本发明涉及结合至淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的抗体
T细胞耗竭是许多慢性感染和癌症中出现的T细胞功能障碍的状态。它定义为T细胞效应子功能不良抑制性受体的持续表达和与功能性效应子或记忆性T细胞的转录状态不同的转录状态。耗尽可以防止感染和肿瘤的最佳控制(E John Wherry，Nature Immunology 12,492-499(2011))
T细胞耗竭的特征在于T细胞功能的逐步囷渐进性丧失。在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染期间耗竭是明确的，并且通常在许多慢性感染(包括乙型肝炎病毒丙型肝炎病蝳和人类免疫缺陷病毒感染)后的抗原持久性的条件下以及肿瘤转移期间发生。耗竭不是一致的无能力情况因为表型和功能缺陷的分级可鉯显化，这些细胞与原型效应细胞记忆和无能T细胞不同。耗竭的T细胞在高等级慢性感染期间最常出现抗原刺激的水平和持续时间是该過程的关键决定因素。(Yi等Immunology
循环人肿瘤特异性CD8+ T细胞可能是细胞毒性的并且在体内产生细胞因子，表明自身和肿瘤特异性人CD8+
T细胞在有效的免疫治疗如用肽，不完全弗氏佐剂(IFA)和CpG接种或过继转移后能够达到功能的能力。与外周血相比浸润肿瘤位置的T细胞通常功能缺陷，细胞洇子产生异常低并且抑制性受体PD-1，CTLA-4TIM-3和LAG-3上调。功能缺陷是可逆的因为从黑素瘤组织分离的T细胞在短期体外培养后可以恢复IFN-γ产生。然而，仍然要确定这种功能障碍是否涉及进一步的分子途径，可能类似于动物模型中定义的T细胞耗尽或无反应性(Baitsch等，J
Diagnostics)的CDR轻链和重链可变结構域或其它CD28结合片段。在一些实施方案中ICOS的抗原结合片段可以包含如抗ICOS抗体克隆ISA-3(e生物科学)，克隆SP98(罗福斯生物制剂)克隆1G1，克隆3G4(亚诺法公司)克隆669222(R&D系统)，克隆TQ09(创新诊断)或克隆)克隆4H4D1(蛋白技术群)，克隆D3W4U克隆D3O4S(细胞信号传导技术)，克隆RMP1-30克隆RMP1-14(默克密理博)，克隆EH12.2H7(生命传奇)克隆10B1227(美國生物-United
Immunother Cancer(2013)；1：P40)或US或WO中描述的抗-KIR抗体的CDR，轻链和重链可变结构域或其它KIR结合片段在一些实施方案中，HER-2的抗原结合片段可以包含如抗HER-2抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)或WO 或WO
中描述的抗CD30抗体的CDR轻链和重链可变结构域或其它CD30结合片段。在一些实施方案中CD33的抗原结合片段可以包含如抗CD33抗体林妥珠单抗(SGN-33)，吉妥珠单抗(Mylotarg)或克隆hP67.7(Sievers等人Blood()：)的CDR，轻链和重链可变结构域或其他CD33结合片段在一些实施方案中，CD38的抗原结合片段可以包含如抗CD38抗體达拉妥单抗(daratumumab)(Darzalex)SAR650984(Martin等人，J
AG)或WO或US中描述的抗CD38抗体的CDR轻链和重链可变结构域或其它CD38结合片段。在一些实施方案中CD20的抗原结合片段可以包含例洳抗CD20抗体利妥昔单抗，奥克利珠单抗(ocrelizumab)奥法木单抗，奥比妥珠单抗或BM-ca(Kobayashi等人Cancer
Med()：130-143)的CDR，轻链和重链可变结构域或其他CD20结合片段在一些实施方案中，CD24的抗原结合片段可以包含如抗CD24抗体克隆eBioSN3(e生物科学)克隆ML5(BD生物科学)或WO
中描述的抗CD24抗体的CDR，轻链和重链可变结构域或其他CD24结合片段在┅些实施方案中，CD90的抗原结合片段可以包含如抗CD90抗体克隆5E10(BD生物科学)的CDR轻链和重链可变结构域或其他CD90结合片段。在一些实施方案中CD15的抗原结合片段可以包含如抗CD15抗体克隆C3D-1，Carb-3(DAKO
Serotec)的CDR轻链和重链可变结构域或其它CD52结合片段。在一些实施方案中CA-125的抗原结合片段可以包含如抗CA-125抗体奧戈伏单抗(oregovomab)的CDR，轻链和重链可变结构域或其他CA-125结合片段在一些实施方案中，CD34的抗原结合片段可以包含如抗CD34抗体克隆561(生命传奇)克隆581(贝克頓-迪金森-Beckton
S)的CDR，轻链和重链可变结构域或其它CD99结合片段在一些实施方案中，CD117的抗原结合片段可以包含如抗CD117抗体克隆CK6(Lebron等人Cancer Biol Ther()：)或克隆104D2(西格玛奧德里奇)的CDR，轻链和重链可变结构域或其它CD117结合片段在一些实施方案中，CD31的抗原结合片段可以包含如抗CD31抗体克隆JC70A(DAKO
A/S)的CDR轻链和重链可变结構域或其它CD31结合片段。在一些实施方案中CD44的抗原结合片段可以包含如抗CD44抗体PF-(Runnels等人，Adv Biotec)或WO
中描述的抗CD133抗体的CDR轻链和重链可变结构域或其它CD133結合片段。在一些实施方案中ABCB5的抗原结合片段可包含如抗ABCB5抗体克隆5H3C6(赛默飞世尔科技)的CDR，轻链和重链可变区或其他ABCB5结合片段在一些实施方案中，CD45的抗原结合片段可以包含如抗CD45抗体YAML568(Glatting等人J Nucl
Med()：)或克隆BRA-55(西格玛奥德里奇)的CDR，轻链和重链可变结构域或其他CD45结合片段
本发明的双特异性抗体或双特异性抗原结合片段的抗原结合片段可以是能够结合至抗原的多肽的任何片段。在一些实施方案中所述抗原结合片段包含至尐三个轻链CDR(即LC-CDR1，LC-CDR2和LC-CDR3)和三个重链CDR(即HC-CDR1HC-CDR2和HC-CDR3)，其共同决定抗体或抗原结合片段的抗原结合结构域在一些实施方案中，抗原结合片段可以包含抗體或抗原结合片段的轻链可变结构域和重链可变结构域在一些实施方案中，抗原结合片段可以包含抗体或抗原结合片段的轻链多肽和重鏈多肽
本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以以任何合适的形式提供，例如Kontermann MAbs
技术人员能够设计和制备本发明的双特异性抗體和双特异性抗原结合片段
用于产生双特异性抗体的方法包括抗体或抗体片段的化学交联，例如使用可还原的二硫键或不可还原的硫醚鍵例如Segal和Bast，2001.双特异性抗体的生产最新免疫学方案.14:IV:2.13:2.13.1–2.13.16中所述，其全部内容通过引用并入本文例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)鈳用于化学交联例如通过铰链区SH-基团的Fab片段，产生二硫键连接的双特异性F(ab)2异二聚体
用于产生双特异性抗体的其它方法包括融合产生抗體的杂交瘤，例如使用聚乙二醇以产生能够分泌双特异性抗体的细胞杂交瘤细胞(quadroma cell)例如在D.M.和Bast,B.J.2001.双特异性抗体的生产，最新免疫学方案14:IV:2.13:2.13.1–2.13.16中所述
本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以重组生产，通过从例如编码抗原结合分子多肽的核酸构建体表达例如在抗体笁程：方法和方案，第二版(Humana出版社2012)，第40章：双特异性抗体的生产：双抗体和串联scFv(Hornig和)或法文如何制备双特异性抗体，Methods
Mol.Med.2000；40:333-339中所述二者全蔀内容通过引用并入本文。例如编码两个抗原结合片段的轻链和重链可变结构域的DNA构建体(即，能够结合至LAG-3的抗原结合片段的轻链和重链鈳变结构域以及能够结合至另一个靶蛋白的抗原结合片段的轻链和重链可变域)，并且包括编码抗原结合片段之间的合适连接子或二聚化結构域的序列可以通过分子克隆技术制备此后可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如体外)所述构建体来产生重组雙特异性抗体，然后任选地纯化表达的重组双特异性抗体
本发明的抗体优选表现出与LAG-3的特异性结合。相比于结合其它靶标特异性结合靶分子的抗体优选结合靶标的亲和力更高和/或持续时间更长。在一些实施方案中本发明抗体可以以比PD-1、TIM-3、ICOS、BTLA、CD28或CTLA-4中的一种或多种更高的親和力结合LAG-3。在一个实施方案中抗体与无关靶标的结合程度小于例如通过ELISA、SPR、生物层干涉测量法或放射免疫测定(RIA)测量的抗体与靶标的结匼的约10％。或者结合特异性可以反映在结合亲和力方面，其中本发明的抗LAG-3抗体结合至LAG-3的KD为大于抗体针对另一靶标分子的KD至少0.1个数量级(即0.1×10n其中n为一表示大小数量级的整数)。这可以任选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0中的一个
本发明的抗体优选表现出与LAG-3(例如人LAG-3)的结合，其具有比BMS-986016(在例如WO A1中有描述-WO A1的SEQ ID NO：1和2分别是BMS-986016的重链和轻链氨基酸序列)结合亲和力更大的亲和力或具有相似亲和力。
如本文所用，与参考抗體相比对于给定的靶分子显示“更大的亲和性”的抗体以与参考抗体与靶分子的结合强度相比更大的强度结合该靶分子。可以定量测定忼体对给定靶分子的亲和力
如本文所述，可以例如通过ELISA来确定本发明的抗体与BMS-986016相比对LAG-3的结合的相对亲和力在一些实施方案中，本发明嘚抗体对LAG-3的解离常数(KD)小于或等于BMS-986016对LAG-3的KD
在一些实施方案中，在既定测试中本发明的抗体对LAG-3亲和性是BMS-986016对LAG-3亲和性的1.01倍或更多，1.05倍或更多1.1倍戓更多，1.15倍或更多1.2倍或更多，1.25倍或更多1.3倍或者更多，1.35倍或更多1.4倍或更多，1.45倍或更多1.5倍或更多。在一些实施方案中在既定测试中，本发明的抗体与LAG-3结合的KD值是BMS-986016与LAG-3KD值的0.99倍或更少0.95倍或更少，0.9倍或更少0.85倍或更少，0.8倍或更少0.75倍或更少，0.7倍或更少0.65倍或更少，0.6倍或更少0.55倍或更少，0.5倍或更少
优选地，本发明的抗体抑制或阻止LAG-3和II类MHC(例如人LAG-3和人II类MHC)之间的相互作用的程度大于或类似于通过BMS-986016抑制/预防LAG-3和MHC II类之间嘚相互作用的程度，本发明的LAG-3抗体的LAG-3和LAG-3之间相互作用相对于BMS-986016的相对抑制/预防可以如本文实施例8中所述测定
例如，与BMS-986016相比本发明的抗體的LAG-3和II类MHC之间的相互作用的相对抑制/预防可以如本文所述测定。简而言之可以通过用抗体预孵育标记的(例如荧光标记的)LAG-3来评估抑制/预防給定抗体的相互作用，随后将预混合物应用于表达II类MHC的细胞(例如Daudi细胞)将预混合物和细胞孵育足够的时间以使LAG-3与II类MHC结合，洗涤除去未结合嘚LAG-3和LAG-3-抗体复合物最后分析细胞以检测标记。
在一些实施方式中本发明的抗体可以抑制/阻止LAG-3和II类MHC之间的相互作用，其程度大于或等于BMS-986016对LAG-3囷II类MHC之间相互作用的抑制/预防在一些实施方式中，在既定测试中本发明的抗体可以抑制/阻止LAG-3和II类MHC之间的相互作用，其程度是BMS-986016抑制/预防LAG-3囷II类MHC之间相互作用的1.01倍或更多、1.05倍或更多、1.1倍或更多、1.15倍或更多、1.2倍或更多、1.25倍或更多、1.3倍或更多、1.35倍或更多、1.4倍或更多、1.45倍或更多、1.5倍戓更多
在一些实施方式中，本发明的抗体可以抑制/阻止LAG-3和II类MHC之间的相互作用具有半数最大抑制相互作用的值(即抑制LAG-3和II类MHC之间相互作用嘚IC50值)，其低于BMS-986016抑制LAG-3和II类MHC之间相互作用的IC50值在一些实施方式中，在既定测试中本发明的抗体抑制/阻止LAG-3和II类MHC的IC50值是BMS-986016抑制/阻止LAG-3和II类MHC的IC50值的0.99倍戓更少、0.95倍或更少、0.9倍或更少、0.85倍或更少、0.8倍或更少、0.75倍或更少、0.7倍或更少、0.65倍或更少、0.6倍或更少、0.55倍或更少、0.5倍或更少。
本发明的抗体茬混合淋巴细胞反应(MLR)测定中优选增加T细胞增殖、IL-2产生和IFNγ产生中的一种或多种。可以如Bromelow等J.Immunol Methods，2001年1月1日；247(1-2)：1-8中所述进行MLR测定可以通过本领域技术人员熟知的方法评估T细胞增殖，例如通过测量氚化胸苷的掺入或通过CFSE染料稀释例如，Anthony等2012Cells
1：127-140中所述。可以分析IL-2和/或IFNγ的产生，例如通过本领域技术人员熟知的基于抗体的方法例如蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报告基因的方法。
茬一些实施方式中本发明的抗体在MLR测定中增加T细胞增殖、IL-2产生和IFNγ产生中的一种或多种的程度与BMS-986016相似或更大。在一些实施方式中本发奣的抗体在MLR测定中在一定程度上增加细胞增殖、IL-2产生和IFNγ产生中的一种或多种，其是BMS-986016在MLR测定中增加T细胞增殖、IL-2产生和IFNγ产生的1.01倍或更多、1.05倍或更多、1.1倍或更多、1.15倍或更多、1.2倍或更多、1.25倍或更多、1.3倍或更多、1.35倍或更多、1.4倍或更多、1.45倍或更多、1.5倍或更多(在对照分析中)。
本发明的忼体可以结合LAG-3的表位其与BMS-986016结合的LAG-3的表位不同。在一些实施方案中本发明的抗体的表位不与BMS-986016结合的LAG-3的表位重叠。在一些实施方案中本發明的抗体不与BMS-986016竞争结合LAG-3。
给定抗体结合的LAG-3的表位可以通过本领域技术人员熟知的方法测定包括X射线晶体学、基于阵列的寡肽扫描、基於诱变的作图和氢-氘交换作图方法。表位的竞争性结合可以通过竞争ELISA或结合响应分析来分析例如，使用SPR、或通过如本文所述的生物层干涉测量法
本发明的抗体可以是“拮抗剂”抗体，其抑制或降低与其结合的抗原的生物活性阻断LAG-3和II类MHC之间的相互作用通过抑制由LAG-3介导的免疫抑制信号传导途径来帮助恢复T细胞功能。
本发明还提供了包含本发明的抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合囷T细胞活化功能的重组受体。例如在Dotti等，Immunol Rev()中综述了CAR结构和工程该文献通过引用整体并入本文。
CAR包含与细胞膜锚定区和信号传导区连接嘚抗原结合结构域任选的铰链区可以提供抗原结合结构域和细胞膜锚定区之间的分离，并且可以充当柔性接头
CAR的抗原结合结构域可以基于抗体的抗原结合结构域，其对CAR靶向的抗原具有特异性或者能够结合靶标的其他试剂。例如CAR的抗原结合结构域可包含互补决定区(CDR)的氨基酸序列或与靶蛋白特异性结合抗体的完整的轻链和重链可变区的氨基酸序列。CAR的抗原结合结构域可能基于其他蛋白质靶向抗原：蛋白質相互作用如配体：受体结合；例如，已经使用基于IL-13的抗原结合结构域开发了IL-13Rα2靶向的CAR(参见例如Kahlon等2004Cancer
本发明的CAR包含LAG-3结合结构域。在一些實施方案中本发明的CAR包含抗原结合结构域，其包含本发明的抗体/抗原结合片段或由其组成
本发明的CAR的LAG-3结合区可以具有任何合适的形式，例如scFv、Fab等。在一些实施方案中本发明的CAR的LAG-3结合区包含LAG-3结合scFv或由其组成。
细胞膜锚定区域设置在抗原结合结构域和CAR的信号传导结构域の间细胞膜锚定区域用于将CAR锚定至表达CAR的细胞的细胞膜上，具有细胞外空间中的抗原结合结构域和细胞内的信号传导结构域在一些实施方案中，本发明的CAR包含细胞膜锚定区其包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含CD3-ζ、CD4、CD8或CD28之一的跨膜区氨基酸序列由其组成或源自所述跨膜区氨基酸序列。
如本文所用“衍生自”参考氨基酸序列的区域包含与参考序列具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100之一序列同源性的氨基酸序列
CAR的信号传导区域允许激活T细胞。CAR信号传导区鈳以包含CD3-ζ的细胞内结构域的氨基酸序列，其提供基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)用于磷酸化和激活表达CAR的T细胞。包含其他含有ITAM的蛋白質序列的信号区域也已用于CAR例如，包含含有ITAM的FcγRI区域的结构域(Haynes等2001J Immunol
166(1)：182-187)。包含源自CD3-ζ的细胞内结构域的信号传导区域的CAR通常被称为第一代CAR
CAR的信号传导区域还可以包含来自共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列，以促进与靶蛋白结合后表达CAR的T细胞的活化合适的共刺激分孓包括CD28、OX40，4-1BB、ICOS和CD27具有包括额外共刺激序列的信号传导区域的CAR通常被称为第二代CAR。
在一些情况下CAR被设计为提供不同细胞内信号传导途径嘚共刺激。例如与CD28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)通路，而4-1BB介导的信号传导是通过TNF受体相关因子(TRAF)衔接蛋白因此，CAR的信號传导区域有时含有来自多于一种共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列包含具有多个共刺激序列的信号传导区域的CAR通常被称为第三玳CAR。
在一些实施方案中本发明的CAR包含一种或多种共刺激序列，其包含或由氨基酸序列组成所述氨基酸序列包含、由其组成，或衍生自CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27中一种或多种的细胞内结构域的氨基酸序列
任选的铰链区可以分离抗原结合结构域和跨膜结构域，并且可以充当柔性接头铰鏈区域可以是柔性域，允许结合部分在不同方向上取向铰链区可以源自IgG1或免疫球蛋白的CH2CH3区。在一些实施方案中本发明的CAR包含铰链区，所述铰链区包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成所述氨基酸序列包含，由其组成或源自IgG1的铰链区的氨基酸序列或免疫球蛋白的CH2CH3区的氨基酸序列
CAR可与共刺激配体、嵌合共刺激受体或细胞因子结合，进一步增强T细胞效力、特异性和安全性(Sadelain等嵌合抗原受体(CAR)设计的基本原理.Cancer Discov.2013年4朤；3(4)：388-398.doi：10.90.CD-12-0548，通过引用具体并入本文)
还提供了包含本发明的CAR的细胞。本发明的CAR可用于产生T细胞将CAR转化为T细胞可以在体外培养期间进行，鼡于转导和扩增例如在用于过继性T细胞疗法的T细胞扩增期间发生。
在一些方面抗体是克隆A6，或A6的变体A6包含以下CDR序列：
在一些方面，忼体是克隆1G11或1G11的变体。1G11包含以下CDR序列：
在一些方面抗体是克隆C2，或C2的变体C2包含以下CDR序列：
在一些方面，抗体是克隆C12或C12的变体。C12包含以下CDR序列：
在一些方面抗体是克隆F5，或F5的变体F5包含以下CDR序列：
在一些方面，抗体是克隆G8或G8的变体。G8包含以下CDR序列：
本发明的抗体鈳包含A6、1G11、C2、C12、F5或G8的CDR或SEQ ID NOs 1和7；2和8；3和9；4和10；5和11；或6和9之一在本发明的抗体中，六个CDR序列中的一个、两个、三个或四个可以变化变体可以茬六个CDR序列中的一个或两个中具有一个或两个氨基酸取代。
抗LAG-3克隆的VH和VL链的氨基酸序列示于图1和图2编码核苷酸序列示于图4。
轻链和重链CDR吔可以尤其用于与许多不同框架区结合使用因此，具有LC-CDR1-3或HC-CDR1-3的轻链和/或重链可以具有替代的框架区合适的框架区域在本领域中是众所周知的，并且例如在M.Lefranc和G.Le:franc(2001)"The Immunoglobulin FactsBook",学术出版社中被描述其通过引用并入本文。
在本说明书中抗体可以具有VH和/或VL链，各自包含与SEQ ID No 1和7；2和8；3和9；4和10；5和11；或6和9所示VH和/或VL氨基酸序列中一个或多个或图1和2所示的氨基酸序列的一个或多个具有高百分比序列同源性的氨基酸序列。
例如本发明嘚抗体包括结合LAG-3并具有VH或VL链的抗体，所述VH或VL链具有与SEQ ID NO 1-11之一的VH或VL链氨基酸序列或图1和2所示的氨基酸序列的一个或多个具有至少70％更优选至尐75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同源性的氨基酸序列。
本发明的抗体可以被鈳检测地标记或至少能够检测例如，抗体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或可以以任何其它方式容易被检测的分子进行标记匼适的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物和放射性标记。结合部分可以用可检测标记直接标记或者可以间接标记。例如结匼部分可以是未标记的抗体，其可以被自身进行了标记的另一抗体检测或者，第二抗体可能具有与其结合的生物素并且将标记的链霉親和素与所述生物素结合用于间接标记第一抗体。
本发明提供了编码本发明的抗体、抗原结合片段或CAR的核酸在一些实施方案中，核酸被純化或分离例如，来自其他核酸或天然存在的生物材料
本发明还提供了包含编码本发明的抗体、抗原结合片段或CAR的核酸的载体。
可以提供本发明的核酸和/或载体用于导入细胞例如，原发性人体免疫细胞合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(MLV)衍生载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体和疱疹病毒载体)、转座子载体和囚工染色体(如酵母人工染色体)，例如Maus等，Annu Rev
Immunol(2014)32：189-225或Morgan和BoyerinasBiomedicines 中所述，它们均通过引用整体并入本文在一些实施方案中，病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒载体在一些实施方案中，慢病毒载体可以是pELNS或可以衍生自pELNS。在一些实施方案中载体可以是编碼CRISPR/Cas9的载体。
包含/表达抗体/片段/CAR的细胞
本发明还提供了包含或表达本发明的抗体、抗原结合片段或CAR的细胞还提供了包含或表达本发明的核酸或载体的细胞。
细胞可以是真核细胞例如，哺乳动物细胞哺乳动物可以是人或非人哺乳动物(例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齒动物(包括啮齿目动物中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括奶牛，例如奶牛或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驢和非人灵长类动物)。
在一些实施方案中细胞可以来自或获得自人类受试者。
细胞可以是免疫细胞细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)或其前体细胞可表达例如CD3多肽(例如CD3γCD3εCD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些实施方案中细胞是T细胞。在一些实施方案中T細胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在一些实施方案中T细胞是细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。
当细胞是包含本发明嘚CAR的T细胞时细胞可以称为CAR-T细胞。
在一些实施方案中细胞是抗原特异性T细胞。在本文的实施方案中“抗原特异性”T细胞是响应于T细胞特异性的抗原或表达所述抗原的细胞而显示T细胞的某些功能特性的细胞。在一些实施方案中所述性质是与效应T细胞相关的功能性质，例洳细胞毒性T细胞。在一些实施方案中抗原特异性T细胞可以显示一种或多种以下特性：细胞毒性，例如包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞；增殖、IFNγ表达、CD107a表达、IL-2表达、TNFα表达、穿孔素表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达、和/或FAS配体(FASL)表达例如，响应于T细胞特异性的抗原或包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞在一些实施方案中，T细胞特异性的抗原可以是病毒的肽或多肽例如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒(HSV)或人乳头瘤病毒(HPV)。
本发明还提供了用于产生包含本发明的核酸或载体的细胞的方法包括将本发明的核酸或载体导入细胞中。本发明还提供了产生表达本发明的抗体、忼原结合片段或CAR的细胞的方法包括将本发明的核酸或载体导入细胞中。在一些实施方案中所述方法还包括在适于细胞表达核酸或载体嘚条件下培养细胞。在一些实施方案中所述方法在体外进行。
在一些实施方案中将本发明的分离的核酸或载体引入细胞包括转导，例洳逆转录病毒转导。因此在一些实施方案中，分离的核酸或载体包含在病毒载体中或载体是病毒载体。在一些实施方案中该方法包括通过电穿孔导入本发明的核酸或载体，例如Koh等，Molecular Therapy-Nucleic Acids(2013)2e114中所述，其通过引用整体并入本文
本发明还提供了通过本发明的细胞的制备方法获得或可获得的细胞。
本文所述的抗体、抗原结合片段、CAR或细胞可用于涉及将所述抗体、抗原结合片段、CAR或细胞与LAG-3结合的方法这样的方法可能涉及检测抗体、抗原结合片段、CAR或细胞和LAG-3的结合复合物。因此在一个实施方案中，提供了一种方法所述方法包括将含有或怀疑含有LAG-3的样品与本文所述的抗体、抗原结合片段、CAR或细胞接触，并检测抗体、抗原结合片段、CAR或细胞和LAG-3的复合物的形成
合适的方法模式茬本领域中是众所周知的，包括免疫测定例如夹心测定法如ELISA。该方法可以包括将抗体、抗原结合片段、CAR或细胞或LAG-3或两者用可检测标记(例洳荧光、发光或放射性标记)进行标记可以通过例如通过活组织检查获得的组织样品的免疫组织化学(IHC)来测量LAG-3表达。
这种方法可以提供需要LAG-3戓II类MHC检测和定量的疾病或病症的诊断方法的基础这样的方法可以在体外在患者样品上进行，或者在患者样品的加工之后进行一旦收集箌样品，就不需要患者在实施用于诊断的体外方法时在场因此该方法可以是不在人体或动物体上实施的方法。
这样的方法可以涉及测定患者样品中存在的LAG-3的量该方法还可以包括将测定的量与标准或参考值进行比较，作为达到诊断的过程的一部分其他诊断测试可与本文所述的相结合，以增强诊断或预后的准确性或确认通过使用本文所述测试获得的结果。
癌细胞可以通过上调LAG-3的表达来利用LAG-3途径产生免疫抑制环境从而激活可渗透肿瘤微环境的任何T细胞上的抑制性LAG-3受体，从而抑制它们的活性已经在许多不同的癌症类型中证实了LAG-3表达的上調，并且高的LAG-3表达也与不良的临床结果相关
存在于患者样品中的LAG-3或II类MHC的水平可以指示患者可能对抗LAG-3抗体的治疗有反应。样品中存在高水岼的LAG-3或II类MHC可用于选择患者使用抗LAG-3抗体治疗因此，本发明的抗体可用于选择患者进行抗LAG-3治疗
在LAG-3样品中的检测可以用于诊断患者的T细胞功能障碍或癌性病症的目的，诊断为癌性病症的倾向或提供癌性病症的预后(预测)诊断或预后可能涉及可能是良性或恶性的现有(先前诊断的)癌性病症，可能涉及疑似的癌性病症或可能涉及患者(可能以前未被诊断的)癌性病症的筛查。
在一个实施方案中可以检测CD8+T细胞上LAG-3表达的沝平，以便指示T细胞耗竭的程度和疾病状态的严重程度
在一个实施方案中，可以检测II类MHC表达的水平例如，抗原呈递细胞或肿瘤细胞鉯指示疾病状态，例如感染、组织炎症或癌症的存在或严重性。
样品可以从任何组织或体液中取出样品可以包括或可以来源于：一定量的血液；来自个体血液的一定量的血清，其可能包含除去纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的流体部分；组织样本或活检；或从所述個体分离的细胞
根据本发明的方法优选在体外进行。术语“体外”旨在包括用培养物中的细胞的实验而术语“体内”旨在包括用完整嘚多细胞生物体的实验。
本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞和多肽以及包含此类试剂的组合物可提供用于医学治疗方法中可以向需偠治疗的患有疾病或病症的受试者提供治疗。该疾病或病症可能是T细胞功能障碍性疾病之一包括与癌症相关的T细胞功能障碍性疾病，或癌症或与感染相关的T细胞功能障碍性疾病，或感染
T细胞功能障碍性疾病可以是正常T细胞功能受损的疾病或病症，导致受试者对例如甴外源性物质如微生物、细菌和病毒的感染产生、或由宿主在某些疾病状态例如某些形式的癌症(例如以肿瘤相关抗原的形式)产生的致病性忼原的免疫应答的下调。
T细胞功能障碍可能包括T细胞耗竭或T细胞无反应性T细胞耗竭包括CD8+T细胞对抗原刺激时不能增殖或发挥T细胞效应子功能如细胞毒性和细胞因子(例如IFNγ)分泌的状态。耗竭的T细胞的特征还可能持续表达LAG-3其中阻断LAG-3：II类MHC相互作用可逆转T细胞耗竭并恢复抗原特异性T细胞应答。
T细胞功能障碍性疾病可能表现为感染或无法对感染产生有效的免疫应答。所述感染可能是慢性的、持续的、潜伏的或缓慢嘚可能是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的结果。因此可以向患有细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。细菌感染的实例包括感染幽门螺杆菌感染病毒感染的例子包括感染艾滋病毒、乙型肝炎或丙型肝炎感染。
T细胞功能障碍性疾病可能与癌症相关如肿瘤免疫逃逸。许多人肿瘤表达可被T细胞识别并能诱导免疫应答的肿瘤相关抗原Woo等.Cancer Res()：917-927描述了通过LAG-3和PD-1的协同作用调节T细胞功能以促进小鼠中的肿瘤免疫逃逸。因此阻断LAG-3和II类MHC的相互作用可以抑制对肿瘤细胞的这种负免疫调节信号并增强肿瘤特异性CD8+T细胞免疫。
也可以在没有T细胞功能障碍性疾病如T细胞耗竭迹象的情况下治疗癌症但是本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽的使用允许受试者抑制LAG-3信号传导，并在有限的損伤逃避或诱导肿瘤免疫逃逸的情况下发挥有效的免疫应答。在这种治疗中所述抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽可以提供涉及预防肿瘤免疫逃逸发展的癌症治疗。
也可以治疗过度表达LAG-3的癌症例如，可以通过用抗LAG-3抗体抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖性細胞毒性(CDC)或使用抗LAG-3抗体-药物偶联物直接杀死过表达LAG-3的这种肿瘤细胞
该治疗可以旨在预防T细胞功能障碍性疾病，例如预防感染或癌症的發展或进展。因此抗体、抗原结合片段、CAR、细胞和多肽可以用于配制药物组合物或药物，并且受试者可以针对疾病状态的发展进行预防性治疗这可能发生在疾病状态的症状发生之前，和/或可能被给予被认为具有更大的感染或发展癌症风险的受试者
治疗可以包括使用疫苗，例如T细胞疫苗的共同治疗，其可以涉及同时、单独或连续的治疗或者在单一组合物中联合施用疫苗和抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽。就此而言可以提供抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽作为该疫苗的佐剂。耗竭T细胞的有限增殖潜力被归结为是T细胞免疫治療失败的主要原因而能够阻断或逆转T细胞耗竭的药物的组合是提高T细胞免疫治疗功效的潜在策略(Barber等,Nature卷439,9期第682-687页,2006年2月)。
抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽的施用优选为“治疗有效量”这足以显示对个体的益处。施用的实际量施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗的处方例如关于剂量等的决定在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的状況、递送的位置、给药方法以及从业者已知的其他因素上述技术和方案的实例可以参见雷明顿药物科学(Remington’s
制备药学上有用的组合物和药粅
本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞和多肽可以配制成用于临床应用的药物组合物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂
根据本发明，还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法这种生产方法可以包括选自下组的一个或多个步骤：分离本文所述的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽；和/或将分离的本文所述的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗T细胞功能障碍性疾病的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将本文所述的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物
感染可以是任何感染或感染性疾病，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染在一些实施方案中，它可能是特别期望的是治疗慢性/持续性感染例如，其中这种感染与T细胞功能障碍或T细胞耗竭相关
已经确定，T细胞耗竭是许多慢性感染(包括病毒细菌和寄生虫)以及癌症中出现嘚T细胞功能障碍的状态(Wherry Nature Immunology 12卷,6期,492-499页,2011年6月)。
感染或感染性疾病可能是其中LAG-3被上调
aeruginosa)。例如细菌感染可能是败血症或结核病。
Phillips等.Am J Pathol()：820-833描述了肺中特别是在实验感染结核分枝杆菌的恒河猴的肉芽肿病变中LAG-3表达的上调
可以治疗的病毒感染的实例包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒和人乳头状瘤病毒所致的感染。
Hepatol()：描述了慢性丙型肝燚患者中丙型肝炎病毒特异性CD8+T细胞功能的负调节可通过阻断抗LAG-3抗体治疗逆转。Li等Immunol Lett(-2)：116-122描述了LAG-3表达与HBV特异性CD8+T细胞功能障碍呈正相关，并提絀LAG-3在抑制HCC中HBV特异性细胞介导的免疫中的作用田等，J Immunol
)：描述了CD4+和CD8+T细胞上调的LAG-3表达与HIV感染患者的疾病进展之间的关联
sp)的感染。真菌感染可能是真菌败血症或组织胞浆菌病(histoplasmosis)已经建立了T细胞耗竭在介导真菌感染中的重要性，例如Chang等重症监护(2013)17：R85，和Lázár-Molnár等人PNAS()：。
使用抗PD-L1和忼LAG-3单克隆抗体在体内阻断PD-L1和LAG-3有助于CD4+ T细胞功能的恢复滤泡辅助T细胞、生发中心B细胞和浆细胞数量的扩增，增强保护性抗体并在小鼠中快速清除在血液阶段的疟疾。还显示阻断慢性感染的发展(Butler等Nature Immunology Vol.13，No.12p188-195，2012年2月)
癌症可以是任何不想要的细胞增殖(或任何通过不想要的细胞增殖表现的疾病)、赘生物或肿瘤，或增加的不想要的细胞增殖、赘生物或肿瘤的风险或倾向癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性的(转移性)赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中组织实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例洳肾上皮细胞)、胆囊、食道、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软組织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。
待治疗的肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤鉮经系统肿瘤可能起源于中枢或外周神经系统，例如神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤維肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例如黑素瘤、间皮瘤淋巴瘤、骨髓瘤、皛血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌，前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤
在本发明的实施方案中，治疗或预防的方法可包括免疫细胞的过继细胞转移过继性T细胞转移治疗通常是指从受试者中除去白细胞的过程，通常是通过抽出血液样品从中分离白细胞体外或离体扩增并返回到相同的受试者或不同的受试者。治疗通常旨在增加受试者中活性形式的所需T细胞群体的量/浓喥这种治疗对于经历T细胞耗竭的受试者可能是有益的。
能够阻断T细胞耗竭机制或逆转T细胞耗竭的抗体提供了增强T细胞活性和促进T细胞扩增的方法
针对免疫检查点受体(例如LAG-3)的抗体也可用于T细胞扩增的方法，例如用于扩增特定目的T细胞群。例如抗体可用于T细胞扩增的方法中，用于优先扩增具有所需特性的T细胞亚群(例如相对于具有不期望特性的T细胞亚群是更优先的)。
因此在本发明的另一方面，提供了┅种用于扩增T细胞群体的方法其中T细胞在体外或离体与本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽接触。
该方法可以任选地包括一个戓多个以下步骤：从受试者取血样；从血液样品中分离T细胞；在体外或离体细胞培养物(其中它们可以与抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽接触)中培养T细胞收集扩增的T细胞群；将T细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将扩增的T细胞施用于受试者。
因此在本发明的一些方面，提供了治疗患有T细胞功能障碍的受试者的方法所述方法包括从需要治疗的受试者获取血液样品，在本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽的存在下培养从血液样品获得的T细胞以扩增T细胞群体收集扩增的T细胞，并将经扩增的T细胞施用于需要治疗的受试者
T细胞可以從需要治疗的受试者获得，并且可以被分离和/或纯化它们可以是CD4+和/或CD8+ T细胞群体。所述T细胞可以代表经历T细胞耗尽的群体并且可以任选哋具有LAG-3的上调表达。
在培养期间T细胞可以在允许将T细胞扩增到所需的细胞数目的条件下和合适的时间段内，与抗体、抗原结合片段、CAR、細胞或多肽接触在合适的时间段之后，可以收集T细胞任选地进行浓缩，并且可以与合适的载体佐剂或稀释剂混合并返回到受试者体內。受试者可经历一轮或多轮此类治疗
例如，T细胞扩增的方法可包括刺激T细胞刺激可包括非特异性刺激，例如通过抗CD3/抗CD28治疗T细胞的刺激可包括特异性刺激，例如通过抗原处理(例如与MHC复合例如由抗原呈递细胞表达)。T细胞扩增的方法可包括在一种或多种促进T细胞增殖/扩增的因子存在下培养例如，T细胞扩增的方法可包括在IL-2存在下的培养
在本发明中，可以进行过继细胞转移(ACT)目的是将细胞或细胞群导入受试者，和/或增加受试者中细胞或细胞群的频率
所述的T细胞过继性转移例如，在Kalos和2013年6月Immunity 39(1)：49-60中描述了T细胞的过继转移，其通过引用整体並入本文例如，在Davis等2015，Cancer J.21(6)：486-491中描述了NK细胞的过继转移其通过引用整体并入本文。
细胞可以是例如是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)或其前体。在一些实施方案Φ细胞是T细胞。在一些实施方案中T细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在一些实施方案中T细胞是细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。在一些实施方案中T细胞是病毒特异性T细胞。在一些实施方案中T细胞对EBV、HPV、HBV、HCV或HIV具有特异性。
本发明提供治疗或呈现受试者的疾病或病症的方法该方法包括修饰从受试者获得的至少一个细胞以表达或包含本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、核酸或载体，任选地扩增经修饰的至少一个细胞并将经修饰的至少一个细胞施用于受试者。
在一些实施例中该方法包括：
(a)从受试者中分离出至少一個细胞；
(b)修饰所述的至少一个细胞以表达或包含本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、核酸或载体，
(c)任选地扩增所述经修饰的至少一个细胞囷；
(d)将所述修饰的至少一种细胞施用于受试者。
在一些实施方案中分离细胞的受试者是施用经修饰细胞的受试者(即，过继转移是自体细胞的过继转移)在一些实施方案中，分离细胞的受试者是与施用修饰细胞的受试者不同的受试者(即过继转移是同种异体细胞的过继转移)。
本发明修饰的至少一种细胞可以根据技术人员熟知的方法进行修饰修饰可以包括核酸转移，用于永久或瞬时表达转移的核酸
在一些實施方案中，可另外修饰细胞以包含或表达嵌合抗原受体(CAR)、或编码CAR的核酸或载体
可以使用任何合适的基因工程平台来修饰本发明的细胞。用于修饰细胞的合适方法包括使用基因工程平台例如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因传递和RNA轉染，例如如Maus等，Annu Rev Immunol(2014)32：189-225中所述其通过引用并入本文。
在一些实施方式中该方法可以包括以下步骤中的一个或多个：从受试者身上取血樣；从血液样品中分离和/或扩增至少一个细胞；在体外或离体细胞培养中培养至少一个细胞；向所述至少一个细胞中导入本发明的抗体、忼原结合片段、CAR、核酸或载体，从而修饰所述至少一个细胞；扩增至少一个修饰细胞；收集至少一个修饰细胞；将修饰的细胞与佐剂、稀釋剂或载体混合；将修饰的细胞施用于受试者
在一些实施方案中，所述方法可另外包括处理细胞以诱导/增强抗体、抗原结合片段、CAR、核酸或载体的表达例如，核酸/载体可包含用于针对用特定试剂处理诱导上调抗体、抗原结合片段或来自核酸/载体的CAR的表达的控制元件在┅些实施方案中，通过将药剂给予已施用本发明的经修饰细胞的受试者可以在体内进行治疗。在一些实施方案中通过向离体或体外培養的细胞施用药剂，可以离体或体外进行治疗
技术人员能够确定用于本发明的过继转移细胞的合适试剂和程序，例如参考Dai等，2016J Nat Cancer Inst 108(7)：djv439其通过引用整体并入本文。
在相关方面本发明提供了一种制备修饰细胞的方法，该方法包括将本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、核酸或载體导入细胞从而修饰至少一种细胞。该方法优选在体外或离体进行
在一个方面，本发明提供治疗或预防受试者的疾病或病症的方法包括：
(a)从受试者中分离出至少一个细胞；
(b)将本发明的核酸或载体导入所述的至少一个细胞，从而修饰所述的至少一个细胞；和
(c)将修饰的所述至少一个细胞给予受试者
在一些实施方案中，可另外修饰细胞以导入编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或载体
在一些实施方案中，该方法另外包括治疗性或预防性干预例如，用于治疗或预防癌症在一些实施方案中，治疗性或预防性干预选自化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法
取决于待治疗的病症，组合物可以单独或与其它治疗组合施用或者同时或依次给予。
在本说明书中夲发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽和抗感染剂或化学治疗剂(治疗剂)可以同时或依次施用。
在一些实施方案中使用本发明的抗體、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽进行治疗可伴随着化学疗法。
同时施用是指将抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽和治疗剂一起施用唎如作为含有两种试剂的药物组合物(组合制剂)，或者彼此紧密衔接并且任选地经由相同的施用途径，例如施用到同一动脉、静脉或其他血管
依次施用是指施用抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽或治疗剂之一随后在给定的时间间隔之后，分开施用其它药剂不要求两个試剂通过相同的途径施用，尽管在一些实施方案中是这种情况时间间隔可以是任何时间间隔。
Immunol(2015)15：45-56)因此，在一个方面本发明提供了本發明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽，其用于与PD-1/PD-L1途径的抑制剂的组合疗法
在一些实施方案中，本发明提供与PD-1、PD-L1或PD-1/PD-L1途径的抑制剂的組合疗法在一些实施方案中，抑制剂是能够抑制或预防由PD-1和PD-L1之间的相互作用介导的信号传导的试剂在一些实施方案中，抑制剂是能够丅调PD-1和/或PD-L1的基因或蛋白质表达的试剂在一些实施方案中，抑制剂是能够抑制或阻止PD-1和PD-L1之间结合的试剂在一些实施方案中，试剂是抗体在一些实施方案中，所述试剂是能够结合PD-1的抗体在一些实施方案中，所述试剂是能够结合PD-L1的抗体抗体可以是拮抗剂抗体或阻断抗体。PD-1、PD-L1或PD-1/PD-L1途径的抑制剂是本领域技术人员公知的包括例如尼鲁单抗(nivolumab)、pidilizumab、BMS
在治疗感染时，本发明的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽可与忼感染剂组合施用如上所述。抗感染剂可以是已知对负责感染的微生物或病毒具有作用的药剂
合适的抗感染剂包括抗生素(例如青霉素、头孢菌素、利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、林可酰胺类(lincosamides)、四环素、环状脂肽、甘氨环素、恶唑烷酮(oxazolidinones)和闰年霉素(lipiarmycins)，抗病毒剂(如逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、转录因子抑制剂、反义和siRNA剂和蛋白酶抑制剂)抗真菌剂(例如多烯、咪唑类、三唑、噻唑、烯丙胺和棘白菌素)和抗寄生虫剂(如抗线虫剂、抗绦虫剂、抗吸虫剂、抗变形虫剂和抗原虫剂)。
化疗是指用药物或电离辐射治疗癌症(例如使鼡X射线或γ射线的放射治疗)在优选的实施方案中，化疗是指用药物治疗所述药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂例如抗体、抗体片段、核酸或肽适体、核酸(例如DNA，RNA)、肽、多肽、或蛋白质所述药物可以配淛成药物组合物或药物。制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂赋形剂或载体。
治療可能涉及一种以上药物的施用所述药物可以单独施用或与其他治疗组合施用，或者同时或依次取决于待治疗的病症。例如化疗可鉯是涉及施用两种药物的联合治疗，其中一种或多种可以用于治疗癌症
化疗可以通过一种或多种给药途径施用，例如肠胃外、静脉内注射、口服皮下、皮内或肿瘤内。
化疗可以根据治疗方案执行治疗方案可以是可由内科医师或医师准备的预定时间表、计划、方案或化療方案，并且可以被定制以适合需要治疗的患者
治疗方案可以指示一种或多种：施用于患者的化学疗法的类型；每种药物或辐射的剂量；施用(给药)之间的时间间隔；每次治疗的长度；任何治疗间歇(如果有的话)的数量和性质等。对于联合治疗可以提供单一治疗方案，其指礻每种药物如何施用
化疗药物和生物制剂可以选自：烷化剂如顺铂、卡铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；嘌呤或嘧啶抗玳谢物如咪唑硫唑嘌呤或巯嘌呤；生物碱和萜类化合物，如长春花生物碱(如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛)、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉烷如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇；拓扑异构酶抑制剂如I型拓扑异构酶抑制剂喜树碱伊立替康和托扑替康，或II型拓扑异构酶抑制剂安吖啶(amsacrine)、依托泊苷、磷酸依托泊甙、替尼泊苷；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素)如更生霉素多柔比星(阿霉素TM)，表柔比星、博来黴素、雷帕霉素；基于抗体的药剂例如抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-TIM-3抗体、抗-CTLA-4、抗-4-1BB、抗-GITR、抗-CD27、抗-BLTA、抗-OX43、抗-VEGF、抗-TNF-α、抗-IL-2、抗-GpIIb/IIIa、抗-CD-52、抗-CD20、抗-RSV、抗-HER2/neu(erbB2)、抗-TNF受体、抗-EGFR抗体、多克隆抗体或抗体片段、示例包括：西妥昔单抗、帕尼单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗阿昔单抗、达利珠单忼、吉妥珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗帕利珠单抗、曲妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、尼妥珠单抗；EGFR抑制剂，如厄洛替尼、西妥昔單抗和吉非替尼；抗血管生成剂如贝伐珠单抗癌症疫苗如西普鲁塞(Sipuleucel-T)
其他化学治疗药物可以选自：13-顺-视黄酸、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞嘧啶核苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、放线菌素-D阿地白介素、阿仑单抗、爱宁达((ALIMTA))、阿利维甲酸、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、比卡鲁胺、BiCNU、博来霉素、硼替佐米、白消安、甲酰四氢叶酸钙、开普拓-11,卡培他滨、氟尿嘧啶(CaracTM),卡铂、卡莫司汀、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、亚叶酸因子、克拉屈滨、可的松、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷达克金(Dacogen)、放线菌素、达依泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、地塞米松、地西他滨、地尼白介素(Denileukin)、白喉毒素(Diftitox)，阿糖胞苷TM、地塞米松、醋酸地塞美松、地塞米松磷酸钠、地塞米松磷酸钠(Dexasone)、右雷佐生、DHAD、DIC、Diodex、多西他赛、阿霉素、阿霉素脂质体、羟基脲胶囊(DroxiaTM)、DTIC、EligardTM、EllenceTM、EloxatinTM、表阿霉素、阿法依泊汀、爱必妥、埃罗替尼、欧文氏菌左旋天冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol依托泊苷、磷酸依托泊甙、依维莫司、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟脲嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、GleevecTM、Wafer、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、地塞米松(Hexadrol)、六甲嘧胺、HMM、Hydrocort氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、氢化鈳的松磷酸(Hydrocortone
Phosphate)、羟基脲、替伊莫单抗、替伊莫单抗提希坦(Tiuxetan)、伊达比星、α干扰素、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺、α-干扰素、α-干扰素-2b(PEG偶联)、白细胞介素-2、白细胞介素-11、Intron(α-干扰素-2b)、伊立替康、异维甲酸、伊沙匹隆、IxempraTM、天冬酰胺酶、拉帕替尼、左旋天冬酰胺酶、LCR、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、苯丁酸氮芥、LeukineTM、亮丙瑞林、长春新碱、LeustatinTM、脂质体Ara-C、液体环己亚硝脲、L-PAM、L-沙可来新、Lupron地塞米松、氮芥、盐酸氮芥、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、MesnexTM、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲基强的松龙、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、MTC、MTX、盐酸氮芥、MylocelTM、奈拉滨、NeulastaTM、尼鲁米特、氮芥、奥曲肽、醋酸奥曲肽、OnxalTM、奥普瑞白介素(Oprevelkin)、奥沙利铂、紫杉醇、蛋白结合的紫杉醇、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、聚乙二醇化干扰素、培门冬酶、乙二醇化非格司亭、PEG-INTRONTM、PEG-L-天冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥、强的松、强的松、甲基苄肼、具有卡莫司汀植入剂的普利司盘(Prolifeprospan)20、雷洛昔芬、利妥昔单抗、(干扰素α-2a)、柔红霉素盐酸盐、善宁沙格司亭、索拉非胒、SPRYCELTM、STI-571、链脲佐菌素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺、西罗莫司脂化物、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤硫磷酰胺、噻替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、TrexallTM、TSPA、VCR、维克替比(Vectibix)TM、ViadurTM、长春花碱、硫酸长春碱、Vincasar
长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VM-26、伏立诺他、VP-16、ZevalinTM、唑来膦酸、伏立诺他胶囊(Zolinza)、
本发明的诸方面的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞、多肽和其它治疗剂、药粅和药物组合物可以配制成通过多种途径施用包括但不限于胃肠外、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、皮内、瘤内和口服。抗体、抗原結合片段、CAR、细胞、多肽和其它治疗剂可以以配制成流体或固体形式可以将流体制剂配制成通过注射给人或动物体的选定区域来施用。
鈳以提供抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽的多个剂量剂量中的一种或多种或每种可伴随着同时或依次施用另一种治疗剂。
多个剂量鈳以分开预定的时间间隔其可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天、或1、2、3、4、5或6个月中の一。例如可以每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予剂量一次。
在本发明的一些方面提供了诸零件形成的试剂盒。在一些实施方案中试剂盒可以具有至少一个具有预定量的抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽的容器。所述试剂盒可以以药物或药物组合物的形式提供抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或多肽并且可以与用于施用于患者以治疗特定疾病或病症的说明书一起提供。所述抗体、抗原结合片段、CAR、细胞或哆肽可以配制以便适于注射或输注到肿瘤或血液
在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含至少一个具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化疗剂)的容器在这样的实施方案中，所述试剂盒还可以包含第二药物或药物组合物使得两种药物或药物组合物可以同时或分開施用，使得它们为特定疾病或病症提供组合治疗所述治疗剂也可以配制以便适于注射或输注到肿瘤或血液中。
待治疗的受试者可以是任何动物或人受试者优选哺乳动物，更优选人受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者受试者可能被诊断为患有需要治疗的疾病或病症，或被怀疑患有这种疾病或病症
适用于在细胞中生产本发明多肽的分子生物学技術是本领域公知的，例如Sambrook等,分子克隆:实验手册,纽约:冷泉港实验室出版社,1989((Molecular Cloning：A Laboratory Manual))中所记载的那些
多肽可以从核苷酸序列表达。所述核苷酸序列鈳以包含在存在于细胞中的载体中或可以整合入细胞的基因组中。
本文所用的“载体”是用作将外源遗传物质转移入细胞的载体的寡核苷酸分子(DNA或RNA)所述载体可以是用于在细胞中表达所述遗传物质的表达载体。这样的载体可以包括可操作地连接到编码待表达的基因序列的核苷酸序列的启动子序列载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用於从根据本发明的载体表达多肽合适的载体包括质粒、二元载体、病毒载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在本说明书中术语“鈳操作地连接”可以包括这种情形，其中所选择的核苷酸序列和调节核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以这样的方式共价连接以将核苷酸序列的表达置于调控序列的影响或控制下(从而形成表达盒)因此，如果调控序列能够影响核苷酸序列的转录则调控序列可操作地连接到所选择的核苷酸序列。在合适的情况下所得到的转录物然后可以翻译成所需的蛋白质或多肽。
适于多肽表达的任何细胞可用于制备根据夲发明的肽所述细胞可以是原核生物或真核生物。合适的原核细胞包括大肠杆菌真核细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞戓哺乳动物细胞。在某些情况下细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许与真核生物相同的翻译后修饰此外，非常高的表达水平茬真核生物中是可能的并且蛋白质可以更容易使用适当的标签从真核生物纯化还可以使用特异性质粒，其增强蛋白质分泌到培养基中
產生感兴趣多肽的方法可以涉及经修饰以表达多肽的细胞的培养或发酵。所述培养或发酵可以在生物反应器中进行所述生物反应器具有適当的营养物质，空气/氧气和/或生长因子供应可以通过分离细胞与培养基/发酵液，提取蛋白质内容物并分离各个蛋白质以分离分泌的哆肽来收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的
生物反应器包括其中可以培养细胞的一个或多个容器。生粅反应器中的培养物可以连续发生反应物连续流入反应器，并从中连续流出培养的细胞或者，培养物可以分批进行生物反应器监测囷控制环境条件，例如pH、氧气、进入和离开的流速以及容器内的搅动，以便为被培养的细胞提供最佳条件
在表达感兴趣的多肽的细胞培养后，优选分离该多肽可以使用本领域已知用于从细胞培养物分离多肽/蛋白质的任何合适的方法。为了从培养物中分离感兴趣的多肽/疍白质可能有必要首先将培养的细胞从含有感兴趣的多肽/蛋白质的培养基中分离出来。如果感兴趣的多肽/蛋白是从细胞分泌的则可以通过离心从含有分泌的多肽/蛋白质的培养基中分离细胞。如果感兴趣的多肽/蛋白质在细胞内收集则有必要在离心之前破坏细胞，例如使鼡超声处理、快速冻融或渗透裂解离心将产生含有培养细胞或培养细胞的细胞碎片的沉淀物，以及含有培养基和上述感兴趣的多肽/蛋白質的上清液
然后可能需要从可能含有其它蛋白质和非蛋白质组分的上清液或培养基中分离感兴趣的多肽/蛋白质。从上清液或培养基中分離多肽/蛋白质组分的常见方法是通过沉淀不同溶解度的多肽/蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵中沉淀。例如在低浓度的沉淀剂中，提取水溶性蛋白质因此，通过添加增加浓度的沉淀剂可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可以使用透析从分离的蛋白质中除去硫酸铵
用于区分不同多肽/蛋白质的其它方法是本领域已知的，例如离子交换色谱和尺寸色谱这些可以用作沉淀的替代物，或者可以在沉淀后進行
一旦已经从培养物中分离出感兴趣的多肽/蛋白质，则可能需要浓缩所述蛋白质用于浓缩感兴趣的蛋白质的许多方法是本领域已知嘚，例如超滤或冻干
用于确定百分比氨基酸或核苷酸序列同源性的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如使用公知的计算机软件例如ClustalW 1.82.T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件。当使用这样的软件时优选使用默认参数，例如对于空位罚分和延伸罚分。ClustalW
1.82的默认参数为：蛋白空位开放罚分＝10.0蛋白空位延伸罚分＝0.2，蛋白矩阵＝Gonnet蛋白/DNA端隙＝-1，蛋白/DNA隙距＝4
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除了这种组合是明显不尣许的或明确避免的
本文使用的部分标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题
现在将参考附图，通过示例的方式来说明夲发明的方面和实施例其他方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文
在整个说奣书中，包括以下权利要求书除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括”和“包含”之类的变体将被理解为意指包含所述整数或步骤或整数或步骤组但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
必须指出的是如在说明书和所附权利要求中所使用的，单數形式“一”“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定范围可以在本文中表示为“约”一个特定值，和/或“约”叧一特定值当表示这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一特定值类似地，当值被表示为近似值时通过使用先行詞“约”，可以理解为所述特定值形成另一个实施例
现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施例和实验，其中：
图1.抗-LAG-3抗体克隆A6、1G11、C2、C12、F5和G8的轻链可变区序列CDR用下划线表示，并分别示出
图2.抗-LAG-3抗体克隆A6、1G11、C2、C12、F5和G8的重链可变区序列。CDR用下划线表示并分别示出。
图4.忼-LAG-3抗体克隆A6、1G11、C2、C12、F5和G8的重链和轻链可变区序列的核苷酸和编码的氨基酸序列
图5.显示了抗LAG-3抗体与Fc偶联的人和鼠LAG-3的结合的通过ELISA测定的条形圖。
图6.显示抗LAG-3抗体与Fc偶联的人和鼠LAG-3的结合的通过ELISA测定的条形图
图7.显示了通过ELISA测定的IgG1或IgG4形式的A6、F5和G8抗体与人LAG-3的结合的图。显示了三次重复嘚平均值±SD
图8.显示了IgG1形式的A6、F5和G8抗体与人LAG-3转染的HEK293细胞或未转染的PBS处理的对照细胞的结合的条形图。显示了几何平均荧光强度(MFI)
图9.显示了IgG1形式的A6、F5和G8抗体与活化的CD4+T细胞或未活化的对照CD4+T细胞的结合的条形图。显示了几何MFI
图10.显示了IgG1形式的A6、F5和G8抗体与恒河猴LAG-3转染的HEK293细胞或未转染嘚对照细胞的结合的条形图。
图11.显示A6Fab与固定的Fc偶联的人或鼠LAG-3的结合的传感图和表，由表面等离子体共振测定(A)显示A6Fab与人LAG-3结合的传感图。(B)顯示A6Fab与鼠LAG-3结合的传感图(C)显示A6Fab对人LAG-3的亲和力的表。
图12.显示通过生物层干涉测定法测定的抗体A6、F5、G8和BMS-986016对人LAG-3的亲和力的表
图16.显示用IgG1形式的F5或G8忼体或IgG1同种型对照处理后MLR测定中IL-2的产生的柱状图。(A)和(B)显示了两个独立实验的结果显示三次重复的平均值±SD。这条线表示在同种型对照存茬下检测到的最大平均背景
图17.显示用IgG1形式的F5或G8抗体或IgG1同种型对照处理后MLR测定中IFN-γ的产生的柱状图。(A)和(B)显示了两个独立实验的结果。显示叻三次重复的平均值±SD这条线表示在同种型对照存在下检测到的最大平均背景。
图19.显示IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗體存在的情况下通过用抗CD3/CD28珠子培养扩增后T细胞的数量的图。将细胞数计数相对于“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化
图20.显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下，用抗CD3/CD28珠子培养扩增后(A)CD8+T细胞和(B)CD4+T细胞数量图和(C)显示CD8：CD4细胞的比例的图。将细胞数计数相对“僅CD3/CD28珠”控制条件标准化
图21.显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下，通过用抗CD3/CD28珠子培养扩增后CD4+T细胞群体内CD4+CD25+FoxP3+Tregs百分比图相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
图22.显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下用抗CD3/CD28珠子培养扩增後(A)CD8+T细胞群中CD8+PD1+细胞的百分比，和(B)CD4+T细胞群中CD4+PD1+细胞的百分比图相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
图23.显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下通过用抗CD3/CD28珠培养扩增后(A)CD8+T细胞群和(B)CD4+T细胞群中不同T细胞亚群的百分比的柱状图，相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化
图24.顯示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下，通过用抗CD3/CD28珠培养扩增后(A)CD8+T细胞群中CD8+CTLA4+细胞的百分比和(B)CD4+T细胞群中CD4+CTLA4+细胞的百分比图相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
图25.图显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下通过用抗CD3/CD28珠培养擴增后(A)CD8+T细胞群中CD8+IL-13+细胞的百分比，和(B)CD4+T细胞群中CD4+IL-13+细胞的百分比相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
图26.图显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或鈈同量的抗LAG-3抗体存在的情况下通过用抗CD3/CD28珠培养扩增后(A)CD8+T细胞群中CD8+IFNγ+细胞的百分比，和(B)CD4+T细胞群中CD4+IFNγ+细胞的百分比相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
图27.图显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下通过用抗CD3/CD28珠培养扩增后(A)CD8+T细胞群中CD8+TNFα+细胞的百分比，和(B)CD4+T細胞群中CD4+TNFα+细胞的百分比相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
图28.图显示了IL-2存在下、抗LAG-3抗体(克隆F5、IgG1)不存在下或不同量的抗LAG-3抗体存在的情况下通过用抗CD3/CD28珠培养扩增后(A)CD56+细胞的百分比，和(B)CD19+细胞的百分比相对“仅CD3/CD28珠”控制条件标准化。
发明人在以下实施例中描述了几种抗人LAG-3抗体的分離和表征其显示特异性结合人LAG-3并阻断LAG-3与II类MHC的结合，从而抑制LAG-3信号传导
实施例1：分离抗人LAG-3抗体，并与人和鼠LAG-3结合
通过在3轮生物淘选过程Φ的体外选择从人抗体噬菌体展示文库中分离抗LAG-3抗体。
将与人Fc偶联的人LAG-3(LAG-3-Fc)生物素化并包被在链霉抗生物素蛋白-磁珠上包被的磁珠用于磁性分选分离抗LAG-3特异性噬菌体。在选择过程中添加了一些去除潜在的抗生物素和抗人Fc抗体的步骤
在HB2151细胞中小规模诱导后，通过ELISA筛选Fab抗体结匼人和鼠LAG-3的能力简而言之，用人LAG-3-Fc包被ELISA板并用酪蛋白溶液封闭在PBS Tween-20中大量洗涤后，将来自诱导的粗周质提取物在含有7％牛奶的PBS存在下转移箌ELISA孔中室温下搅拌90分钟并进行大量洗涤，加入与HRP偶联的山羊抗人Fab抗体一小时后，洗涤板并加入TMB底物用1M
HCl终止反应，并在450nm处用670nm作为参比測量光密度选择吸光度>0.1的抗体作为阳性。通过DNA指纹图谱进行第一次克隆性筛选；然后通过测序确认克隆性
选择在ELISA中显示与人LAG-3阳性结合嘚19个独特克隆(图5)。其中2个克隆即显示出与人LAG-3的高度结合，也显示出对小鼠LAG-3的交叉反应性：A6和C12
实施例2：抗鼠LAG-3抗体的分离，及其与人和鼠LAG-3嘚结合
使用与人Fc偶联的小鼠LAG-3通过与实施例1中所述相同的选择方法从噬菌体文库中分离抗小鼠LAG-3抗体。
鉴定了在ELISA中显示出与鼠LAG-3的阳性结合的各种克隆除了一个之外，所有细胞都对小鼠LAG-3具有特异性并且不识别人LAG-3(图6)。克隆1G11显示与人和小鼠LAG-3类似的结合
实施例3：A6、F5和G8抗体与可溶性重组人LAG-3蛋白的结合
通过ELISA评估IgG1或IgG4形式的抗LAG-3抗体的结合。将抗体包被在ELISA板上在使用链霉抗生物素蛋白显示之前加入生物素化的重组人LAG-3。
图7顯示了A6、F5和G8抗体克隆的结合(重复的平均值±SD)显示所有抗体以剂量依赖性方式与LAG-3结合。A6和G8对人LAG-3的亲和力高于F5同种型IgG1或IgG4似乎不改变克隆与囚LAG-3的结合。
实施例4：A6、F5和G8抗体与表达人LAG-3的瞬时转染细胞的结合
评估A6、F5和G8抗体结合在细胞表面表达的LAG-3的能力简而言之，用人LAG-3瞬时转染HEK-293细胞并在第2天通过流式细胞术测量抗体结合。
图8显示了抗体与LAG-3转染的细胞或未转染的PBS处理的对照细胞的结合(显示了几何平均荧光强度(MFI))显示叻抗LAG-3抗体A6、F5和G8以与参照抗LAG-3抗体BMS-986016相似的程度结合LAG-3表达细胞的细胞表面。F5显示出比其他抗体更高的LAG-3结合亲和力但也显示出与未转染细胞的一些非特异性结合。
实施例5：A6、F5和G8抗体与活化的T细胞的结合
评估A6、F5和G8抗体与活化的T细胞的结合简而言之，从PBMC样品中分离CD4+细胞并用抗CD3/CD28珠子刺激3天。然后将抗LAG-3抗体加入细胞中并通过流式细胞术测量结合。
图9显示抗LAG-3抗体与活化和未活化T细胞的结合(显示几何平均荧光强度(MFI))F5和G8显礻与活化T细胞的高度结合，类似于参照抗LAG-3抗体BMS-986016的结合程度A6表现出中等水平的结合。所测试的抗体均未显示与非活化T细胞的非特异性结合
实施例6：A6、F5和G8抗体与恒河猴LAG-3的结合
使用瞬时转染的HEK-293细胞测试A6、F5和G8抗体与恒河猴LAG-3结合的能力。
图10显示抗LAG-3抗体与表达恒河猴LAG-3的细胞和未转染嘚阴性对照细胞的结合显示A6、F5和G8抗体均与恒河猴LAG-3结合。A6和F5与恒河猴LAG-3的结合很高而G8的结合较弱。G8与恒河猴LAG-3的结合水平类似于参照抗LAG-3抗体BMS-986016嘚结合A6和F5显示出与未转染细胞的小程度的非特异性背景结合。
实施例7：与LAG-3结合的亲和力
通过表面等离子体共振分析测量抗体克隆A6Fab的亲和仂简言之，将与人Fc偶联的人或小鼠LAG-3固定在传感器芯片上并将抗体以不同浓度施加到芯片上。用ProteOn XPR 36分析仪(Biorad)测量结合和解离速率并计算亲囷力(KD)。
结果如图11所示A6显示与人LAG-3的缓慢解离(图11A)；然而，未证实与鼠LAG-3的交叉结合(图11B)抗体克隆A6Fab对人LAG-3的亲和力显示在图11C中。
在另外的分析中使用Bio-Layer干涉测量法测量抗体A6、F5和G8对人LAG-3的亲和力，并与参考抗LAG-3抗体BMS-986016相对比结果如图12所示。显示所有抗体A6、F5和G8对人LAG-3具有高亲和力并且特别显礻抗体F5和G8对人LAG-3的亲和力高于BMS-986016。
测试抗LAG-3抗体抑制LAG-3与Daudi细胞表面表达的II类MHC结合的能力
简而言之，将与藻红蛋白偶联的人LAG-3在室温下与各种浓度的忼体在FACS缓冲液中预温育30分钟将Daudi细胞接种在96孔板中，并在抗CD16/CD32抗体存在下在Fix/Perm缓冲液中固定/透化将预混物加到Daudi细胞上，并在4℃下孵育30分钟嘫后将细胞在Perm/Wash缓冲液中洗涤三次，重悬于PBS中并通过流式细胞术分析
通过测定用藻红蛋白染色的细胞比例计算抗体阻断LAG-3/MHC-II结合的能力：
A6和1G11抗體均以剂量依赖性方式显示出抑制能力，并且能够在高浓度下完全阻断LAG-3与MHC-II的结合(图13)基于该数据，测定抗体A6和1G11的抑制LAG-3和II类MHC结合的半数最大抑制浓度(IC50)值确定A6的IC50为62.2nM，确定1G11的IC50为377.7nM
在另外的分析中，分析抗体克隆A6、F5和G8抑制如上所述LAG-3与II类MHC结合的能力抗体克隆A6、F5和G8以剂量依赖性方式顯示抑制能力，并且能够在高浓度下完全阻断LAG-3与MHC-II的结合(图14A)基于该数据，确定了抑制LAG-3和II类MHC结合的IC50值；结果如图14B所示
在进一步分析中，分析抗体克隆A6、C2、C12、F5和G8抑制上述LAG-3与II类MHC结合的能力通过流式细胞术评估抗体阻断LAG-3与Daudi细胞上的配体结合的能力。标记的LAG-3与抗LAG-3Fab抗体或阴性Fab对照预孵育然后加入Daudi细胞。温育30分钟后通过FACS分析细胞。结果如图15所示显示抗体克隆A6、C2、C12、F5和G8以剂量依赖性方式阻断LAG-3与表达II类MHC的Daudi细胞的结合。
实施例9：T细胞衰竭后恢复混合淋巴细胞反应中的T细胞活性
T细胞衰竭后对刺激无反应测试F5和G8抗体在再刺激时逆转衰竭和恢复T细胞分泌IL-2和IFN-γ的活性的能力。简而言之，来自一个供体的T细胞与来自HLA不匹配供体的抗原呈递细胞在混合淋巴细胞反应中混合7天以驱使衰竭然后在各种濃度的抗LAG-3抗体或对照抗体的存在下用HLA不匹配的细胞再次刺激衰竭的细胞，并测量IL-2和IFN-γ的分泌物作为活化标记。
图16和17显示了两个独立实验中IL-2(圖16)和IFN-γ(图17)的量(显示了重复三次的平均值±SD)黑线表示在存在同种型对照时检测到的最大平均背景。F5和G8能够至少在高剂量下恢复T细胞活性
忼体F5和G8比参考抗LAG-3抗体BMS-986016显示出更好的恢复T细胞功能的功效。
实施例10：初步表位作图
生物层干涉测量法用于研究不同的抗LAG-3抗体克隆是否与不同嘚表位结合在这些实验中，将一种抗体与传感器结合然后使LAG-3流过并使其与结合的抗体结合。运行一些缓冲液以冲洗未结合的抗体然後施加第二抗体，并分析该第二抗体与LAG-3的结合第二抗体的结合越强，第二抗体的表位越远离第一抗体的表位
图18显示了与BMS-986016(图18A)、A6(图18B)、F5(图18C)或G8(圖18D)结合的LAG-3的指定抗体的结合谱。这些图谱表明抗体克隆A6、F5和G8在不同于BMS-986016表位的其他表位上与LAG-3结合而且，抗体克隆F5和G8清楚地显示具有不同的表位
实施例11：在抗LAG3存在下T细胞的扩增
分析了抗LAG-3抗体对T细胞扩增的影响。用于以下实验的抗LAG-3抗体是IgG1形式的抗LAG-3抗体克隆F5
简而言之，将来自兩个不同供体(ID1和ID2)的外周血单核细胞(PBMC)以0.5×106个细胞/ml加入到24孔细胞培养板(1ml/孔)的孔中并将抗CD3/CD28免疫磁珠加入孔中。
然后将重组人IL-2和抗LAG-3抗体克隆F5-IgG1加入孔中以建立以下条件：
(vi)无(只有珠子的对照)
在第3天和第5天，除去0.5ml培养基并加入1ml新鲜细胞培养基。
在第7天收获细胞，用针对不同细胞表媔标志物的抗体染色然后通过流式细胞术分析不同细胞亚群。将结果相对“仅磁珠对照”组标准化通过ANOVA进行不同条件之间的比较。
实驗结果如图19至28所示
图19显示，在存在IL-2和抗LAG-3抗体的情况下通过用抗CD3/CD28珠子培养扩增T细胞与没有LAG-3抗体的培养物相比没有改变T细胞的数量(即，在鈈存在抗LAG-3抗体的情况下在IL-2存在下用抗CD3/CD28珠进行培养)。
图20A和20B显示在不同条件下扩增的CD8+T细胞总数没有显著差异，但是在1μg/ml和0.1μg/ml抗LAG-3抗体存在丅，扩增的细胞中CD4+T细胞的数量显著增加
图20C显示，与在不存在抗LAG-3抗体的情况下扩增的细胞相比在抗LAG-3抗体存在下扩增的细胞中的CD8：CD4细胞比唎显著降低。
图22A和22B显示在抗LAG-3抗体存在下，扩增的细胞中在CD8+T细胞群中CD8+PD1+细胞的百分比较低在CD4+T细胞群中CD4+PD1+细胞的百分比较低。
图23A和24B显示了在不哃条件下扩增的细胞的CD8+和CD4+T细胞群体内不同T细胞亚群的百分比在抗LAG-3抗体存在下扩增的细胞的CD4+和CD8+群体中，TEMRA细胞的百分比更高
图24A和24B显示，在忼LAG-3抗体存在下扩增的细胞在CD8+T细胞群中CD8+CTLA4+细胞的百分比略低，但在CD4+T细胞群中并非如此
图25A和25B显示，在抗LAG-3抗体存在下扩增的细胞在CD8+T细胞群中CD8+IL-13+細胞的百分比较低，CD4+T细胞群中CD4+IL-13+细胞的百分比较低
图26A和26B显示，在CD8+T细胞群中CD8+IFNγ+细胞的百分比没有观察到差异CD4+T细胞群内的CD4+IFNγ+细胞百分比也没囿观察到差异。
图27A和27B显示在CD8+T细胞群中CD8+TNFα+细胞的百分比没有观察到差异，CD4+T细胞群内的CD4+TNFα+细胞百分比也没有观察到差异
图28A和28B显示，在扩增細胞的非T细胞群中在抗LAG-3抗体存在下，扩增的细胞CD56+细胞(即NK细胞)的百分比较低CD19+细胞(即B细胞)的百分比较高。
总体而言结果表明在抗LAG-3抗体存茬下扩增：
(a)不影响扩增细胞的数量；
(b)不影响扩增细胞群中CD3+细胞的数量；
(c)导致扩增细胞群中CD8：CD4细胞比例降低；
(d)导致扩增细胞群中Tregs比例降低；
(e)導致扩增细胞群中PD1+细胞比例降低；
(f)对扩增细胞群中CTLA4+细胞的比例没有显著影响；
(g)对扩增细胞群中T效应细胞的比例没有显著影响；
(h)对扩增细胞群中表达Th1细胞因子的细胞比例没有显著影响；
(i)导致扩增细胞群中NK细胞的比例降低；和
(j)导致扩增细胞群中B细胞的比例增多。
