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关于Western Stripping Buffer的配方
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这个帖子发布于13年零86天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
为了节省时间和抗原（通常我要用同一种抗原做几次western），我打算把用过的PVDF膜洗去一抗和二抗（AP标记），重新做WB。请问Stripping Buffer的配方（包括PH值）以及操作步骤和注意事项，另外碱性磷酸酶的底物是否也能够用stripping buffer洗掉？
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METHOD1stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7100mmol/l beta-mercaptoethanol2%SDS二次发光protocol:1.stripping buffer洗膜：50度水浴30分钟，摇床上摇10-20分钟。2。1*PBST洗：摇床上摇30分钟。3。封闭，加一抗，二抗（同第一次发光）以上方法是我常用的实验步骤，具体文献一时没找出来，我的实验证明以上方法可行且效果不错。METHOD2stripping buffer的配方是（50ml总量）ss-mercaptoethanol 342 ul20% SDS 5 mlTris-Cl pH 6.7 3.125 ml加ddH2O至 50 ml方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。百利而无害，何乐而不为？METHOD31):beta-metaptoethanol 35ul 2):10%SDS 1ml 3):tris (0.5M,pH6.7) 625ul 4):dH2O 3.34ml 50-55℃, 30min METHOD4stripping buffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配——毕竟，加了β-mercaptoethanol 以后太难闻了，配了就用；而且，有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很方便的。每次用量5ml少了点，我每次用50ml另外也可以用另一种stripping buffer：0.5M NaCl，0.5M HAc；室温摇床15min。我觉得后一种方案好像效果好些。不管用那种方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。化学显色是否可以做stripping我不知道，我以前做的是ECL显色的
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我想问一下，如果用上述方法，一张膜最多能爆几次，请各位高人指点
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另类方法：将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗（同第一次发光），实践证明方法完全可行。周围有人用此方法重复做了4-5次。结果均比较满意。
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非常感谢！！！我回去验证一下！
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TBS洗过后有一股很浓的巯基乙醇的味道，不知道会不会影响??还是要洗到没有什么味道才好那？？METHOD2stripping buffer的配方是（50ml总量）ss-mercaptoethanol 342 ul20% SDS 5 mlTris-Cl pH 6.7 3.125 ml加ddH2O至 50 ml方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。
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今天试了stripping buffer，明天看效果~~学习
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【求助/交流】同样分子量的蛋白，用Strip buffer来洗掉前一个再检测效果如何？
我有4个蛋白要检测，分别是23、26、30、30kD
23和30我可以剪开，26、30我就没那么大信心了，而且还有两个是30
strip buffer我从来没用过，不知道效果到底如何
这几个蛋白的表达量都不低，所以也不怕strip的时候损失
就是不知道这样做出来的结果，是否还能看出表达差异的趋势？
望有做过的虫友进来交流
100 mM &-mercapto-ethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl pH 6.8：
&-mercaptoethanol 342 &l
20% SDS 5 ml
Tris-Cl pH6.7 3.125 ml
add H2O to 50 ml
这个是查到的比较常用的配方
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【求助】你们的Stripping buffer配方
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这个帖子发布于7年零358天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
你们都用什么洗脱液啊？洗去1抗2抗的，我看很多不一而足的，参看下
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园子里的一个Protocol描述的14.4mol/L 2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）
TrisoHCl（pH6.8）
100ml牛战友“llllcjchina”的配方100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml差不多啊。好奇楼主用什么配方，如何strip，55°摇30mins，效果如何？
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豆芽蔡 edited on
我们没有用过洗脱液，最多用tbs洗一洗， 一张膜发过荧光以后，直接再和另一个一抗共同孵育，只要分子量相差一些条带不会重合在一起，就可以了。而且，在两个一抗都是共同来源的情况下（如都是兔抗）也可以这样做。
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园子里的一个Protocol描述的14.4mol/L 2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）
TrisoHCl（pH6.8）
100ml牛战友“llllcjchina”的配方100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml差不多啊。好奇楼主用什么配方，如何strip，55°摇30mins，效果如何？
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豆芽蔡 edited on
我们就用0.1M PH2.5的甘氨酸洗，很好用的！
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豆芽蔡 园子里的一个Protocol描述的14.4mol/L 2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）
TrisoHCl（pH6.8）
100ml牛战友“llllcjchina”的配方100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml差不多啊。好奇楼主用什么配方，如何strip，55°摇30mins，效果如何？其实折算一下，这两个是一回事，应该是比较经典的吧，我们实验室也是这样的
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豆芽蔡 园子里的一个Protocol描述的14.4mol/L 2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）
TrisoHCl（pH6.8）
100ml牛战友“llllcjchina”的配方100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml差不多啊。好奇楼主用什么配方，如何strip，55°摇30mins，效果如何？其实折算一下，提及的这两个配方是一回事，应该是比较经典的吧，我们实验室也是这样的
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豆芽蔡 园子里的一个Protocol描述的14.4mol/L 2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）
TrisoHCl（pH6.8）
100ml牛战友“llllcjchina”的配方100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml差不多啊。好奇楼主用什么配方，如何strip，55°摇30mins，效果如何？其实折算一下，提及的这两个配方是一回事，应该是比较经典的吧，我们实验室也是这样的
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水中5分钟；0.4M NaHO 5分钟；水中洗5分钟。NaHO中千万不可多洗，不然膜就废了。。
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我试过很多，但是效果都不好！要不是迫不得已，最好别用！
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TBST摇过夜就行其实。。。。最温和。。。。
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ryochan TBST摇过夜就行其实。。。。最温和。。。。同意
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哈哈，正需要呢，谢谢各位啦~
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我也用过园子上的stripping　buffer，效果不好，洗不掉。觉得还是别洗了，重做吧
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add 1mL 2M tris-HCl pH7.5 ,
76.4g Guanidine Hydrochloride ,
100μL 2-Mercaptoethanol
mix well in milliQ water strip at RT for 20 or 30min
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关于丁香园〖stripping〗strippingbuffer配方（转）_牛宝宝〖stripping〗strippingbuffer配方（转）专栏：Stripping buffer 的配方两种方法，国际常用，符合国际标准。Membrane Stripping Two protocols are presentedbelow. The first is applicable to any chemiluminescent substratesystem and uses a combination of detergent and heat to release theantibodies. The second is commonly used for applications whereantibodies have to be separated from an antigen and employs low pHto alter the structure of the antibody in such a way that thebinding site is no longer active.Neither method will remove the colored precipitates generated fromchromogenic detection systems (e.g., BCIP, 4CN, DAB and TM.However, it is still possible to analyze the blot with anotherantibody specific to a different target protein.Important: The blot should not be allowed to dry between rounds ofimmunodetection. Any residual antibody molecules will bindpermanently to the membrane if it is allowed to dry.Protocol 1. Stripping by Heat and DetergentApplicable to any chemiluminescent substrate system.Required Equipment and SolutionsStripping solution: 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 62.5 mMTris-HCl, pH 6.7Phosphate buffered saline (PBS): 10 mM sodium phosphate, pH 7.2,0.9% (w/v) NaClShallow tray, large enough to hold the membraneProcedure1. In a fume hood, place the blot in stripping solution and agitatefor 30 minutes at 50 °C.2. Place the blot in buffer and agitate for 10 minutes. Repeat withfresh buffer.3. (Optional) Repeat the initial detection protocol (omitting theprimary antibody step) to make sure that the antibodies have beeninactivated or stripped from the membrane.4. Place the blot in buffer and agitate for 10 minutes.5. Proceed to the blocking step for the next round ofdetection.Protocol 2. Stripping by Acidic pHApplicable to any chemiluminescent substrate system.Required Equipment and SolutionsStripping solution: 25 mM glycine-HCl, pH 2, 1% (w/v) SDSPhosphate buffered saline (PBS): 10 mM sodium phosphate, pH 7.2,0.9% (w/v) NaClShallow tray, large enough to hold the membraneProcedure1. Place the blot in stripping solution and agitate for 30minutes.2. Place the blot in buffer and agitate for 10 minutes. Repeat withfresh buffer.3. Proceed to the blocking step for the next round ofdetection.还有自己整理的METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/lbeta-mercaptoethanol；2%SDS二次发光protocol:1.stripping buffer洗膜：50度水浴30分钟，摇床上摇10-20分钟。2、1*PBST洗：摇床上摇30分钟。3、封闭，加一抗，二抗（同第一次发光）METHOD2（50ml总量）：β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1M/L Tris-Cl pH 6.73.125 ml；加ddH2O至 50 ml。方法：将用过的膜浸入strippingbuffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul4、dH2O 3.34ml50-55℃，30min。这是LumiGLO 说明书带的protocolStripping and Reprobing a Western blot:1. Remove membrane from plastic following initial detection withLumiGLO.2. Rinse membrane for 30 - 90 minutes at 70°C in 2% SDS(w/v)/62.5mM Tris-HCl (pH 6.8 at 20°C)/100 mMβ-mercaptoethanol.3. Wash membrane 2 times in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 20°C)/150 mMNaCl.4. Block membrane for 2.5 hours with Detector Block or 10 mMTris-HCl (pH 7.4 at 20°C)/150 mM NaCl/5% nonfat dry milk.5. Repeat detection procedure.一般来说为了节约样品、试剂，同时更重要的是尽量使对照组之间的调控关系不因样品的差异而变化，我们在做WB的时候免不了要重复使用同一张膜。刚才回帖的时候谈到了StrippingBuffer，觉得有些经验值得专门贴出来。***NC膜我用的少，以下经验主要对PVDF膜而言。关于Stripping Buffer：现在很多公司都推出了不同的StrippingBuffer，还有很多ECL试剂盒也会告诉你Stripping的方法。我只用过sigma的，效果不如他吹嘘的那么好。其实很多实验室口口相传的StrippingBuffer才是真正好的方法。我用的比较好的配方是：100 mM &-mercapto-ethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl pH 6.850mlbuffer当中：&-mercaptoethanol 342 &l20% SDS 5 mlTris-Cl pH6.7 3.125 mladd H2O to 50 ml65C X 30min （效果不好的话用45min-1hour）TBST洗10min X 3次（别嫌麻烦）blocking in BSA or milk 1hour（别嫌麻烦）reuse***-Stripping的关键是SDS浓度，如果你觉得洗的不理想的话可以适当增加SDS（每次0.2%的递增）。洗过了也可以降低一点。- &-mercaptoethanol我从300ul-1ml都用过，没觉得影响太大。这东西还是有毒的，味道不好闻，尽量在通风橱里面操作。- 温度：50-65C都可以，不过65C的洗脱确实好一些。- Stripping之后一定要洗干净，不然一抗与蛋白的结合有问题- 如果膜不急用的话，TBST洗10min X 3次之后可以用 1x TBS（NOTween20）泡着，最好是用塑料袋封在TBS里面，低温（4℃保持）。一个月是没问题的。/wxfbmn/item/ee26cab62531a6转载请保留本文连接：相关内容TA的分享& 【求助】关于western blot后的stripping
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【求助】关于western blot后的stripping
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【求助】关于western blot后的stripping
实验室之前有人做过,但是效果一直不好
本人新手上路,由于所用样品制备周期长,所需的药物现短缺,于是老师命我尽快尝试stripping
给我的protocal实在是太简单,且前人尝试后效果不好
望前辈指点迷津,不胜感激!!!
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1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50-55℃，30min。
这是最常见的配方。
但是这个配方有几个很明显的缺点，
1、操作不太方便，需要55度水浴加热，并且振荡，不易控制。
2、beta-metaptoethanol 有很强烈的味道。
3、去除效果不好确定，并且可能对膜上的抗原会有较大的影响。
另外就是商品化的stripping solution.
可以很好的去除以上的几个明显的缺点，可以尽可能的保证去除和再生的效果，进而使实验数据更为准确。
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试试这个配方吧：
已配500ml的终体积为例：
甘氨酸-----------25mM-------------0.9385g
SDS--------------1%（w/v）-------------5g
步骤很简单：
膜第一次曝光后，用TBS或PBS洗去发光液10min，2次
加入上述stripping液，摇床，室温，30-45min。
TBS洗2-3次，10min/次
重新开始封闭、一抗。。。。。。即可。
前一段的试验由于样品量少，而检测的抗体多，一直用此方法，效果不错。不仅把原来的一、二抗洗得很干净，还不太影响本身的蛋白样品。LZ可试试。
祝实验顺利！
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stripping洗涤30-60分钟,摇床,然后TBST洗30分钟,摇床,
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1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50-55℃，30min。
这是最常见的配方。
但是这个配方有几个很明显的缺点，
1、操作不太方便，需要55度水浴加热，并且振荡，不易控制。
2、beta-metaptoethanol 有很强烈的味道。
3、去除效果不好确定，并且可能对膜上的抗原会有较大的影响。
另外就是商品化的stripping solution.
可以很好的去除以上的几个明显的缺点，可以尽可能的保证去除和再生的效果，进而使实验数据更为准确。
-------------------------------------------------------------------------------------
我老师给我的参考方案就是这个
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原帖由 131415 于
10:54 发表
试试这个配方吧：
已配500ml的终体积为例：
甘氨酸-----------25mM-------------0.9385g
SDS--------------1%（w/v）-------------5g
步骤很简单：
膜第一次曝光后，用TBS或PBS洗去发光液10min，2次
加入上述stripping液，摇床 ... ================================================
我明天想尝试此法,因为stripping的配方实在是太方便了!
在此还有两个疑问:
1.此方法对曝光几天后的膜是否仍然有效?(玻璃纸封住保存4°C)
2.用TBS还是TBS-T的效果比较好?
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beta-metaptoethanol 的配方适合抗体亲和力比较强的抗体strip，
甘氨酸的配方属于比较温和的配方，适合亲和力一般的抗体。
整个过程，反应时间也是个重要因素，过长会导致膜上抗原的损失，过短去除不充分。
我一般做这个实验，会根据使用的抗体的性质和膜上蛋白结合抗体的量来选择stripping buffer和去除的时间。
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如果两次的二抗不同源 且蛋白条带位置相差比较大
可以不strip直接杂第二个一抗
就是TBST洗下显影后的膜
封闭 一抗 二抗
由于这样不损失膜上的蛋白
如果抗体不紧缺 可以先试试
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我用甘氨酸,SDS法处理后,原来曝1min的样品现在需要30min才有很弱的条带
stripping时间为30min,封闭过夜了
导致蛋白损失这么多的原因是因为stripping过度还是因为封闭的时间太长呀?
我stripping之后加底物又曝了一次bata-actin,30min只有很淡的背景
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甘氨酸,SDS法，属于比较温和的stripping buffer，一般不会使膜上的蛋白损失太多。有几点需要确定。
第一，你stripping后是使用不同的一抗和二抗，还是相同的。如果是不同的考虑一下是否因为第一次的一抗和二抗去除的不彻底造成的第二次显色比较淡甚至没有。