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利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗.pdf 11页
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中国农业科学 ):976-986
Scientia Agricultura Sinica
doi: 10.3864/j.issn.15.05.16
利用 E.coli 表达猪圆环病毒2型Cap蛋白
生产病毒样颗粒疫苗
，乔绪稳 ，陈 瑾 ，李鹏成 ，于晓明 ，朱国强 ，郑其升 ，侯继波
（国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京
210014 ； 扬州大学兽医学院，江苏扬州
摘要：【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达 PCV2b 亚型 ORF2 基因，利用重组 Cap 蛋白制备 PCV2 VLP 疫苗
的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成 PCV2 NJ 株 ORF2 基因，将其插入原核表达载体
pQZ1，鉴定阳性后转入表达宿主菌 BL21，利用原核表达平台 CVC1102 对重组菌进行诱导表达。利用 SDS
与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析；利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装；
利用 BCA 试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量，利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比，得出目的蛋
白量，将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL-1 。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化，免疫2—3 周龄抗原抗
体双阴性的仔猪，同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302 的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组，免疫后
14 d 与 21 d 所有试验猪采血，分离血清，利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒 2 型抗体 ELISA 检测试
剂盒检测试验猪血清中PCV2 抗体水平；免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程
序，利用PCV2 NJ株F
代进行强毒攻击试验，肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10
TCID ，同时利用乳化的钥匙孔血
蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激，攻毒后25 d，对所有试验猪进行解剖检测，通过攻毒过程中试验猪
体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方
面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大
肠杆菌中得到了高效表达，表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中；Western blotting分
析结果显示表达的重组 Cap 蛋白能够与 PCV2 阳性血清发生反应；电镜下观察可见大量直径在 17 nm 左右的 PCV2
病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中；500 μg/头重组 VLP 疫苗免疫猪产生较高的抗体水平，单次免疫后 21 d
抗体 100%达到合格，对 PCV2 强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了 PCV2 Cap 蛋白在大肠杆菌中高效可溶性
表达，重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒，且具有良好的免疫原性，可用于制备PCV2亚单位疫苗。
关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；可溶性表达；病毒样颗粒；免疫原性
PCV2 Virus Like Particles Vaccine Produced with Recomb
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病毒样颗粒疫苗构建
病毒样颗粒（ＶＬＰs）疫苗构建技术
& & & &病毒样颗粒（VLPs）保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，通常情况下比亚单位疫苗和重组的蛋白疫苗具有更强的免疫原性,&在没有任何佐剂的情况下也能产生很强的免疫应答，不但能激发体液免疫，而且可以激发细胞和粘膜免疫，具有安全、高效的特点，具有可溶性抗原的优势，对于多种疾病来说都是一种可开发理想的疫苗形式。
& & & &远睿生物具备完整的杆状病毒/昆虫细胞、酵母等真核表达技术平台，根据客户需求，提供以病毒样颗粒为载体的疫苗构建服务，结合高密度发酵和优质的纯化服务，实现载体构建、发酵生产、蛋白纯化等从小试到生产的一站式服务。公司具有严格的标准化操作流程以保证蛋白质量，确保高质量的生物外包服务。
病毒样颗粒（VLPs）疫苗构建案例：
酵母表达乙肝疫苗
酵母表达ＨＰＶ疫苗
酵母表达手足口病疫苗
酵母表达诺如病毒疫苗
酵母表达ＰＣＶ２疫苗
杆状病毒表达ＨＰＶ疫苗
杆状病毒表达手足口病疫苗
询价与订购：
& &电话：028-
& &&传真：028-69591915展示日本乙型脑炎病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒病毒样颗粒的制备
日本乙型脑炎病毒(JEV)是引发日本脑炎的病原,每年全球报道的日本脑炎病例达45 000例,死亡人数达10 000[1],50%的幸存者会留下严重的神经后遗症[2]。多种动物可感染日本乙型脑炎病毒,其中猪是主要的储存和扩增宿主,感染后主要表现为生殖器官症状,日本乙型脑炎病毒对猪的致死率不高,但可造成母猪的繁殖障碍,对养猪业造成巨大的损失,并且威胁人类公共卫生。由于对日本脑炎没有特效的治疗方法,免疫是防控此病唯一可用的手段,并且实践证明也是有效的。数十年来,日本脑炎的灭活疫苗和弱毒疫苗有效[3],虽然灭活疫苗安全可靠,但成本高,且存在大量无关抗原成分易引起过敏反应。弱毒疫苗保护性好,但可能出现潜在的毒力返强、带毒、排毒、垂直传播等不安全因素等问题。因此,需要研制新的乙脑疫苗。目前主要研究的新型日本脑炎疫苗有嵌合弱毒疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗以及亚单位疫苗。表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗,表位是抗原引起免疫应答的关键部分。Kulk...&
(本文共6页)
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流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病,据统计,每年流感流行可引起300万～500万的严重病例,并可导致30万～50万人死亡。流感病毒除了感染人外,还可感染家禽、牲畜等,并可快速传播,给国民经济带来巨大损失[1]。流感病毒可分为甲(A)、乙(B)和丙(C)三型,均可感染人类[2],但甲、乙型流感病毒引起的病症较严重,而又以甲型为甚。而且由于流感病毒容易变异,这给流感的预防与控制带来巨大压力。因此,实时监测甲型流感病毒的疫情,快速确诊疑似病例,不但可以有效地控制疫情,同时还可正确指导临床用药,避免耐药病毒株的过快产生[3]。而临床流感病毒感染的实验室诊断方法主要包括病毒分离与培养、抗原检测、核酸检测以及血清学实验4种,分别适用于病毒感染的不同阶段[4],其中抗原快速检测试剂具有快速、方便、廉价、操作简单和无需特殊设备等特点,可实现现场检测,有效减少疾病的传播[5]。本研究通过构建流感病毒NP的原核表达质粒,利用大肠...&
(本文共5页)
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抗体,特别是中和性抗体,可以与靶抗原特异性结合并中和入侵病原,因此,抗原-抗体特异性相互作用在机体清除各种感染源的体液免疫反应中发挥关键作用。抗体特异性识别抗原分子上称为抗原性决定区或表位的特定区域[1]。B细胞表位就是抗原分子表面能够被抗体特异性识别结合的氨基酸簇;B细胞表位可以被分泌的抗体或B细胞受体识别,诱导宿主产生细胞免疫反应和体液免疫反应[2]。B细胞表位鉴定具有许多重要的生物学意义,如可以深化对免疫反应和自身免疫疾病的认知,为表位疫苗的研发或疾病诊断方法的建立提供候选表位肽,有助于治疗性抗体的作用机制的揭示等[3-4]。同时,单抗药物识别表位的鉴定也有助于自主知识产权的伸张和保护。根据其空间结构的不同,B细胞表位可分为线性(连续性或顺序性)B细胞表位和构象性(非连续性或非线性)B细胞表位。线性B细胞表位一般由3-8个抗原分子一级结构上连续的氨基酸残基构成。然而,我们在进行小反刍兽疫病毒(PPRV)核衣壳蛋白(N蛋白)...&
(本文共12页)
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为了确定汉滩病毒核衣壳蛋白 (NP) B细胞表位的基因定位 ,将 DNase I随机消化的汉滩病毒 76 / 118株 S基因片段与丝状噬菌体载体连接后转化 MC10 6 1菌 ,成功构建了汉滩病毒 S基因 -多肽片段噬菌体肽库 .应用 12株国产抗汉坦病毒单克隆抗体对表达汉滩病毒 NP...&
(本文共1页)
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单纯疮疹病毒 l型(HSV－l)和单纯疽疹病毒11型(HSV－2)感染可检测型特异的病毒抗原、病毒DNA和型特异的HSV抗体而进行实验诊断。由于多数HSV－2感染无症状,因此检测HSV－2特异抗体在HSV－二感染的诊断中很重要。单纯疮疹病毒11型的糖蛋白G(gG－2)在其加工过程中裂解为分泌型的氨基端部分和与细胞固有的高度O－糖基化的竣基端部分,后者称为成熟的炉－2(IngG－2)。mgG－2通常作为HSV－2感染的血清学诊断的型特异的抗原。由于野生株W弘－2的氨基酸序列的可变性会影响血清学试验的结果,该文对15株HSV－2野生株的妒－2基因序列进行了研究,发现表位区域以外的部位有极少的突变。5份野生株gG－Z序列与不...&
(本文共1页)
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鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由IB病毒(IBV)引起的一种鸡急性高度接触性传染病。IBV是冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)第3群禽冠状病毒的代表株[1]。其基因组编码4种结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。N蛋白为磷酸化蛋白,由409个氨基酸组成,占病毒蛋白总量的40%,分子量约51ku[2]。N蛋白具有较高的保守性,据报道,N蛋白中间部分比两端更为保守,各病毒株之间在氨基酸的238位～293位之间高度一致[3]。N蛋白在病毒的复制和转录中起作用,主要作用是与病毒RNA结合形成核衣壳[4]。此外,N蛋白具有良好的免疫原性,可在体内产生高水平的抗体并介导细胞毒性T反应[5]。本研究旨在获得针对IBV N蛋白的特异性单克隆抗体(MAb),精确定位IBV N蛋白的抗原表位,在分子水平上揭示N蛋白的抗原结构。1材...&
(本文共5页)
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PPVVP2和PCV2ORF2重组病毒样颗粒的获得及其免疫原性研究
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普莱柯公司在病毒样颗粒圆环亚单位疫苗方面实现技术突破
17-9-22 16:02|
查看: 132|
评论: 0|原作者: 普莱柯|来自: 猪苗技术部
摘要: 市场上，常见猪用疫苗的类型大致可以分为：全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗（包括亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗）等。亚单位疫苗作为基因工程疫苗的分支，以其安全、高效、可规模化生产等优势逐步 ...
市场上，常见猪用疫苗的类型大致可以分为：全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗（包括亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗）等。亚单位疫苗作为基因工程疫苗的分支，以其安全、高效、可规模化生产等优势逐步成为越来越多研究者关注的焦点。一、什么样的疫苗是亚单位疫苗？亚单位疫苗是指利用物理化学方法提纯病原微生物中具有免疫原性的组分，或者利用基因工程表达该组分，纯化后加入佐剂制成的疫苗。因为在大分子抗原携带的多种特异性的抗原决定簇中，只有少量抗原决定簇对保护性免疫应答起作用。而亚单位疫苗是将病原微生物主要的保护性抗原决定簇存在的组分进行提娶提纯、组装等过程而制成的疫苗。二、亚单位疫苗的特点有哪些？1、相对全病毒疫苗来讲，亚单位疫苗无核酸成分，无散毒和毒力返强的风险，安全性更高，稳定性更好。2、抗原组分单一、纯度高，免疫反应性强，接种后可刺激机体产生特异性免疫应答，节约机体免疫资源。3、亚单位疫苗可借助大肠杆菌、杆状病毒、毕赤酵母为载体，可实现规模化生产。4、亚单位疫苗不仅可以产生体液免疫应答，而且组装成VLPs的亚单位疫苗可以诱导机体细胞免疫应答。三、病毒样颗粒圆环亚单位疫苗的研发情况猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,PMWS）、皮炎与肾病综合征（PNDS）的主要病原，给世界范围内的养猪业造成重大的经济损失。目前，国内外相继有全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗上市，随着科研的深入，未来安全、高效可规模化生产的新型基因工程疫苗正逐步成为防控该病的主流。研究证实，猪圆环病毒2型疫苗的免疫效果与疫苗中抗原含量的高低有着直接的关系。众所周知，PCV2的高滴度培养相对比较困难，从而严重影响着全病毒灭活疫苗的免疫效果。Cap蛋白是猪圆环病毒2型唯一的结构蛋白和免疫保护性蛋白，运用各种表达系统可以有效表达Cap蛋白，而且所表达的Cap蛋白可以自组装形成与天然PCV2结构相似的病毒样颗粒（VLPs）。国内外已上市的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗多数采用的是杆状病毒表达系统，在国内已上市的也有采用大肠杆菌表达系统的。从技术而言，由于Cap蛋白无需糖基化修饰，因此利用大肠杆菌表达系统和杆状病毒表达系统所表达的蛋白从本质上不会有任何差异。将表达Cap蛋白的基因插入适当的载体中，通过筛选不同的表达系统，最终获得大量的可溶性的Cap蛋白，这样即获得了组装病毒VLPs的基本原料。然后通过VLPs组装工艺得到完整的病毒样颗粒，即圆环亚单位疫苗的重要抗原部分。&普莱柯公司病毒样颗粒圆环亚单位疫苗技术突破亚单位疫苗作为一种新型的疫苗，在疫病防控、猪场净化等方面会起到越来越重要的作用，也将成为未来疫病防控和净化的首选疫苗。普莱柯公司自2010 年上市国内首个全病毒猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株）之后，长期致力于更高品质圆环系列产品的研究与开发，主要技术突破如下：1、可溶性蛋白的表达大肠杆菌表达系统因其自身众多的优点而成为表达外源性蛋白的首选，但是外源蛋白在大肠杆菌表达过程中往往不能正确折叠而形成不溶的无活性蛋白，即包涵体。如何提CAP蛋白的可溶性表达，专家们进行了深入的研究。在丰富的大肠杆菌表达技术储备和完善的载体库与基因库基础上，通过生物信息学统计分析和基因重组克隆技术构建、优化和筛选表达载体，实现该技术的突破，使得可溶性CAP蛋白在大肠杆菌中的表达量有了质的提升。2、高纯度Cap蛋白获取Cap蛋白经过表达、粗纯后，其中仍含有大量大肠杆菌的蛋白、核酸、细胞碎片等杂质，这些杂质会影响病毒样颗粒的形成，导致产生不完整和不规整的颗粒，同时也会影响疫苗的免疫效力。获取高纯度的蛋白是做好疫苗的首要难点之一。国家兽用药品工程技术研究中心多位专家经过长期研究，通过多重蛋白层析纯化，获得了高纯度的Cap蛋白，将Cap蛋白的纯度提高至95%以上，从而为后续高效的组装完整的病毒样颗粒奠定了基矗3、病毒样颗粒组装获得了最基本的原料，如何将Cap蛋白组装成有效的病毒样粒子是核心技术。在以前的研究中，该难点是很多学者难以逾越的技术屏障。因为组装条件不成熟，疫苗中Cap蛋白主要以单体或多聚体的形式存在或者部分组装后的颗粒与PCV2病毒本身的大孝结构存在差异，即使含量再高，也无法产生很高的抗体，对猪只无法进行高效的保护。国家兽用药品工程技术研究中心联合新加坡国立大学经过长期的技术攻关，通过切向流超滤等技术在特定的缓冲液中实现组装。动态光散射分析显示将近100%的蛋白都组装成病毒样颗粒。通过投射电镜，我们可以看到组装成VLPs的真实面目：均一、完整的20nm左右的颗粒。基于此，普莱柯公司成功研发国内首个纯病毒样颗粒圆环亚单位基因工程疫苗，新产品即将上市，给养殖业健康发展做出新的贡献，同时也将推出关于圆环病毒疫苗的实验室及田间科学的评价手段及方法，敬请关注！ &&文章来源：猪苗技术部&&郭江松技术支持：国家兽用药品工程技术研究中心
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