类)的剪切初步衍生而来的。
Milich等人(Science，228，，1985)公开了由含有Pre S2-S蛋白密码序列的质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞制备的含有Pre S2和HBsAg的包括HBV颗粒的疫苗，与只含有HBsAg的疫苗相比，对于某一种小鼠能够避免不反应性的发生。而且认为，由Pre S2-S蛋白密码序列的33，000道尔顿多肽的NH2-末端的26个氨基酸残基代表了Pre S2区域上的抗体优先偶联位点。
Michel等人“疫苗86”(Vaccines86)见Brown等人主编，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory(1986)，359-363。讨论了含有PreS区域表达产物的乙型肝炎病毒表面抗原颗粒在CHO细胞中的生物合成。
Neurath等人(Nature，315，154-156，1985)公开了PreS2区域为被肝细胞特异识别区域的HBV外壳上的蛋白编码;PreS2-S蛋白密码序列为HBV颗粒中的一种蛋白编码;与编码PreS蛋白基因相关的合成的肽是致免疫的，并得出结论，HBV疫苗应含有PreS因子。
Valenuzela等人(Biotechnology，3.317-320，1985)公开了用这种密码序列进行转化的酵母中完整PreS2-S蛋白密码序列的表达;还公开了在这种酵母细胞中合成了一种含有HBsAg和PreS2的颗粒，此颗粒的电子显微镜学和沉积作用的性质与只含有HBsAg的颗粒非常相似。还提出PreS2区域不影响形成类似于22nmHBsAg颗粒的那一种颗粒的能力。Valenzuela等人还公开了已经假设，通过偶联多聚清蛋白到其多聚清蛋白受体上，而受体又依次偶联到肝细胞上而使HBV基因进入肝细胞，这样病毒得到内在化(internalized)，并且HBV的多聚清蛋白受体是由PreS2区域编码的。Valenzuela得出结论含有PreS2的疫苗将会诱导抗体的产生，另外通过常规机制使HBV失活，此抗体能够影响病毒进入肝细胞的途径。
TakedaChemicalInd.KK在欧洲专利申请公布号171.908-A中声称，在酵母中进行了非糖基化的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白的生产。
Chiron公司，欧洲专利申请公布号0，174，444A2提出一种从酵母中制备一些含有P31蛋白的HBsAg颗粒的方法。
下述表Ⅰ对已知的PreS2区域的氨基酸序列与发明题目中的HBVPreS2区域氨基酸序列进行了比较表1HBV的不同血清型PreS2区域的氨基酸序列比较HBVPreS2编码区域亚型-55-50-40-30-20-100参考adwMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSARTGDP编码序列adwTLI1adwLLII2adw-I3adwKI4adrTLVTTPIFSAP5adrTLVTTPISAP6aywTTVLTTPLIFSIAL7adywHTTVTTTPIFSIAL8
氨基酸缩写符号AspD天冬氨酸IleI异亮氨酸ThrT苏氨酸LeuL亮氨酸SerS丝氨酸TyrY酪氨酸GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸ProP脯氨酸HisH组氨酸GlyG甘氨酸LysK赖氨酸AlaA丙氨酸ArgR精氨酸CysC半胱氨酸TrpW色氨酸ValV缬氨酸GlnQ谷氨酰胺MetM甲硫氨酸AsnN门冬酰胺参考文献1.Valenzuelaetal.，InAnimalVirusGenetics(Field，JaenischandFoxeds)p.57-70，AcademicPress，NewYork(1980).
2.Chowetal.，FourthAnnualCongressforRecom-binantDNAResearch，SanDiego，USA，1984.
3.Fujisawaetal.，Nucl.AcidsRes.，11，83).
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5.Fujisawaetal.，citedabove.
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7.Galibertetal.，Nature，281，646-650(1979).
8.Paseketal.，Nature，282，575-579(1979).
B.疟疾疫苗最近大量研究提出在一个被疟原虫(Plasmodium)的某一种的子孢子阶段侵染的敏感寄主中的保护免疫可以通过此寄主产生的抗体传递到某一子孢子的环状体蛋白(CS蛋白)。
几种类型的疟原虫的子孢子蛋白已被克隆出来，并且其中一些已通过重组DNA技术表达出来。
Nusserzweig等人(U.S.专利4，466，917)公开了一种子孢子多肽，鉴定为P-44蛋白，克隆到大肠杆菌中并表达。
Sharma等人(Science，228，879-882，1985)公开了在酵母中通过使用含有酵母醇脱氨酶I基因的5′调节区域代替诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)cs基因序列的5′上游区域的表达载体表达了诺氏疟原虫的一部分cs蛋白。
纽约大学PCT申请公布号WO84-02922-A发表了为诺氏疟原虫环状体蛋白重复单位编码的一部分编码序列的克隆及β-内酰胺酶和β-半乳糖苷酶融合体在大肠杆菌中的表达。
Kemp等人，PCT专利申请公布号WO84-02917-A公开了来源于恶性疟原虫的血液生长阶段的cs蛋白的编码序列克隆到大肠杆菌中并表达。
Dame等人(Science，225，593，1984)公开了恶性疟原虫cs蛋白克隆到大肠杆菌中并表达，此蛋白质被描述为含有分子量近44，000的有约412个氨基酸的蛋白质。它由41个四肽的串联重复组成。合成的那种结合于单克隆抗体上的重复区域的7-，11-和15-残基肽能抗cs蛋白。
Ellis等人(Nature，302，536-538，1983)公开了在大肠杆菌中β-内酰胺酶与诺氏疟原虫cs蛋白融合的表达。
Enea等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，，1984)公开了在一种疟原虫(P.cynomolgi)cs蛋白中的类似的重复单位结构，cs蛋白克隆到大肠杆菌中并表达，并公开了它的编码序列。
Ballou等人(Science，228，996-999，1985)公开了结合到牛血清蛋白(BSA)或产生抗体的甲状腺球蛋白上的恶性疟原虫cs蛋白重复区域的合成多肽，可以在小鼠及兔子体内产生应答。并推断出抗疟疾寄生虫子孢子阶段的疫苗能使用结合到载体蛋白的cs蛋白重复区域的合成肽来完善。
Weber等人(MolecularandBacterialParasitology，15，350-316，1985)公开了把恶性疟原虫(P.galciparum)的巴西菌株的克隆了的cs蛋白基因作为一种探针通过核酸杂交来分析其他17株恶性疟原虫的结构，并推断cs蛋白基因是高度保守的，用cs蛋白的疟疾疫苗的发展不会由于菌系的变化而复杂化。
Arnot等人(Science，230，815-818，1985)公开了间日疟原虫(P.vivax)的cs蛋白的克隆，并且公开了其全部编码序列，并推断间日疟原虫的cs蛋白编码序列和诺氏疟原虫的cs基因同源，但和恶性疟原虫不同源。
Sharma等人(Science，229，779-782，1985)公开了诺氏疟原虫的Nuri菌株的cs基因编码区域的全部核苷酸序列。
Young等人(Science，228，958-962，1985)公开了具有潜在应用于人类疟疾疫苗的恶性疟原虫cs蛋白在大肠杆菌中的表达。
Walter和ElizaHall医学研究所PCT专利申请公布号WO84/0公开了人工构建的多核苷酸序列大体上与所有或一部分恶性疟原虫mRNA或基因组DNA相对应;对应这种序列的肽和它的生产方法;在含有这种肽的脯乳动物中为刺激抗恶性疟原虫这一抗原的免疫反应的组分。
Mazier等人(Science，231，156-159，1986)指出在用恶性疟原虫环状体蛋白的几种重组和合成肽免疫了的老鼠中产生的抗体由于在人肝细胞培养系中的保护活性而受到评价，并发现此抗体显示出对抵御寄生虫在三个阶段有保护效果子孢子吸附到肝细胞表面，进入，以及以后向胞内发展。
c.多价疫苗Valenzuela等人(Biotechnology，3，323-327，1985)公开了把由PreS2编码序列所编码的HBsAg多聚白蛋白受体用作一种工具来制备多价疫苗。Valenzuela等人也公开了由酵母中表达杂交体HSV-1gD-PreS2-S蛋白编码序列制备杂种HBsAg一疱疹单式1病毒糖蛋白D(HSV-1gD)粒子。
Valenzuela，在“使用重组DNA技术乙型肝炎亚基疫苗”文中，5月15日，在BostonMassachussetts召开的Bio-Expo-5-会议，报导用如以上所述的HBsAg-HSV-1gD粒子这样的杂种，有一个出现在其表面的外部免疫源上的HBsAg免疫优势的问题。
Chiron公司，欧洲专利申请公布号0，125，261声称含有融于一个或多个寡肽的乙型肝炎表面抗原至少一个主要部分的杂交粒子，在那里杂交多肽能在细胞寄主内形成粒子，有至少一个寡肽的至少一个抗原决定簇出现。
蛋白质能够经过翻译后的修饰，使其中一些蛋白深深地受到影响，即影响蛋白质的构象和功能。在人体中寡糖链的存在衍生出PreS1-PreS2-S和PreS2-S蛋白(Heermanetal，inJ.Virol.，52，396-402，1984;StibbeandGerlichinVirology，123，436-442，1982;StibbeandGerlichinJ.Virol.，46，626-628，1983)，可能PreS1-PreS2-S蛋白上的豆蔻酸(Persingetal.，Abstractsofpaperspresentedatthe1986meetingonMolecularBiologyofHepatitisBviruses，August28-31，1986，ColdSpringHarborLaboratory)的存在能影响粒子的形成及粒子中蛋白质的构象以及这些粒子的抗原性和免疫原性。
酵母(Saccharomycescerevisiae)也具有类似于高等真核细胞的蛋白质糖基化(Ballou，“TheMolecularBiologyoftheYeastSacch-aromyces，MetabolismandGeneExpression”;Strathern，JonesandBroachEd.，ColdSpringHarborLaboratory(1982)，P.335-360)和脂肪酸酰化作用(TowlerandGlaslerinProc.Natl.Acad.Sci.，83，，1986)的酶作用能力。
已经发现，在酵母中表达的病毒表面糖蛋白被糖基化了，Jabbar等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，82，，1985)指出流感病毒血细胞凝集素基因在酵母中的表达导致了糖基化的血细胞凝集素蛋白。Wen和Schlesinger(Proc.Natl.Acad.Sci.，83，，1986)指出Sindbis和疱状口炎病毒糖蛋白在酵母中以糖基化形式表达这些病毒蛋白。Fujisawa等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses，Auguest 28-31，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.62)指出Pre S2-S基因在酵母中的表达导致了Pre S2-S蛋白两个糖基化形式的合成。Kniskern等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Modern Approaches to New Vaccines，Including Prevention of AIDS，September 9-14，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.89)指出Pre S1-Pre S2-S基因在酵母中的表达导致了45KD和39KD的两个Pre S1-Pre S2-S蛋白的合成。Persing等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses，August 28-31，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.19)指出用3H豆蔻酸标记的表达Pre S1-Pre S2-S，Pre S2-S和S蛋白的COS7细胞导致在Pre S1-Pre S2-S蛋白上存在标记。
在酵母中表达并在粒子中重新组装的融合蛋白可以用普通的方案纯化Aerosil的吸附作用和解吸附作用(1)→CaCl沉淀作用(2)→苯基琼脂糖或苯基硼化-琼脂糖的吸附作用和解吸附作用(3)→CsCl梯度离心或DEAE-离子交换色谱。
在EP申请公布0204680号中描述了第一步，在EP申请公布0199698号中描述了第3步。至于苯基琼脂糖也提到了。第(1)步和第(3)步的特殊联合可以完成快速的污染物清除。(排除达90%蛋白质，碳水化合物和50%的脂类)。这种新的联合使下一步色谱更好地发挥作用成为可能。
在融合蛋白被糖基化的例子中，苯基硼化物(PBA)被用作为一种亲和吸附剂。在pH9.0微，硼化物基团同糖基化了的侧链上的潜在顺-二醇基团共价化合。PBA凝胶偶尔被用于可溶糖蛋白的纯化但不用于镶嵌于脂双层的糖蛋白的粒子的纯化(See，Cook，etal.，AnalyticalBiochemistry，149，349-353，1985;Middle，etal.，BiochemicalJournal，209，771-779，1983;Cook，etal.，BiochimicaetBiophysicaActa，828，205-212，1985;Maestasane，etal.，JournalofChromatography，189，225-231，1980)。由于粒子上的多配住体连接位点，可使用非常低PB-配位体浓度的PBA凝胶，例如含硼化物(boronate)的PBA凝胶＜10ug/ml凝胶，最好是5ug硼化物/ml凝胶。具有非常低硼化物含量的苯基硼化物凝胶的可用作含有镶嵌糖蛋白粒子的亲和层析。
本发明涉及和含有一步步融于乙型肝炎病毒PreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列的重组DNA分子。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”也包括任何它的功能衍生物。术语“功能衍生物”是指在适当的地方，不干扰粒子形成和/或在希望保留的地方保护免疫原性的有氨基酸改变的编码序列。这种功能衍生物可以用常规位点特异诱变来制备，如用Botstein等人的方法(Science，229，，1985)。这种DNA分子也含有一个来源于酵母arg基因的调节区域就更好。
本发明涉及含有有效地连结于调节区域的重组DNA分子的重组载体。在这个DNA分子中含有一步步融合于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列。此处用的术语“调节区域”指的是含有启动子区域和编码序列的转录和翻译所必需的其他序列的DNA序列。
本发明也涉及用重组载体转化的真核寄主细胞。在所谓的载体中含有有效地连接于调节区域的DNA分子，在所谓的DNA分子中含有一步步融合于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域功能DNA编码序列。这项发明也和制备这种含有用重组载体转化真核寄主细胞的转化寄主细胞的方法有关。
本发明也涉及制备含有HBsAg蛋白的杂种粒子的方法。这个HBsAg蛋白含有和/或代表一个功能DNA编码序列所编码的多肽，也包括在适当的培养基中培养用重组载体转化的真核寄主细胞和从细胞裂解产物或寄主培养液的提取液中分离粒子。在所谓的载体中含有有效地连接于调节区域的DNA分子，在DNA分子中含有一步步融于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列。
本发明也涉及含有乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)粒子的杂种致免疫粒子。HBsAg粒子含有和/或代表一个功能DNA编码序列所编码的肽。
本发明也涉及含有这种杂种粒子的免疫保护量的疫苗。
本发明也涉及含有杂种粒子及多价吸附剂(polysorbate)的胶团，和含有这种胶团的免疫保护量的疫苗。
术语“功能DNA编码序列”是指一段DNA编码序列，它在一步步融合于DNAPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域时，不涉及，也不干扰HBsAg粒子的组装。
较好的功能DNA编码序列包括，但并不限制于(a)整个HBVPreS蛋白编码序列，或它的致免疫衍生物，比如，不限制于，PreS2，PreS1或PreS1-SPreS2蛋白编码序列;和(b)其他的致免疫编码序列列，诸如疟原虫的环状体蛋白编码序列，或任何它的致免疫衍生物，HIV的包膜基因编码序列，或任何它的致免疫衍生物，特别是C7肽，肽121或Dreesman肽编码序列或它的一个致免疫衍生物。
本发明也涉及编码以下氨基酸序列的HBVPreS1蛋白编码区域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIleProCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGly
AGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla或涉及HBVPreS2蛋白编码区域，或涉及在它的PreS2部分中为以下氨基酸编码的HBVPreS2-S蛋白编码区域-55-50Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40-30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Aa也涉及含有这种有效连接于调节区域的PreS1，PreS2或PreS2-S蛋白编码区域的重组DNA载体;同含有这种载体的转化寄主细胞;同这种含有用此载体转化寄主细胞的转化细胞的制备过程;同这种编码区域编码的蛋白质;同制备这种蛋白质的过程;同含有这种蛋白质免疫保护量的疫苗;同这种PreS2-S蛋白编码区域编码的粒子;同准备这种粒子的过程;同含有这种粒子免疫保护量的疫苗，和含有这种粒子和多价吸附剂的胶团，以及含有这种胶团免疫保护量的疫苗。
本发明也涉及重组DNA载体有关，这种重组DNA载体含有整个PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列，或它的有效连结于调节区域的致免疫衍生物，与用这种载体转化的酵母寄主细胞;与制备含有用这种载体转化的酵母寄主细胞的转化的寄主的方法;与制备蛋白的方法，这个蛋白是由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或由PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列，或由它的致免疫衍生物编码的;与用这种方法制备的蛋白质有关;与含有这种免疫保护量的蛋白质的疫苗有关;与含有多肽的粒子有关，这种粒子是由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列或它的致免疫衍生物所编码的;与它的制备方法，含有这种粒子的免疫保护量的疫苗，含有这种粒子和多价吸附剂的胶团以及含有这种胶团免疫保护量的疫苗有关。
本发明也同PreS1-PreS2蛋白编码序列或者是它的PreS1-PreS2部分含有以下氨基酸序列的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列有关PRE-S1区域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAsp
TGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIleProCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla
Pre-S2区域-55ATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAMetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGAlaLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGATyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTThrValAsnProAlaProAsnIleAlaSerCACATATCGTCAAGCTCCGCGAGGACTGGGHisIleSerSerSerSerAlaArgThrGlyGACCCTGTGACGAACAspProValThrAsn
这项发明也同含有新的有效连接于表达控制序列的PreS1-PreS2或PreS1-PreS2-S蛋白编码序列的重组载体有关，同用此载体转化的寄主细胞有关;同制备含有用载体转化寄主细胞的转化的寄主的方法有关;与制备PreS1-PreS2或PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或它的致免疫衍生物所编码的蛋白质的方法有关;与用这种方法制备的蛋白质有关;与含有这种免疫保护量的蛋白质的疫苗有关;与含有PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或它的致免疫衍生物所编码的多肽的粒子有关;与它的制备方法，含有这种粒子的免疫保护量的疫苗，与含有这种粒子和多价吸着物的胶团有关。
以下描述了用在这个申请中的氨基酸缩写符号Asp天冬氨酸Ile异亮氨酸Thr苏氨酸Leu亮氨酸Ser丝氨酸Tyr酪氨酸Glu谷氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸His组氨酸Gly甘氨酸Lys赖氨酸Ala丙氨酸Arg精氨酸Cys半胱氨酸Trp色氨酸Val缬氨酸Gln谷氨酰胺Met甲硫氨酸Asn门冬酰胺附图简要说明附图说明
图1是pRIT10601的限制性内切核酸酶图谱。
图1A是说明制备pRIT12662的流程图。
图1B是乙型肝炎病毒包膜区域的图解限制图谱。
图2是pRIT10616的限制性内切核酸酶图谱。
图2A列出了克隆λMPf1的图解限制图和序列分析策略。
图2B说明了质粒pRIT12893的结构。
图3是pMC200的限制性内切核酸酶图谱。
图3Aa、图3Ab、图3Ac、图3Ad、图3Ae、图3Af列出了恶性疟原虫的环状体蛋白基因的核苷酸序列。
图3B说明了质粒pRIT12897的结构。
图4是插入于质粒pMC200的酵母DNA的一部分3300bpHindⅢ核苷酸序列。在pMC200中一部分含有HincⅡ，BgⅢ和EcoRⅠ位点。
图4Aa、图4Ab列出了pRIT12792的含有PreS1-PreS2DNA编码序列。
图4B说明了质粒pRIT12899的结构。
图5是说明制备pRIT10671和pRIT10673的流程图。
图5A说明了质粒pRITX的结构。
图6是说明制备pRIT10749的流程图。
图7是说明制备pRIT10761和pRIT10764的流程图。
图8a、图8b、图8c是说明制备pRIT10167(例1)，pRIT10518和pRIT10162(例3);pRIT10157，pRIT10677和pRIT10909(例4);pRIT10911(例5);pRIT10679，pRIT10903，pRIT10914(例6);pRIT12211，pRIT12209和pRIT12230(例7);以及pRIT12288和pRIT12322(例8)的流程图。
图9是pRIT10172的限制性内切核酸酶图谱。
图10是pRIT12290的限制性内切核酸酶图谱。
图11是阐明它的一部分来源于pRIT12230和pRIT12288和pRIT12322的限制性内切核酸酶酶切图谱。
图12a、图12b是说明制备pRIT12571;pRIT12573;pRIT12572和pRIT12574的流程图。
图13是pRIT12309的限制性内切核酸酶图谱。
图14是说明制备pRIT12314和pRIT12544的流程图。
图15是说明制备pRIT12658的流程图。
图16是pRIT12662的限制性内切核酸酶图谱。
图17是说明制备pRIT12660的流程图。
图18是说明制备pRIT12845(a，b，c，d，e，f)的流程图。
HBsAg在酵母中的表达这里所用的“调节区域”是指含有一个为编码序列的转录和翻译所必需的或期望的DNA序列。这种调节区一般是处于5′端与要表达的编码序列相连。较好的是，含有转录终止信号酵母DNA的更远区域其位置紧接于要表达的3′编码区域，所以对转录终止有作用。
这里所用的“HBsAg”是指含有HBV基因组的S蛋白编码序列所编码的蛋白质的抗源。这个HBsAg，其结构类似于真正的HBsAg或者实质上有同真正的HBsAg一样的编码抗原决定簇的相同S蛋白编码序列，也就是说，它能促进特异地辨认真正的HBsAg和同真正的HBsAg反应的免疫反应，或者是它可被抗-HBsAg抗体所特异辨认。
HBsAg编码序列可以从感染了的人血清中的戴思(Dane)粒子提取出的DNA而分离得到。这种DNA是通过用DNA多聚酶，内源多聚酶更好，填齐单链区域，然后用限制性内切核酸酶消化而制得的。内切核酸酶的选择部分取决于特殊的戴恩粒子。比如，adw血清型的某种戴恩粒子的HBVDNA的HBsAg编码序列可以从一个单独的BamHⅠ酶解片段上分离得到;ayw血清的某种戴恩粒子的HBVDNA的HBsAg编码序列可以从HhaⅠ酶解片段分离得到。同样血清型的戴恩粒子的HBVDNA也显示了限制性位点的不同类型。
制备此发明中所用的DNA片段的DNA的限制性，制备此发明中所用的重组DNA分子的这种片段的的连接性以及插入到微生物中都是应用已知的技术诸如发表在前面和后面的标出的参考文献中的技术来进行的。选择避免DNA和酶变性的条件。比如，pH用缓冲液保持在7.0到11.0之间，温度保持在60℃以下。限制性最好在约30到40℃之间的温度进行，连接最好在0到10℃之间进行。在进行此发明中使用的限制内切酶和连段序列，它是一个或者保持或者提高天然序列的保护性致免疫活性的自然发生序列的衍生物或修饰的部位(version)。这种致免疫衍生物可以用常规的技术来制备。这里所用的术语“PreS2，PreS1，或整个PreS1-PreS2-S蛋白编码序列”包括它的任何致免疫衍生物。
术语“疟原虫的环状体蛋白”是指疟原虫子孢子上的免疫优势表面抗原或它的致免疫衍生物。有用的环状蛋白它包括，但不限制于那些来源于恶性疟原虫，间日疟原虫，卵园疟原虫(P.ovale)和四日疟原虫(P.malariae)的蛋白。恶性疟原虫、间日疟原虫、卵园疟原虫和四日疟原虫侵染人类。
在Science，225，593-599(1984)Dame等人报导了恶性疟原虫的cs蛋白编码序列。在Science，230，815-818(1985)上Arnot等人报导了间日疟原虫的cs蛋白编码序列。在Science，229，779-782(1985)上Sharma等人报导了诺氏疟原虫的cs蛋白编码序列。在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，84)上Enea等人报导了P.cynomolgi的cs蛋白编码序列。疟原虫的其他种的cs蛋白编码序列已为人所知(见上面提到的参考书)和/或可用常规的技术获得。
如这里所用的，术语“csp”或“cs蛋白”将包括疟原虫天然的、全长度环状体蛋白以及它的任何致免疫衍生物。术语疟原虫环状体蛋白的“致免疫衍生物”是指(a)保留保护致免疫活性的疟原虫环状蛋白的衍生物或(b)来源于保留保护致免疫活性的疟原虫环状体蛋白的修饰了的编码序列的蛋白质。这种致免疫衍生物可以用常规的技术来制备。一些恶性疟原虫的cs蛋白编码序列的致免疫合成衍生物在Ballou等人的文章中透露出来，Science，228，996-999(1985)。也可参看，Mazier等人.，Science，231，156-159(1986)。
疟原虫的各个种的cs编码序列是已知的并可用已知的技术来制备或分离。〔参看，如Colman等人，WO84-02922-A(恶性疟原虫cs蛋白)和来的氨基酸残基。
本发明的一个实施例是HBsAg，编码序列和HBsAg前体(Pre S-S)蛋白的42密码子在从arg3启动子所翻译的酵母OCT蛋白编码序列的第18个氨基酸之后一步步地融合。这样构想给适当的S-蛋白的226个氨基酸与含有包括另外的60N-末端氨基酸的HBsAg蛋白的杂种粒子。
一个典型的调节区域是从为鸟氨酸甲酰氨基转移酶(OCT)编码的酵母arg3基因中所得到的。arg3调节区域受特殊的和一般的调节机制二者的支配。据Crabeel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第78卷，6026页(1981)，报导，arg3调节区域已在质粒pYeura arg3上被克隆到大肠杆菌中。精氨酸生物合成途径被去阻遏的啤酒酵母(S.cerevisiae)株系，如1c 1697d株系，是较好的寄主。与DC5株系相比，使用这种株系导致源于arg3启动子的增强表达。其他有用的调节区域的例子包括了那些来源于糖酵解途径酵母基因的调节区域，如为烯醇化酶、醛缩酶、磷酸甘油酸激酶和3-磷酸-甘油醛脱氢酶编码的调节区域;酵母乙醇脱氢酶基因;以及，一般来说，涉及分解代谢中的基因，如精氨酸酶基因。
把融合了的DNA片段克隆到酵母中的较好的载体是质粒YEp13。它可在大肠杆菌和啤酒酵母两者中复制并保存。因此，被认为是一种穿梭载体。几种其他酵母载体也为人所知并可得到。HBsAg和调节区域可被连续地或自发地插入到酵母载体中。用含有在酵母中发挥作用的自主复制序列(复制子)的质粒载体的转化一般将会导致产生象质粒一样的此发明DNA分子的染色体外保留。这种复制子的得到需要技巧。用不含有在酵母中发挥作用的复制子的质粒载体的转化会导致产生DNA分子掺入到染色体DNA中。
根据此发明，促进保护免受HBV对人入侵的疲苗含有酵母所产生的HBsAg，用已知的技术可以制备合适的载体。希望使用一种佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝。这样生产出来的HBsAg也能与其他免疫原结合来制备接酶可以从市场上买到并应按产品的要求使用。TDNA连接酶是较好的连接酶。
各种片段和最后的结构可以按照常规的方法连接起来。在很多情况下，基因被分离出来，作限制性酶切图谱并测定序列。这样，人们可选择感性趣的的序列，如HBsAg序列，通过基因的限制性酶切，选用以后必需的操作步骤，如用Bal31进行酶切，体外诱变，引物修复，或类似的方法，从而提供期望大小，包括期望序列，且具有适当的末端的片段。衔接物和连接物可以用于连接序列，以及代替丢失序列，此处使用的限制酶切位点在感兴趣的区域内部。切开的各种片段可以通过电泳，电洗脱，与其他序列连接，克隆，重分离和其他操作进行纯化。
感兴趣的结构基团控制转录的调节区域的使用，如HBsAg序列，可能使寄主细胞达到生长高密度，但结构基因，如HBsAg基因，不表达或低水平的表达，然后再改变环境条件，如营养，温度等来诱导表达。
例如，含有GAL4调节区域，酵母细胞可以在有甘油-乳酸混合物的营养丰富的介质中生长到高浓度，如在对数中期或后期，然后转变碳源为半乳糖。另一个例子是，PHO5调节，人们可以在大约7mM KH2PO4的高岭酸盐浓度中生长细胞，然后使细胞重悬于缺乏磷酸盐的介质中得到恢复，以影响去阻遏和表达。由于温度敏感性，可使细胞在25℃到37℃间生长，然后改变温度约到5℃到20℃至合适。寄主细胞应该含有同所使用的调节区域相联系的调节系统。
把HBsAg序列融于调节区域可以通过使用中间载体来完成，或者是，HBsAg序列可以直接插入到含有调节区域的载体中。载体是可以携带并保持发明的DNA片段包括如噬菌体和质粒的DNA。例如，Charnay等人，Nature，第286卷，第893-895页(1980)和Tiollais，英国专利申请2，034，323公开了噬菌体中克隆DNA片段的技术。认为HBsAg序列与调节区域有关更好，这样，通过HBsAg序列表达合成的HBsAg就可免除外组合疫苗。HBV或组合疫苗可以例如通过皮下的、静脉内的或肌内途径来使用。这项发明的DNA片段和由此而产生的HBsAg也能够通过DNA杂交技术和各种免疫测定作为生物样品中HBV测定的探针。
含有逐步融合于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列的DNA分子的表达本发明也同含有逐步融合于HBV Pre S2-S蛋白编码序列的一部分Pre S2区域的功能DNA编码序列的重组DNA分子有关。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”也含有它的功能衍生物。“功能衍生物”这个术语是指在希望的地方不妨碍粒子的形成和/或保持其免疫原性的涉及氨基酸改变的编码序列。这些功能衍生物可以通过常规的点特异诱变来制备。Botstein等人，Science，229，85)首先使用了点特异突变技术。这种融合可以发生在Pre S2区域的N-末端或者在Pre S2区域内的一些点上。可以有四种类型的融合，即在整个Pre S2区域的5′-末端，在Pre S2区域内的一些位置上，这样Pre S2 DNA位于功能DNA编码序列的两侧，或在Pre S2区域截短部分的5′-末端上，或是在S-蛋白编码区域的5′-末端，这样融合不含有Pre S2 DNA。各种Pre S2-S蛋白编码序列已为人所知，并可以用已知的技术来制备或分离。〔参看，此文所指的参考书，上述〕。这项发明的一个体现是ARG3调节区域和酵母OCT蛋白的18个氨基酸一步步融合到截短的Pre S2-S蛋白编码序列，以致融合了的序列含有Pre S2-S蛋白编码序列和完整的S蛋白编码序列的42个密码子。较好的功能DNA编码序列包括疟原虫的环状体蛋白编码序列，或它的致免疫衍生物，HIV的包膜基因编码序列或任何它的致免疫衍生物，特别是C7肽，肽121或Dreesman肽编码序列或它的致免疫衍生物。例如，一个较好功能DNA编码序列是后来连结于Pre S2-S蛋白编码序列的截短的Pre S2区域的C-末端42个密码子的Pre S2编码序列的开头的13个N-末端密码子。术语“致免疫衍生物”是指一Dame等人.，Science，225，593(1984)(恶性疟原虫cs蛋白)〕。含有cs编码序列的DNA分子，或任何其它一步步融合到HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列都能用常规的技术来构建。如用把cs编码序列或任何其他功能DNA编码序列一步步连接到在PreS2-S蛋白编码序列的55个氨基酸PreS2编码区域内的任何密码子上。
较好的是，足够的PreS2编码序列保留到cs编码序列或任何其他功能DNA编码序列的连接之后，以保证cs蛋白或任何其他功能DNA编码序列蛋白的最适出现，即应该保留足够的PreS2区域，这样，编码多肽的PreS2区域作为功能DNA蛋白编码序列产物和HBsAg粒子表面之间的桥而起作用。据报导，PreS2编码序列的26个氨基末端氨基酸代表了在PreS2区域上的一个占优势的抗体结合位点。〔参见，如Milich等人，Science，228，85)〕。因此，如果想要制备一个含有和/或代表PreS2抗原决定簇和cs二者，或其他功能编码序列抗原决定簇的杂种粒子，最好把cs编码序列或其他功能DNA编码区域插入到在使含有和/或代表PreS2抗原决定簇和cs二者，或其他功能DNA编码序列抗原决定簇的杂交粒子的制备成为可能的PreS2编码区域中的一个位点上。
此发明的重组载体包括有效连接于调节区域的有关发明的重组DNA分子(即一个功能DNA编码序列一步步融合到HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域)。这种载体另外也许也包含一个在酵母中行使功能的复制子。术语“复制子”是指保持功能稳定的DNA最小区域，并且是染色体外的在用此载体转化的寄主酵母有机体中的重组载体。这种复制子的得到需要技巧。术语“调节区域”是指调节想要表达的编码序列的调节转录和翻译的DNA区域。这种调节区域的得到需要技巧。这种载体可以用常规的技术来制备，如把这项发明的DNA分子逐步逐步地插入到已经含有复制子和调节区域的载体上，通过这种方式DNA分子有效地连接到这样的调节区域上。较好的是，DNA分子连接到能够在酵母的酵母属(Saccharomyces)中表达的载体上。
本发明也和用这种重组载体中转化的酵母寄主细胞，同制备这种含有用此发明的重组载体转化酵母寄主细胞的转化寄主的方法有关。这种转化用常规技术如以上已经描述了的技术来进行。较好的酵母细胞包括那些属于酵母属的酵母，特别是那些属于啤酒酵母种和卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)种的酵母。
本发明也与制备含有HBsAg蛋白的杂种粒子的方法有关。这个HBsAg含有和/或呈现了功能DNA编码序列产物。在这个方法中包括在适当的培养介质中培养此发明的转化酵母寄主细胞，并从细胞裂解产物或这个寄主培养物提取液中分离粒子。术语“呈现”或“含有和/或呈现”是指功能DNA编码序列蛋白包含于含有HBsAg蛋白的杂种粒子中。通过这种方式，可使对功能DNA编码序列蛋白的免疫反应的产生成为可能。当需要使的时候，虽然不一定是必要的时候，功能DNA编码序列蛋白的出现并不干扰HBsAg抗原决定簇的致免疫活性，因此，形成了二价疫苗。大多数转好的功能DNA编码序列蛋白出现在HBsAg粒子上，以这样一种方式，或是功能DNA编码序列蛋白的抗原决定簇或是功能DNA编码序列蛋白和HBsAg抗原决定簇二者的最大量均能适量地暴露。“适当的培养介质”是指能使转化寄主生存下来，并也能使这种寄主表达载体的杂种功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列蛋白质产物的介质。载体在恢复量中转化。最好操作者有一定技巧，使用适当的培养基取决于所用的寄主细胞。将此发明中的杂种粒子从细胞裂解产物或此寄主培养物的提取液中的分离是用常规的蛋白质分离技术来进行的。
本发明也和含有此发明杂种粒子的疫苗有关，这个疫苗将含有此发明杂种粒子的免疫保护蛋白质的量，并用常规的技术制备。“免疫保护”是指此发明足够的杂种粒子有助于得到没有严重的付作用而具有对想要被保护的因素的足够的保护抗体反应。再者，此发明的疫苗含有此发明的胶团，即胶团含有此发明的粒子和多价吸附剂。这种胶团组成的多价吸附剂的最佳量是每100μg蛋白5-50μg多价吸附剂。此胶团可以用欧洲专利申请公布号0199698所报导的方法来制备。
在本发明的疫苗中，本发明杂种粒子的水溶液在生理pH缓冲液中直接使用更好。粒子可以选择性地同任何各种已知的佐剂搀和或吸收。这些佐剂除了氢氧化铝外还包括有其他物质。
疫苗准备一般在“疫苗的新动向与发展”上有叙述。由Voller等人编著，Park大学出版社，Baltimore，Maryland，美国，1978。
出现在每种疫苗剂量中目前发明杂种粒子的量被选作诱导免疫保护反应而在经典疫苗中无大的付作用的量。这个量变化由使用特殊的免疫原和疫苗以及是否用佐剂辅助来决定。一般来说，期望每个剂量含有1-1000μg蛋白质，1-200μg更好。特殊疫苗的最适量可以用包括受试者抗体效价观察和其他反应的标准研究来决定。按照一个最初的疫苗接种，受试者最好在大约四周内接受一次强化，之后只要感染的危险存在多长，每六个月就接受重复的强化。
本发明中对杂种粒子的免疫反应可通过佐剂的使用来提高，如(但不限制于)氢氧化铝(明矾)。
本发明杂种粒子的举例说明，为恶性疟原虫环状蛋白(cs)重复抗原决定簇编码的64个密码子DNA序列和8个密码子cs编码序列〔见Dame等人，Science，225，593-599(1984)〕分别被一步步插入到在含有复制子、PreS2-S蛋白编码序列和适当的调节区域的酵母表达载体中的一部分PreS2编码序列中。两个表达载体，即一个含有64个密码子cs序列，另一个含有8个密码子cs序列，每个都被插入到酵母寄主细胞中，分析这种转化细胞的提取液来看在同一分子上的HBsAg抗原决定簇和cs抗原决定簇是否存在。
使用cs特异的5个单克隆抗体和抗原来源于酵母的纯化HBsAg的一个单克隆抗体，从免疫吸印分析得到的结果表明37，000千道尔顿(Kd)杂种蛋白是从用含有同PreS2-S蛋白编码序列一步步融合的64个密码子cs编码序列的载体转化的酵母的裂解产物中获得的，30，000Kd杂种蛋白是从用含有同PreS2-S蛋白编码序列一步步融合的8个密码子cs编码序列的载体转化的酵母的裂解产物中获得的。这些蛋白装配到HBsAg粒子状结构是通过CsCl和蔗糖梯度分析，高压液相层析(HPLC)和电子显微镜检术来显示的。在这种粒子外部cs抗原决定簇的出现是通过cs抗原决定簇对ELISA分析中cs特异抗体的接受能力来显示的。在这种粒子外部HBsAg抗原决定簇的出现是通过放射免疫分析(AUSTIAⅡ，Abbott)或ELISA分析(Enzygnost-HBsAg，Behringwerke)来显示的。
新的PreS2和PreS2-S蛋白编码序列本发明的新的HBVPreS2和PreS2-S蛋白编码序列来源于从质粒pRIT10616分离出来的HBVadw亚型。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”也包含它的功能衍生物。术语“功能衍生物”是指在合适的地方有氨基酸改变但并不干扰粒子的形成并且(或者)在此其保留是满意的地方保持免疫原性的编码序列。这个功能衍生物可以采用常规的位点特异突变来制备，如用Botstein等人的方法，Science，229，85)。这种PreS2和PreS2-S蛋白编码序列可以用常规的重组DNA步骤来恢复。这种常规的重组DNA步骤来源于Budapest条约存放在在美国典型菌种保藏所，Rockville，Maryland，日，登记号ATCC38131，的质粒pRIT10616。这个新的蛋白编码序列的PreS2区域为以下氨基酸序列-55-50Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40-30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-
-20Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile--10Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.
这个区域也可通过常规的合成寡核苷酸的合成来获得。这项发明的PreS2-S编码序列的较好的功能衍生物是一个第45位的丙氨酸(GCT)在那里通过点特异突变改成苏氨酸(ACT)。与此发明的未修饰编码序列相比较，这个功能衍生物通过转化的啤酒酵母导致了大两倍水平的表达。
这项发明的重组载体含有有效地连接于调节区域的有关发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列。这种载体可能另外也含有取决于选用物和/或所使用的寄主的复制子。术语“复制子”是指在用这种载体转化的真核或原核生物寄主中的重组载体的保持功能稳定的染色体外DNA最小区域。这种复制子的得到需要技巧。术语“调节区域”是指含有启动子区域和编码序列转录所必需的其他序列的DNA序列。这种调节区域的得到需要技巧。这样一种载体可以用常规的技术来制备，如把这项发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列一步步插入到已经含有复制子和调节区域的载体上，通过这种方式DNA分子有效地连接到调节区域上。最好是DNA分子连接到能够在酵母如酵母属中表达的载体上。
这项发明也和用这种重组载体转化的寄主细胞和制备这种转化寄主的方法有关。这种转化用常规技术进行。寄主细胞可以是真核的或原核的。最适的寄主细胞是真核细胞，特别是酵母细胞并包括那些属于酵母属的酵母，特别是那些属于啤酒酵母和卡氏酵母种的酵母。
本发明也和本发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质的制备有关。在这个方法中包括在适当的培养基中培养此发明的转化寄主细胞，和从寄主细胞培养液或从细胞裂解产物中分离蛋白，此分离取决于寄主细胞分泌这种蛋白质的能力。“适当的培养基”是指在恢一量中能使这项发明的转化细胞生存下来并也能使寄主表达这项发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列的培养基。有经验的人会知道，使用适当的培养基将依使用的寄主细胞而定。把这项发明的PreS2-S蛋白从这寄主的培养裂解产物或寄主的培养液中分离出来是用常规蛋白质分离技术来进行的。用此发明的方法制备的蛋白质可以依寄主细胞糖基化能力来糖基化。如果想要得到一个去糖基化的蛋白质，这项发明的蛋白质应该通过使用无糖基化作用的寄主细胞或者通过在进行这项发明的过程之前的蛋白质的编码序列上采用常规位点的特异突变，如用Botstein等人的方法，Science，229，85)来进行制备。
本发明也同含有些发明的PreS2或PreS2-S蛋白的免疫保护量的疫苗有关。这种疫苗可以用常规的技术来制备。
本发明也同制备含有包含此发明的PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质的HBsAg蛋白的杂种粒子的方法有关，这个方法包括在适当的培养基中培养此发明的转化真核寄主细胞，并从寄主细胞培养液或从细胞裂解产物或这种寄主培养液的提取液中分离粒子，此分离取决于转化寄主细胞分泌这种粒子的能力。“适当的培养基”是指能使此发明的转化细胞生存下来并能使寄主从粒子形式和恢复量表达此发明的PreS2-S蛋白编码序列的培养基。有经验的人会知道，使用适当的培养基依所使用的寄主细胞而定。此发明的杂交粒子从培养液裂解产物或寄主培养液中分离出来是用常规的分离技术进行的。
本发明也会和含有此发明的杂种粒子的疫苗有关。这种疫苗含有此发明的杂种粒子的免疫保护量并用常规技术来制备。最好是此发明的疫苗包括此发明的胶团，即胶团含有此发明的粒子和多价吸附剂。这种粒子构成的多价吸附剂的最适量是每100μg蛋白质5-50μg多价吸附剂。胶团可用欧洲专利申请公布第0199698号上发表的方法来制备。
在此发明的疫苗中，此发明的PreS2-S蛋白或杂种粒子的水溶液可以直接使用，最好在生理pH缓冲液中。蛋白质或粒了可以选择性地同各种已知的佐剂一起搀合或吸收。这种佐剂包括氢氧化铝及其他。
疫苗制备一般在“疫苗的新动向与发展”(NewTrendsDevelop-mentinVaccines)上有叙述。此书由Voller等人编著，UniversityPark出版社出版，Baltimore，Maryland，美国，1978。对脂质体的包裹作用(Encapsulation)也有叙述，例如，Fullerton，美国专利4，235，877。对蛋白质连到大分子上也有描述。例如，Likhite，美国专利4，372，945和Armor等人，美国专利4，474，757。
本发明中的每个疫苗剂量中PreS2-S蛋白或杂种粒子的量被选定为诱导那种免疫保护反应而在经典疫苗中又没有大的付作用的量。这个量依所用的特异免疫原和疫苗是否用佐剂辅佐而变化。一般来说，希望每个剂量含1-1000μg蛋白质，最好是1-200μg。特殊疫苗的最适量能用包括受试者抗体效价的观察和其他反应的标准研究来决定。按照一个最初的疫苗接种，受试者最好在大约四用内接受一次强化，之后只要感染的危险存在多长，每六个月就接受重复的强化。
对PreS2-S蛋白或此发明的杂种粒子的免疫反应通过使用佐剂，如矾，但不限制于矾，来提高。
新的PreS1蛋白编码序列此发明的新的HBVPreS1蛋白编码序列来源于从质粒pRIT10616中分离出的HBVadw亚型。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”包括它的任何功能衍生物。术语“功能衍生物”是指那种不干扰粒子形成和/或保留免疫原性的包含氨基酸改变的编码序列。这种功能衍生物能用常规位点特异突变来制备，如Botstein等人的方法，Science，229-85)。这种PreS1蛋白编码序列能用常规重组DNA程序来恢复，这种程序来源于按照Budapest条约寄存在美国典型菌种保藏所，Rockville，Maryland，日，登记号ATCC38131的质粒pRIT10616，PreS1区域为以下氨基酸序列编码-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIlePro
CCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla这种区域也可以用常规的合成寡聚核苷酸的合成而获得。
此发明的重组载体包含有效连接于调节区域的有关发明的PreS1蛋白编码序列，另外也可能包含取决于选用物和/或使用的寄主的复制了。术语“复制子”是指在用载体转化了的真核或原核生物寄主中的重组载体的保持功能正常的染色体外DNA最小区域。这种复制子的得到需要技巧。术语“调节区域”是指含有启动子区域和编码序列转录必需的其他序列的DNA序列。这个调节区域的得到需要技巧。这种载体可用常规技术如用把此发明的PreS1蛋白编码序列一步步插入到已经含有复制子和调节区域的载体中来制备。通过这种途径，DNA分子有效地连接到调节区域上。最好是DNA.分子连接到能在如酵母属的酵母菌中表达的载体上。
本发明也同用重组载体转化的寄主细胞有关，同制备转化寄主的方法有关。这种转化是用常规技术来进行的。寄主细胞可以是真核的或原核的。较好的寄主细胞是真核细胞，特别是酵母细胞，包括那些属于酵母属的细胞，特别是那些属于啤酒酵母和卡氏酵母种的细胞。
本发明也同制备此发明的PreS1蛋白编码序列所编码的蛋白质的方法有关，这个方法包括在适当的培养基中培养此发明的转化寄主细胞，和从寄主细胞培养液或从细胞裂解产物或这种寄主培养液的提取液中分离蛋白质，此分离依转化寄主细胞分泌这种蛋白质的能力而变。“适当的培养基”是指能使此发明的转化寄主生存下来并在恢复量条件下能使此寄主表达此发明PreS1蛋白编码序列的培养基。有经验的人会知道，使用适当的培养介质依使用的寄主细胞而定。此发明的PreS1蛋白的从培养液裂解产物或此寄主的培养液中分离出来是用常规的分离技术来进行的。用此发明的方法制备的蛋白质依寄主细胞的糖基化能力可以被糖基化。如果想要一个脱糖基化的蛋白质，这项发明的蛋白质应该使用无糖基化作用的寄主细胞或用在本发明的过程进行之前在蛋白质编码序列上的常规位点进行特异突变。位点特异突变是用如Botstein等人的方法，Science，229，85)来进行的。
本发明也和含有此发明的PreS1蛋白的疫苗有关。这种疫苗含有此发明PreS1蛋白的免疫保护量并用常规技术制备。
在发明的疫苗中，此发明的PreS1蛋白的水溶液可以直接使用，在生理pH缓冲最好。PreS1蛋白可以选择性地同任何各种已知的佐剂混合或吸收。这种佐剂包括氢氧化铝及其他。
疫苗制备一般在《疫苗的新动间与发展》上有叙述，此书由Voller等人编著，UniversityPark出版社出版，Baltimore，Maryland，美国，1978。在脂质体中的包裹作用有叙述，例如Fullerton，美国专利，4，235，877。蛋白质连接到大分子上也有报导，例如Likhite，美国专利4，372，945和Armor等人，美国专利4，474，757。
出现在每个疫苗剂量中的本发明的PreS1蛋白的量被选作为诱导免疫保护反应而在经典疫苗中没有大的付作用的量。这个量将依所用的特殊免疫原和疫苗是否用佐剂辅佐而变。一般来说，希望每个剂量包含1-1000μg的蛋白质，最好是1-200μg。特殊疫苗的最适量可以通过包括受试者抗体效价观察和其他反应的标准研究来查明。按照一个最初疫苗接种，受试者将最好在大约四周内再接受一次疫苗强化，继而只要感染的危险存在多长，每六个月就接受一次重复强化。对此发明的PreS1蛋白的免疫反应使用佐剂，如矾，但不限制于矾来提高。
新的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列这项发明也同其PreS1-PreS2部分含有以下氨基酸序列的HBVPreS1-PreS2-S蛋白编码序列有关PreS1区域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIlePro
CCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAlaPRE-S2区-55ATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAMetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGAlaLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGATyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTThrValAsnProAlaProAsnIleAlaSerCACATATCGTCAAGCTCCGCGAGGACTGGGHisIleSerSerSerSerAlaArgThrGlyGACCCTGTGACGAACAspProValThrAsn
此发明的新的HBVPreS1-PrS2-S蛋白编码序列来源于从以上所述的质粒pRIT10616中分离出来的HBVadw亚型，可以从美国菌种保藏所，Rockville，Maryland，登记号ATCC38131，上获得。术语“编码序列”或编码区域也包括任何一种从它来的功能衍生物(或叫功能推衍)。“功能推衍”是指一段具有氨基酸变化的编码序列，这些变化，在适当的地方，并不干扰粒子的形成，或者说，这些变化在可能出现免疫原性的地方可保持该免疫原性。这种“功能推衍”可通过常规的特异性位点突变方法，如Botstein等的方法，《科学》，229，，(1985)。
由此方法而得的重组载体含有与一调节区域相连的人工操作产生的PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列。此外，这种载体也可能包含一个依赖于选择性的和(或)依赖于要使用的寄主的复制子。“复制子”是指维持其功能稳定的一段最小的区域，在染色体外，这种重组载体位于以它进行转化的真核寄主或原核生物体内。这种复制子在此方法中已闻名遐迩。“调节区域”是这样一段DNA顺序，它含有一个启动区域和为一段编码序列的转录必需的其他顺序，而这一段编码序列则调节一个结构基因编码序列的转录。这种调节区域也是众所周知的。这种载体可由一般的方法得到，如把在噬菌体中获得的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列嵌入已具有复制子和调节区域的载体中，使得通过人工操作将DNA分子与这个调节区域相连。DNA分子优先缚于能在酵母，如酵母属中表达的载体上。
本发明也与寄主细胞经这种重组载体进行转化有关，还涉及到获得这种转化寄主的方法。用常规方法即可进行上述转化。寄主细胞可以是真核或原核的。经选择的宿主细胞为真核细胞，尤其是酵母及包括属于酵母属的细胞，特别是其中属于啤酒酵母和卡氏酵母。
该发明还涉及到制备由PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列所编码的蛋白质的方法，此方法包括在合适的培养基上培养转化了的宿主细胞，从宿主细胞培养液或细胞溶化产物中分离蛋白质，或者，依赖宿主细胞可分泌蛋白质的能力，从宿主培养物中提取该蛋白质。上述的“合适的培养基”是这样的培养基，它能使本发明转化后的宿主存活，也能使这一宿主以可取得的量表达PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列的产物。在熟练工作人员的工作中可以看到，将采用的合适的培养基会依赖于要使用的宿主细胞。用常规的蛋白质分离技术可从培养溶化物或宿主培养液分离得PreS1-PreS2-S蛋白质。以此法制备的蛋白质，可能会由于宿主细胞的糖基化作用而带有糖基。如果需要去糖基的蛋白质，就要利用无糖基化作用的宿主细胞来制备，或者，在进行这种发明方法之前，采用常规的蛋白质编码序列上特异性点突变方法，如(Botsteinet.al.Science，229，，(1985))。通过一个转化了的酵母或哺乳动物宿主细胞，PreS1-PreS2-S编码序列将表达为糖基化蛋白质。通过一个转化了的酵母宿主细胞，PreS1-PreS2-S编码序列将表达为N-肉豆蔻酸蛋白。
本发明还涉及到含有大量PreS1-PreS2-S蛋白质的免疫保护性疫苗。这种疫苗可用一般技术获得。
本发明也涉及了制备含有HBsAg蛋白的杂种粒子的方法，HBsAg蛋白包含了由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列编码的蛋白质，这种发明中也包括了在合适的培养基中培养转化了的真核寄主细胞，从寄主细胞培养液或细胞溶化产物中分离这种蛋白质颗粒，或者根据转化了的宿主细胞可分泌蛋白质的能力提取这种蛋白质的培养基。所谓“适合的培养基”即是使转化后的宿主存活，使宿主以颗粒形式、以补偿量表达PreS1-PreS2-S蛋白编码序列的培养基。应注意，在此法中，所用的培养基将依赖于使用的宿主细胞。用一般的分离技术从培养的溶化物或寄主培养液中分离蛋白质颗粒。
本发明亦涉及到该发明的含有杂种粒子的一种疫苗。这种疫苗包含有大量免疫保护的杂种粒子，这些粒子可由一般的技术制备。更好的是，该发明得到的疫苗具有一种胶团，即，含有此发明所得的粒子和多价吸附剂的胶团。胶团中多价吸附剂的选择量为每100μg蛋白质中含5-50μg多价吸附剂。制备胶团的方法在欧洲专利申请公布No.0199698中有叙述。
本发明制备的疫苗中，PreS1-PreS2-S蛋白质或杂种粒子的水溶液可选择在生理pH缓冲条件下直接使用。另一方法是，这种蛋白质或粒子可被众多已知的佐剂之一吸收或与其混合。这些佐剂包括氢氧化铝就其他许多物质。
疫苗制备方法的描述常见于“疫苗的新动向与发展”中，此书由Voller等主编，UniversityPark出版社，美国马里兰州巴尔的摩，1987年出版。例如，包裹在脂质体内就是由Fullerton描述的，美国专利4，372，945，又如，Likhite和Armor等揭示了蛋白质与大分子物质的结合，美国专利4，372，945和4，474，757。
存在于每一疫苗剂量中的以现有发明制得的PreS1-PreS2-S蛋白或杂种粒子的数量，被选来用在典型疫苗诱导产生免疫保护性，而无明显的、相反的副作用的剂量数量。随着所用的特异性抗原之不同以及疫苗是否加有佐剂，这一数量可以改变。一般期望的是每一疫苗剂量含有1-1000μg蛋白质，最好是1-200μg。要确定一种特定的疫苗产生的最佳蛋白质数量可通过标准方法，包括抗体效价的观察，以及观察其他的反应。在初始接种后，有选择性地增大接受试验者在约四周内的剂量，这之后，只要传染的可能性存在，就要接着每6个月重复增加剂量。
利用佐剂，如明矾，但不限于矾，可提高对于PreS1-PreS2-S蛋白或杂种粒子的免疫反应。
酵母中PreS1-PreS2-S蛋白的表达本发明也关系到一个重组DNA载体，它含有人工操作与一段表达控制顺序相连的整个PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列。这里所说的“编码序列”或“编码区域”也包括由此产生的任何功能推衍。“功能推衍”是指一段具有氨基酸变化的编码序列，这些变化在适当地方，不干扰颗粒的形成，或者说，这些变化在可能有免疫原性的地方，保持其免疫原性。用常规的特异性点突变法，如Botstein等的方法。(Science，229，85))，可制备这种功能推衍。此外，这种载体还可能含有一个复制子，这个复制子是选择依赖性或宿主依赖性。可喜的是，由此发明可得到我们将使用的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列。
“复制子”是可以稳定地维持其功能的最小的DNA区域，在染色体外，这种重组载体通过该发明所得的载体在寄主酵母体内进行转化。这些复制子已众所周知。所谓“调节区域”是指任何一段DNA序列，它含有一个启动区域和其他为转录一段密码序列所必需的序列，而这一段密码序列了调又调节一个结构基因序列的转录。这些调节区域也已是人所周知的。用一般的技术可制备这种载体，如把噬菌体中的一段PreS1-PreS2-S蛋白编码序列嵌入到一个已含有复制子和调节区域的载体中，以使DNA分子与这个调节区域相连。人们选择的是能在酵母的酵母属中表达的载体和DNA分子连接。最好载体中包含的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列正是上述的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列。这些载体在插入功能DNA编码序列的过程中也十分有用，这段DNA的插入使该载体内含的结果PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列，得到表达。因此，这一发明方法也关系列一个重组DNA分子，它含有一段在噬菌体中与PreS1-PreS2-S蛋白编码序列的PreS1区域融合的功能DNA编码序列，从而使这段功能DNA序列要么构成PreS1区域的一个插入区，要么取代部分PreS1区域，可能还要取代PreS2-S区域的一部分，所以，这一发明也涉及含有这种重组DNA分子的载体。例如，见下述实例21A。所谓“功能DNA编码序列”是指一段DNA编码序列，当它在噬菌体中与PreS1-PreS2-S蛋白编码序列中PreS1区域融合时，并不涉及，也不妨碍HBsAg粒子的装配。经选择的功能DNA顺序包括(但不限于)这些疟原虫或任何免疫原性衍生的环孢体编码序列，HIV或任何免疫原性衍生的包膜基因编码序列，尤其是象后面要举出的C7肽、肽121或Dreesmas肽的编码序列，或来自其他感兴趣的病毒中肽的编码序列，特别是来自其他宿主中的为外壳蛋白或表面蛋白编码的序列。
本发明也涉及到用这种重组载体转化酵母宿主细胞和制备这种转化宿主的方法。常规技术即可进行这一转化。选用的酵母细胞也包括酵母菌属，特别是属于啤酒酵母种的。
该发明还关系列一种由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质的制备，在这发明中，包括了在一种适当的培养基上培养转化后的宿主细胞，从宿主细胞培养液或细胞溶化物中分离该蛋白质，或者根据宿主细胞能分泌该蛋白质的性质来提取这种蛋白质。所谓的“适当的培养基”是指它能使转化后的宿主生长，也能使宿主表达一段PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或以可取得的量表达PreS1-功能DNA编码序列一PreS2-S蛋白编码序列的产物。应意识到，用这种技术，采用的适当的培养基应依赖于将使用的宿主。用普通的蛋白质分离技术即可从细胞溶化物或寄主培养液中分离PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列一PreS2-S蛋白。由此发明方法制备的蛋白质，由于其宿主细胞的糖基化作用，可能是带糖基的。如果需要去糖基的蛋白质，就应这样制备用一种糖基化作用失效的宿主细胞，或在进行前述步骤前，在蛋白质编码序列上采用一般的特异性点突变方法，如Botstein等《科学》上的方法(Botsteinetal.Science，229，85))。
此发明还涉及一种疫苗，它含有由该发明生产出的大量免疫保护性的PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白。由一般的技术可制得该疫苗。
本发明也与制备一种杂种粒子的方法有关，这种粒子含有由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质，该法中包括在合适的培养基上培养转化后的酵母宿主细胞，从宿主细胞培养液或细胞溶化物中分离粒子，或根据转化后的宿主细胞能分泌这种粒子的性质来提取它。所谓“适合的培养基”是指转化后的宿主能生长的培养基，它也能使PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列以粒子形式，以可提取的量表达。应注意，采用这些方法之一时，所用的合适的培养基要依赖于使用的宿主细胞。用一般的分离技术即可从培养的溶化物或宿主培养液中分离得粒子。
本发明还与含有粒子的一种疫苗有关。这种疫苗含有大量具免疫保护性的粒子，这种粒子可由常规技术制得。更好的是，这种疫苗含有胶团，即包括粒子和多价吸附剂的胶团。选择的多价吸附剂在这种胶团中含量为每100μg蛋白质有5-50μg多价吸附剂。胶团的制备法可见欧洲专利申请公布No.0199698。
在该发明中的疫苗里，PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白或粒子的水溶液，可在选择的生理pH缓冲条件下直接使用。另一方法是，众多已知的佐剂中，任何一种都可吸附或与蛋白质粒了混合，这些佐剂包括氢氧化铝及其他物质。
疫苗的制备方法见“疫苗的新动向与发展”中，由Voller等主编，1978年，美国马里兰州巴尔的摩，UniversityPark出版社出版。例如脂质体的包膜见于美国专利4，235，877，Fullerton著述，蛋白质与大分子的结合，见于美国专利4，372，945，Likhite著述，美国专利4，474，757，Armor著述。
每一疫苗剂量中PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白的含量被选定为在典型疫苗中不出现明显的、相反的副作用，而又诱导免疫保护应答的蛋白含量。由于采用的特异性免疫原不同以及疫苗中是否加入佐剂，这一蛋白含量也将随之而变。一般地，人们希望每一疫苗剂量中含1-1000μg蛋白质，1-200μg更好。对一种特定的疫苗，可用标准方法来确定上述最佳含量，这些方法包括对接受试验者的抗原效价及其他反应的观察。起始接种后，在大约四周内要有选择性地加强接受试验者的疫苗剂量，只要感染的可能性还存在，这之后每六个月还要重复地加强疫苗剂量。
使用佐剂，如明矾(但不限于此)，可增强对PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白或粒子的免疫应答。
实例以下为此发明的实例，它是解释性的，但不限于此。
所有百分比为重量百分比，所用温度采用摄氏温标。
DNA操作处理中使用的酶由BethesdaResearch实验室、NewEnglandBiolabs和/或Boehringer得来，按提供者的说明操作使用。
酵母生长培养基选择培养基YNB(不含氨基酸的)酵母氮源(Difco实验室)，0.675%(W/V)，含2%(W/V)葡萄糖。
YEPD培养基1%(W/V)酵母浸汁，2%(W/V)胨，2%(W/V)葡萄糖。
DNA重组方法在《分子克隆》(“MollecularCloning”)中有叙述，T.Maniatis等，冷泉港实验室(1982)ColdSpringHarborLab.(1982)。
PMSF苯甲基氟化磺酰。
以下为可能用到的缩略语PBS磷酸盐缓冲液(每升)(pH7.4)8.0克NaCl
0.2克KCl1.15克Na2HPO40.2克KH2PO40.1克CaCl20.1克MgCl2·6H2OBSA牛血清清蛋白(A4378·Sigma)X-gal5-溴-4-氯吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷密苏里州，圣路易斯Sigma化学公司生产的商业用品。
L-肉汤(每升)10克胰蛋白胨5克NaCl5克酵母浸汁1毫升0.1M MgSO4灭菌后加入无菌硫胺素(1mg/ml)5毫升。
要制成固体培养基，则每升中再加15克琼脂。
实例1质粒pRIT10167的构建起始物是一段含有长度为2.1KbHindⅢ的酵母DNA片段的质粒p6Y，这段DNA编码克隆pBR322上的TOB3基因。Bolivar等对pBR322已有描述(Gene，2，95-113，1977)。p6Y质粒由Musti等构建和特征化，从NationalInstituteofHealth的M.Rosenberg博士处得到该质粒。HindⅢ片段再次克隆到一个pBR322衍生物上，在该衍生物中，EcoRⅠ位点被破坏而得到质粒pRIT10164(非本质性的变动)。以下的操作都是为了制造出一个位于TDH3编码顺序的ATG密码中碱基G处的BamHⅠ位点，还要得到一段具有TDH3启动子活性的HindⅢ-BamHⅠDNA片段，此片段上的活性完整，不为操作过程而变化。如上述方法制得的pRIT10164DNA，经两次CsCl-溴乙锭密度梯度离心纯化，基本原理由Kahn等描述(MethodsinEnzymology，68，268，1979)。用75个单位的核酸内切酶XbaⅠ完全消化150μgpRIT10164DNA，用酚-醚提取，以乙醇沉淀，然后，以1μg/μl的浓度再悬浮于0.01M的二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。
用核酸酶Bal 31消化经上述XbaⅠ处理的20μg DNA样品，可以切除ATG密码与XbaⅠ位点之间的61对DNA碱基对。Bal 31的消化作用在如下条件进行30℃，1-3分钟，在含600mM NaCl，12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA，20mM二吡喃硫胺素-HCl，pH3.1的缓冲液中进行，在200μl的反应终体积内，每20μg DNA用1个单位的Bal 31核酸酶。
加入EGTA(乙二醇双乙胺醚-N，N′-四乙酸)，使其终浓度为20mM，以中止酶反应，样品用等体积的酚、醚提取，用乙醇沉淀。每一DNA样品又悬浮于20μl10mM，pH7.5的二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。
Bal31的酶解程度可这样测定用核酸内切酶HpaⅠ消化约2.5μg每一DNA样品，将HpaⅠ-XbaⅠ片段的大小与来源于pRIT1bp长的HpaⅠ-XbaⅠ片段作一比较。人们发现用Bal31进行的2分钟酶解可切掉pRIT10164的XbaⅠ-HpaⅠ片段上约41-88个核苷酸。
上述结果表明从XbaⅠ朝向ATP密码的另一端也有相同数目的碱基对被切除。5μg经2分钟Bal 31酶解后回收的DNA用核酸内切酶BamHⅠ消化，以酚提取，用乙醇沉降回收。在三磷酸脱氧核糖核苷酸存在下，用5个单位的T4多聚酶处理这个DNA使BamHⅠ及任何Bal 31的单股端填满并使之末端补齐，然后用酚提取，以乙醇沉降回收。用5个单位的T4DNA连接酶处理2.3μg这种DNA，其中一半的连接混合物用于转化大肠杆菌K12菌株MM294的感受态细胞，这种感受态细胞按照Cohen等方法制备(proc.Natl.Acad.Sci.69，)。把1毫升转化后的大肠杆菌菌体稀释在含200μg/ml氨苄青霉素的350ml L-肉汤中，整个质粒DNA从最终培养物中提纯。
80μg上述质粒DNA，它含有大量经Bal31去除约40-80个碱基对的质粒分子，先后进行如下酶解每75个单位的核酸内切酶HindⅢ消化，用96个单位的核酸内切酶BamHⅠ从那些质粒上释放DNA片段，即那些经上述处理后又重产生BamHⅠ位点的质粒，也就是说，在Bal31消化的G残基末端。这个DNA酶解物在1%制备琼脂凝胶上电泳走带，将需要的HindⅢ-BamHⅠ片段从凝胶上割上，根据片段大小bp，将其切成两段，一段代表1070bpDNA，另一段为1030bp的DNA。两段琼脂凝胶经冷冻和解冻循环，再以高速离心沉淀琼脂，即可回收DNA。上述的上清液通过一个微孔GVMillex过滤器过滤，经两次乙醇沉降回收DNA，再把DNA悬浮于20μl0.01MpH7.5的二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。
琼脂凝胶电泳分析方法，与pRIT10164DNA的HindⅢ和XbaⅠ酶解物的比较，与入噬菌体DNA的HindⅢ和EcoRⅠ酶解片段的比较，都表明得到了两个独特的HindⅢ-BamHⅠ片段的类群，估计一个大小为1070bp，一个大小为1030bp(与长度为1120bp、来源于pRIT10164的亲本HindⅢ-XbaⅠ片段相比)。约100ng的长为1030bpHindⅢ-BamHⅠ片段的类群与200ng质粒pUC9连接，后者已经核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶解、经碱性磷酸酶处理(见Shine，U.S.PatentNo.4，264，731)，连接的混合物用于转化大肠杆菌菌株JM103的感受态细胞，该细胞经选择为氨苄青霉素抗性的。进行有效的大肠杆菌菌株JM103的转化可根据Cohen等在前面举出的方法。
pUC9载体质粒和受体大肠杆菌菌株JM103均已由Vieira和Messing在“基因”(Gene，19，259，1982)中描述过，从J.Messing(Univ.ofMinnesota)处获得。pUC9载体作为商品可从Amersham(Buckinghamshire，UnitedKingdom)和Pharmacia(Uppsala，Sweden)得到，大肠杆菌菌株JM103可从J.Messing(univ.ofMinnesota)得到。另一种具有大肠杆菌JM103特征的大肠杆菌菌株，即JM101，可从美国典型菌种保藏所(AmericanTpyeCultureCollection)，Rockville，Maryland)登记号ATCC33876获得，它也能作为宿主用。在含有X-gal的培养基上，从98个试验菌落里大约可得到每毫升400个氨苄青霉素抗性菌落。95个菌落为白色，表明在载体的HindⅢ和BamHⅠ位点之间成功地插入了一个外来DNA片段。
在生长培养基中加入壮观霉素(150μg/ml)以放大质粒，然后，通过一个小样操作步骤BirnboimandDoly，Nucl.Acid.Res.，7，)，就可制备来源于单个转化菌落的质粒。
重组质粒经核酸内切酶AVaⅡ和BamHⅠ双重酶解后，在7.5%丙烯酰胺凝胶上分析，与含有pRIT10164的启动子-N-末端区域的AvaⅡXbaⅠ片段相比较，还与pBR322DNA的HpaⅡ酶解片段比较。与pRIT10164相比时，在检验的36个质粒中，有35个里面存在一个AvaⅡ-BamHⅠ片段，相当于20-90个被切除的碱基对。选择三种代表切掉了80个碱基对(pRIT10166)、50个碱基对(pRIT10167-表8)和45个碱基对(pRIT10165)的质粒进行更深入的研究。质粒DNA由CsCl-溴乙锭密度梯度离心制备，25μg每种质粒DNA都用EcoRⅠ酶解。EcoRⅠ酶解末端用r-32P-ATP标记，方法为采用Maxam和Gilbert的化学修饰法(Methods in Enzymology，65，499，1980)，变换激酶作用和每一质粒的HindⅢ-EcoRⅠ片段上的核苷酸序列。在每个重组质粒中pUC9载体部分标记和排列EcoRⅠ位点是确定邻近BamHⅠ位点周围序列的简便方法，这一位点标志着TDH3DNA片段上的切除末端。这一序列分析表明，在质粒pRIT10166中，位于ATG密码以上25个碱基对的5′一端非翻译区域内的G残基处，又产生了BamHⅠ位点;在pRIT10165中，BamHⅠ位点处于第三个密码的第二个碱基处;在pRIT10167中，BamHⅠ位点处于ATG密码的G残基处。
因此，在pRIT10167上构建的TDH3DNA的HindⅢ-BamHⅠ片段含有所有TDH3启动子活性所必需的序列，这一序列并未改变。
实例2载体pRIT10172的构建照实例1的方法制得的1050bpHindⅢ-BamHⅠ TDH 3 DNA插入段(来自pRIT10167)，再克隆于穿梭载体YEP 13上，Broach等描述(Gene，8，121，1979)，是在载体的2微米长DNA部分的HindⅢ位点与BamHⅠ位点间克隆的，从而得到重组质粒pRIT12159。然后，用核酸内切酶XbaⅠ和BamHⅠ消化pRIT12159 DNA，得到的1650bp片段代替与之相似的含arg3启动子的XbaⅠ-BamHⅠ片段，而连结到质粒pRIT10774上。质粒pRIT10774由Cabezon等描述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，81，，1986)，它包含有YEP 13复制子，已用体外方法从此复制子上切掉了天然载体的BamHⅠ和XhoⅠ位点，也含有包括arg3启动子区域的一段1470bpHindⅢ-BamHⅠ插入段，还含有一段包括arg3转录终止区域的1150bpBamHⅠ-HindⅢ片段。由于TDH3启动子插入段代替了pRIT10774上的arg3启动子插入段，从而使得到的质粒pRIT10174含有一个单独的BamHⅠ位点，这一位点位于TDH3启动子插入段的ATG密码处，同时，在1150bpBamHⅠ-HindⅢarg3DNA片段上，它为转录终止预先提供了功能信号。因此，外来DNA可在此位点被克隆。此外，这两个DNA插入段被HindⅢ位点包围。就使得表达独立部分(盒)可以移动，它作为一个2200bpHindⅢ片段，能插入其他载体中。图9是pRIT10172的一个限制性核酸内切酶的裂解图。
实例3pRIT12290的构建照实例1的方法从-pRIT10167(图8)制得的1050bpHindⅢ-EcoRⅠ片段，它含有HindⅢ-BamHⅠ TDH3启动子片段和pUC9多连接物中的BamHⅠ-SmaⅠ-EcoRⅠ部分，再被克隆于pBR322诱导质粒的HindⅢ和EcoRⅠ位点之间，而这一质粒已通过加入T4DNA多聚酶和再连接作用去除了BamHⅠ位点之后的部分。最终得到的重组质粒被定名为pRIT12176。
按下面的实例4(b)的方法制得的pRIT10158(图8)质粒DNA，用核酸内切酶EcoRⅠ消化，用T4DNA多聚酶处理，从而可填补EcoRⅠ单链延伸部分。这一制备物用核酸内切酶ClaⅠ进一步消化。pRIT10158 DNA的深入酶解样品以核酸内切酶ClaⅠ和HindⅢ消化，用制备琼脂凝胶电泳和洗脱就可得到一个具有arg3基因转录末端区域的1150bp Cla HaeⅢ片段。这一片段与经EcoRⅠ、T4DNA多聚酶、ClaⅠ处理的pRIT10158 DNA连结，连结混合物用于转化大肠杆菌(E.Coli)菌株MM294的感受细胞，用前述的Cohen等(Cohen等(Cohen et al)方法，使之成为氨苄青霉素抗性。从转化后的菌落里，可分离到一个定为pRIT10162的质粒，在这一质粒中，ClaⅠ-HaeⅢ arg3转录终止片段被插入pRIT10158的ClaⅠ和已插入的EcoRⅠ位点之间，同时，在这质粒上重建了EcoRⅠ位点。图8是一张说明pRIT10162制备的流程图。pRIT10162的质粒DNA用核酸内切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化，与pRIT12176的质粒DNA(用上述方法制备，也以核酸内切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化(混合)，连接起来的混合物用于转化大肠杆菌K12菌株MM294的感受态细胞以得到氨苄青霉素抗性菌，如上举出的Cohen等的方法。从这一转化过程的菌落里可得到一个pRIT12208质粒，在此质粒中，来自pRIT10162的一个1930bp EcoRⅠ-PstⅠ的小片段已经连接在来自pRIT12176的一个4630bp EcoRⅠ-PstⅠ的大片段上，而且，arg3转录终止区域就与TDH3启动子并列排置在这个质粒中。arg3和TDH 3 DNA区域可以作为一个单个的2200bp片段被核酸内切酶HindⅢ从pRIT12208上酶切下来。考虑到载体的序列，为了得到另一方向的这一片段把pRIT1bp HindⅢ片段再克隆到一个pBR322衍生质粒的HindⅢ位点上，在此衍生质粒中，已通过加入T4DNA多聚酶和再连接作用分别切除了天然的EcoRⅠ和BamHⅠ位点。得到的这个质粒定为pRIT12290，它与pRIT12208相比，在载体序列的相反方向插入了2200bp的HindⅢ片段。图10为pRIT12290的一个限制性核酸内切酶的酶解图。在pRIT12208和pRIT12290载体中，TDH3启动子和arg3转录终止片段被专一性的BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的限制性位点分开，这些位点对于克隆具有密码序列的DNA片段十分有用，启动子和转录终止区域作为转移到其他载体上去的一个独立部分(盒)，可以一起从一个2000bpHindⅢ片段上切下来。
BamHⅠ位点尤其有用，因为它位于TDH3基因的ATG密码处，可以用于TDH3启动子和其他基因的融合，从而能在酵母中表达其他基因(如下面的实例)。用核酸内切酶HindⅢ消化酵母穿梭载体上的插入段，或者用其他限制性内切酶在插入段的侧面限制性位点上酶切，就能以盒或独立单位的形式从pRIT12208或pRIT12290衍生物上得到这种融合体。
实例4质粒pRIT10677，pRIT10909和pRIT10158的构建a)pRIT10677从pRIT10616(Harfordetal.，Dev.Biol.Standard，54，125-130，1983)上切下一段已克隆的HBVDNA的1372bpBamHⅠ片段，这一片段再与经核酸内切酶BamHⅠ消化过的pBR327DNA混合并连接。这一BamHⅠ片段具有一部分HBs抗原前体区域，以及HBs抗原编码序列和3′一端非编码序列。从连接混合物中，可以选到