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慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒， 三种质粒载体分别进行高纯度无内毒 素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6 h 更换为完全培养基，培养 48 和 72h 后，分别收集 富含慢病毒颗粒的细胞上清液， 病毒上清液通过超离心浓缩病毒。 以下内容由汉恒生物科技 （上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pHBLV 系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞 293T 细胞的培养 （一） 293T 细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的 出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数 生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入 PBS 洗去残留的培养基； 2、加入 0.25%的胰酶，消化 1～2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除 胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管 进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心 管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计 数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数） ，再乘以 10（10 倍稀释） ，即 为实 际 n 万/mL 细胞浓度。TM- 36 -4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞， 6 密度为 3 x 10 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检 测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二）293T 细胞的传代 当细胞生长到汇合率达到 80%～90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维 持细胞良好的生长状态。 1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、根据具体情况，将细胞分到 10cm 培养皿中，每个培养皿补足到 10ml 培养基。 4、将培养皿平稳放回 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 （三）293T 细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初 冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为 37～42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻 伤） ，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1～2min 内使细胞溶液完全溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离 心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。 四、慢病毒包装和浓缩- 37 -（一）质粒扩增 构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞 将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25%胰酶，使其 均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部 晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹 打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆 盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞 于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于 计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以 4 （得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。传代当天记 为第一天，若第二天进行转染，铺 900-1000 万/T75；若第三天转染，铺 350-400 万/T75。 每瓶 T75 加 10mL 10％DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转 染前无需换培养基。 （三）做脂转 complex DMEM 需在 37 度水浴中预热，LipoFiter 转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇 匀。 转染每瓶 T75 的 complex 成分如下：TMpspax10μgPMD2G10μgpHBLV 系列载体TM10μg转染后 6h 换新鲜培液。 注：LipoFiter 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考 LipoFiter 说明书。 （四）病毒收集 转染后 48 和 72h 分别两次收集病毒上清(24h 收集后置换新鲜培液)， 收集后以 0.45 μm 滤器过滤,于 40 mL 超速离心管中，4℃，72000g/min 离心 120 分钟；- 38 TM TM（五）病毒重悬和保存 500ul 新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80 度甚至液氮保存。 五、感染目的细胞 （一）细胞准备 将状态良好的目的细胞接种到 24 孔板，使细胞浓度为 1×10 /ml 细胞，接种细胞数量 因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50% 至 70%直接。 （二）病毒感染 1.polybrene 的选择： Polybrene:是带正电的小分子， 与细胞表面的阴离子结合， 提高慢病毒对细胞的感染效 率，通常加入 polybrene 能提高感染效率 2～10 倍。 Polybrene 有一定的细胞毒性，有的细胞对 polybrene 的毒理反应明显，因此细胞感染 时是否适合 polybrene 需要摸索； 不同细胞对 polybrene 的敏感度不同， 可以用 1～10μg/ml 的范围筛选合适的浓度， 以 24h 内细胞无明显毒性反应为佳， 可参考文献并进行预实验摸索， polybrene 最常用的工作浓度为 6～8μg/ml。 注： 1 ）汉恒生物的自产的 Polybrene 产品，用户可用以进行辅助感染。提供的 Polybrene 母液保存在-20℃（可保存 1 年以上），避免反复冻融 3 次以上，否则活性受影 响。4℃可保存 2 周。 2） Polybrene 预实验请先以对照病毒进行摸索， 部分细胞系 MOI 及 Polybrene 的 使用参见附表 2。 2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表达目的基因。 而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合 的 MOI 进行实验。 3.感染步骤 按实验需要将细胞铺板（比如 12 孔板）。细胞数以第 2 天密度约 50%为宜。37℃ 培养 过夜。5- 39 -对于 Polybrene 可施加的细胞：准备完全培养基和 Polybrene 混合物，Polybrene 终 浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔 中（适用于 24 孔板，其他孔板请相应调整体积。） 对于不适用 Polybrene 的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。 感染前，从冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入 1/2 体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻 8 字混匀。 （具体加入的病毒数可参考附 表 1）37℃小体积感染 4 小时，4 小时后补齐培养基至正常体积。（感染时培养基体积表格 如下）病毒小培养体积感染表培养皿类型表面积/cm2对应细胞培养液体 积病毒感染对应细胞 培养液体积96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm20cm24ml2ml100mm60cm210ml5ml慢病毒感染 4 小时后补足至培养体积，感染 24 小时后换液，腺病毒感染 2 小时后直接换 液感染后第二天 （约 24 小时） ， 吸去含病毒的培养液， 换上新鲜的完全培养液， 继续 37℃ 培养。- 40 -感染后 48 小时，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 表达效率， 对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒， 换上含适当浓度的 Puromycin 的新鲜完全培养液， 筛 选稳定转导的细胞株（详见下方）。 注意： 溶化的 shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。 反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温 可使病毒效价降低。 4.Puromycin 抗性筛选： Puromycin 标准的施加终浓度范围为 1～10μg/ml，不同细胞 puromycin 的工作浓度不 同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒 感染的野生型细胞），加入等量等浓度的 puromycin。 部分细胞 puromycin 参考值Cell lineSpeciesPuromycin (?g/ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB-×××Human1-3- 41 -HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Human embroyonic stem cells（Human ESCs）Human1更多 Puromycin 使用浓度更新中，详情请参考公司网站……每 2-3 天换含 puromycin 的完全培养液一次，至不感染筛选对照组细胞被 puromycin 杀光，可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。 不挑取单克隆： 将感染并筛选后的细胞进行传代， 并继续施加 puromycin 进行维持性筛选培养。 连续筛 选并传 3 代后，冻存保重稳定细胞株。 挑取单克隆： 将感染并筛选后的细胞挑选至少 5 个克隆进行细胞扩增， ， 并继续施加 puromycin 进行 维持性筛选培养。扩增完毕后 western blot 或者 QPCR 检测目的蛋白的表达。挑取表达适中 的稳定细胞株，连续筛选并传 3 代后，冻存保重稳定细胞株。 5. 感染悬浮细胞 上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法， 若是悬浮或半悬浮细胞， 则需要通过平角离心 转 染法 ，即将 适量 的病毒 液加 入细胞 培养皿 后， 封好 口，放 入平角 离心 机后 ，低速 （500g-1000g/min）离心 1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没 有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上 清，然后加入适量的病毒液，室温放置 15min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同 时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。 6. 对于极难感染的细胞- 42 -对于极难感染的细胞，如 DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染 24 小 时后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。- 43 -附 1：汉恒生物慢病毒质粒图谱 过表达 1.单标记2.双标记 IRES 载体慢病毒过表达载体，ZSGreen/puro 标记- 44 -T2A 系列载体：ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-PuroLuc-T2A-PuroZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc 干扰 1.单标记- 45 -2.双标记 IRES 系列载体慢病毒 shRNA 干扰载体，ZSGreen/puro 标记- 46 -T2A 系列载体：ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-PuroLuc-T2A-PuroZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc- 47 -特殊用途用于融合蛋白构建慢病毒载体启动子替换Tet-on system 慢病毒载体：单病毒系统，无须另外表达 rtTA，出毒率低，只做建系用， 无法提供病毒Tet-on 过表达系统，目的基因 插入 MCS 区，只在 DOX 存在 下才表达，puro 可持续表达， 用于筛选AMP pUC s v40ori s inLTR 1Zeo'TRETet-on 干扰系统，应用 mir30 的 sh-mirCMV-minimal(-50to+8)regwPREpTRIPZ 13320bpPuroR s hRNAmir IRES rtTA3 UBC prom turboRFPAgeI (2991)ClaI (3702) HpaI (3791) xhoI (3805) EcoRI (3829) MluI (4063)结构，与 tuboRFP 融合表达，加 DOX 时 RFP 和 sh-mir 结构启动表达，因此 会看到加 Dox 后 24 小时有荧光出现； puro 为持续表达，用于筛选 注意：sh-mir 合成非常贵- 48 -附 2：慢病毒滴度测定方法简介: 1、细胞准备 将生长状态良好的 293T 细胞消化计数后稀释至 1x105/ml, 加入 96 孔板， 100ul/孔， 为每个病毒准备 6 个孔。放入 37℃，5%CO2 培养箱中培养。 2、加病毒 第二天，在 EP 管中做 3 倍梯度稀释，连续 6 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准 备 6 个 1.5mlEP 管，每管加入 90ul 培养液，往第一个管中加入 10ul 病毒原液，混匀后， 吸取 10ul 加入第二个管混匀。以此类推，做十个稀释度（10～3*10-3） 。 3、追加培养液 第三天，吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入 100ul 完全培养液，以利于细胞 的生长。 4、观察结果并计算滴度 第五天，在荧光显微镜下观察结果。 滴度（PFU/ml）=细胞数*荧光百分比*MOI*病毒稀释倍数*103- 49 -附 3：汉恒生物目的细胞慢病毒感染复数（MOI）与体积对应表规格大约数目MOI 值加入病毒数 量慢病毒MOI 摸索时加入的体 积梯度/ul96well2-5×10420-5 00.4-2.5× 1064-25ul4；12；2048well1-2×10520-5 00.2-1×10720-100ul20；60；10024well2-3×10520-5 00.4-1.5× 10740-150ul40；120；20012well5×10520-5 01-2.5×107100-250u l100；300；5006well1-2×10620-5 00.2-1×1080.2-1ml200；600；100035mmdish1-2×10620-5 00.2-1×1080.2-1ml200；600；100060mmdish2-4×10620-5 00.4-2×1080.4-2ml400；100mmdish6-10×10620-5 01.2-5×1081.2-5ml；6000- 50 -150mmdish1-2×10720-5 00.2-1×1092-10ml；10000慢病毒滴度以 108/ml 为准，其他滴度需相应换算; 大约细胞数目是根据 80%～100%细胞密度估算而出，具体细胞数请种细胞时进行 细胞计数。注： 1）24板长满了细胞大约有3×10 个细胞。 如果一天后要长到70％（2.1×10 ）， 建议 5 1.2－1.4×10 个细胞。因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长 条件，不会达到24小时翻一倍的速度。其他规格培养可参照此确定相应culture细胞量。 2）MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义 即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。 各种细胞的最适MOI值有差别， 请客户正式实验 前先进行预实验摸索最适MOI。5 5- 51 -附 4：慢病毒 MOI 感染参数 注：不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI 值也略有差异， 以下数据是在细胞感染效率在 85-100%细胞状态良好的情况下获得的，仅供参考。细胞系名称细胞描述MOI 值范围能否添加 polybreneK562人白血病细胞20～40可Jurkat人白血病细胞株50～80不可kasumi人白血病细胞株10～30不可NB4人白血病细胞株50～80不可U937人单核细胞20～40可THP-1人单核细胞株50～80可GBC-SD人胆囊癌细胞株30～50不可H929人多发性骨髓瘤 症细胞系100～150不可H1299人非小细胞性肺 癌细胞1～3可95D人肺巨细胞癌2～4可A549人肺腺癌20～40可- 52 -SPC-A-1人肺腺癌细胞100～150可7402人肝癌细胞10～15可Hep 3B人肝癌细胞10～30可Hep G2人肝癌细胞10～30可SMMC-7721人肝癌细胞10～30可Huh-7人肝癌细胞系10～30可Hela人宫颈癌细胞株10～30可HOS人骨肉瘤细胞系20～40可Hep-2人喉癌细胞株10～30可HL-60人急性髓系白血 病细胞株&100可HT-29人结肠癌细胞10～30可PKO人结肠癌细胞2～4可SW480人结肠癌细胞株10～30可DLD-1人结直肠肿瘤细 胞株10～30可- 53 -SK-OV-3人卵巢癌细胞株2～4可SHG-44人脑胶质瘤细胞10～30可U251人脑胶质母细胞 瘤1～3可U87人脑星型胶质母 细胞瘤1～3可293T人胚肾上皮细胞1～3可HUVEC-2C人脐静脉血管内 皮细胞10～30可PC-3人前列腺癌细胞20～40可MDA-MB-231人乳腺癌细胞10～30可MCF-7人乳腺癌细胞株20～40不可Tca8113人舌鳞状细胞癌10～30可RPE人视网膜色素上 皮细胞10～30可AGS人胃癌细胞100～150可BGC-823人胃癌细胞100～150可- 54 -SGC-7901人胃癌细胞10～30可MKN-28人胃癌细胞株20～40可MKN-45人胃低分化腺癌 细胞株20～40可BxPc-3人胰腺癌细胞20～40可CFPAC-1人胰腺癌细胞50～80可Panc-1人胰腺癌细胞2～4可HEC-1-B人子宫内膜癌细 胞株2～4可NIH-3T3小鼠成纤维细胞 系20～40可Raw264.7小鼠单核巨噬细 胞白血病细胞10～30 （感染后分 化）不可CHO中国仓鼠卵巢细 胞20～40可HSC-T6大鼠肝星型细胞10～30不可C6大鼠脑胶质瘤细 胞&100可- 55 -NRK大鼠肾细胞10～30可- 56 -附 5：汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较腺病毒慢病毒逆转录病毒感染方式直接加入直接加入直接加入换液时间感染后 2h感染后 24h感染后 24h是否需要筛选不需要， 腺病毒感 染能力很强需要筛选获得 稳定感染株，慢病毒 的感染能力不强需要筛选获得 稳定感染株，逆转录 病毒的感染能力不 强观察时间如带有 GFP 等荧 光标签，24h 后可观察 到荧光，36h 可达到表 达高峰， 若不带有荧光 标签，则需要鉴定带有 GFP 等荧光 标签，24h 后可以观 察到表达，36h 达到 高峰，若不带有荧光 标签，则不可直接观 察到，需要鉴定带有 GFP 等荧光 标签，24h 后可以观 察到表达，36h 达到 高峰，若不带有荧光 标签，则不可直接观 察到，需要鉴定是否需要助转剂不需要有时需要，但是 根据具体情况操作， 因为助转剂，如 polybrene ，对细胞 的伤害比较大，有的 细胞可能承受不了有时需要，但是 根据具体情况操作， 因为助转剂，如 polybrene ，对细胞 的伤害比较大，有的 细胞可能承受不了- 57 -附 6：汉恒生物病毒包装周期表腺病毒慢病毒过表达干扰过表达感染目 的 序 列获得3～5 天2～4 天目的序 列获得3～5 天2～ 4 天穿 梭 质 粒构建3～12 天3～12 天重组表 达质粒构建8～12 天8～12 天质 粒 重 组5～10 天5～10 天慢病毒 包装5～10 天5～10 天腺 病 毒 包装12～15 天12～15 天病毒浓 缩（可选）1～2 天1～ 2 天大 量 扩 增12～15 天12～15 天滴度测 定3～5 天3～ 5 天纯化（可 选）14～21 天14～21 天目的细 胞感染， 筛选14 天14 天滴 度 测 定3～5 天3～5 天过表达/ 干扰效率验 证3天3天时 间 总 计52～83 天51～82 天时间总 计37～49 天36～48 天附 7：动物实验对腺病毒和慢病毒的要求及实现方式- 58 -腺病毒慢病毒是否需要纯化 及方法需要纯化，纯化方法：CsCl 梯 度离心不需要纯化是否需要浓缩 及浓缩方法纯化之前需要浓缩，PEG8000 沉降法需要浓缩，浓缩方法：超速 离心法或 PEG8000 沉淀法。实现方式注射注射附 8：病毒的保存条件与运输条件腺病毒慢病毒保存条件分装于-80 度长久保 分装于-80 度长久保存； 一周内使用可保 存； 一周内使用可保存于 4 存于 4 度。忌反复冻融。六个月后再次使用， 度。勿反复冻融。六个月 需要重新测定病毒滴度。 后再次使用，需要重新测 定病毒滴度。0 运输条件用普通的冰袋，不可以用干冰运输，因 为干冰所造成的 CO2 气体环境会大大降低缓 冲液的 pH 值，从而极大影响腺病毒在缓冲液 中的稳定性。但如果使用封口严密的西林瓶 或安培瓶包装腺病毒，则可以用干冰运输。先将病毒保存于-80 度，然后全程干冰运输附 9：慢病毒收到后的注意事项 1、慢病毒的储存 用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4 ℃保存 （尽量一周内用完）；如需长期保存请放置于-80℃。 注：- 59 -a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度 10%）；在病毒使用过程中应 尽量避免反复冻融， 所以我们前期对病毒进行了分装 （100ul/tube） ， 收到后直接放置-80℃ 保存即可。 b．如果病毒储存时间超过 6 个月，我们建议使用前重新测定病毒滴度。 2、慢病毒的稀释 用户需要稀释病毒时， 请将病毒取出置于冰浴融解后， 使用培养目的细胞用 PBS 或无血 清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(请尽量一周内用完)。以上内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结，公司专注于为广大科研工作者提 供腺病毒、 慢病毒、 逆转录病毒包装、 细胞稳定株筛选、 siRNA 设计和 microRNA 研究服务。 若您有任何技术问题即可联系我们(www.hanbio.net)。如若引用，请注明出处，所有解释权 最终归汉恒生物所有。- 60 -关注今日：2 | 主题：317973
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【求助】请教慢病毒载体腹腔注射感染小鼠使用剂量
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这个帖子发布于8年零154天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问战友们，有没有谁做过，通过腹腔或静脉注射慢病毒载体来感染小鼠。现在制作出的慢病毒载体滴度大概为2*10E8 TU/ml，大概每只老鼠使用多少微升能起到感染的效果，如果剂量过大是否会引起老鼠死亡？急需帮助呀！！！！
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The titer of the lentiviral vector would be too low to infect over 30% of cells in the animal body. The point is how to detect the infection, and how to test the transgene expression.
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文献资料找了半天还是一点头绪没有，有没有谁这样做过？
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你的慢病毒体内实验做得怎么样了？？
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给大鼠注射腺病毒和慢病毒的区别
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丁香园准中级站友
请问用腺病毒或慢病毒作为载体给大鼠经尾静脉注射有什么区别么？听说腺病毒在体内会自己消失，需要反复注射，但反复注射又会产生抗体，慢病毒是不是注射一次就一劳永逸呢？
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丁香园助理版主
腺病毒优点：感染效率高，很多细胞都能达到近 99%；纯化后的腺病毒可以直接进行动物活体注射；可以在体外扩增，每次使用完后，可以自己用包装细胞进行扩增，节约成本；一次包装所得到的滴度较高（纯化后为 10 的 11 次方 pfu/ml);缺点：对细胞活性要求高，不整合到基因组，无法稳定表达。慢病毒优点：可以插入细胞基因组，稳定表达且持续时间长，对细胞活性要求低；缺点：感染效率相对于腺病毒要低很多；不能扩增，一次包装的病毒用完后如果再需要只能重新包装，成本较高。一次包装所得到的的病毒滴度也相对较低（10 的 8 次方 pfu/ml），不大适合直接用于动物实验。
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但是总体来说，对于很多实验来说，选择腺病毒优势更大，并且很多情况下腺病毒是可以替代慢病毒来进行实验的：一、后续实验周期不太长（一个月内）。选择腺病毒比慢病毒效率更高，用慢病毒的话感染效率不会太高，效率高的话也就70%到80%这样，不能直接进行后续实验，需要筛选稳定细胞株，而筛选稳定细胞株时间至少需要两周时间，筛选过程不顺利的话，需要的时间更多，会耽误实验。而腺病毒感染效率高，很多细胞的效率可以达到99%以上，这样就不需要话费额外的时间筛选稳定细胞株，可直接进行后续实验，对于实验时间和精力上节省很多。二、目的细胞感染难度大，且后续实验不需要建立稳定细胞株。对于这种情况，当然是强烈建议用腺病毒，不说腺病毒感染效率会高很多，成本上也会节省很多。比如神经细胞，慢病毒感染效率估计只有30%这样，要把感染上的细胞分选出来继续培养才能进行后续实验，但是很多神经细胞（肿瘤细胞除外）都是不可传代的，如果筛选后几乎剩不了多少细胞，可能就无法完成后续实验。但是如果用腺病毒就不会出现这样的情况，腺病毒感染效率会比慢病毒高很多（可以达到70%左右），这样筛选出来的细胞可以直接进行后续实验，节省了时间成本。三、要进行动物实验。动物实验需要的病毒量大，且病毒的滴度要很高，这样才能达到最小体积注射足够的病毒的目的。这一点，慢病毒肯定没法做到，目前慢病毒能达到的最高有效滴度一般是108PFU/ml，但是注射一只小鼠所需的病毒量至少1x108PFU/ml，而一只大鼠至少需要109PFU/ml，这样包装一次的慢病毒只能用于一只动物，同时，用慢病毒的话，要大约1ml的注射体积才能达到动物所需的病毒量，这个体积的液体量对于动物体是有害的，尤其是注射脑部，动物是承受不住的，但是用腺病毒就不会出现这样的情况，腺病毒的滴度可达到1011PFU/ml，用于动物实验时，每只小鼠只需要1ul，而每只大鼠10ul这样既可，一次包装的腺病毒足以完成一次动物实验研究，同时腺病毒可以扩增的，一次包装的腺病毒用完后不需要重头再次包装，而只要再扩增纯化即可，这样在经济成本和时间成本上都会节省很多。给你链接自己看吧，里面有分析具体什么情况可以使用腺病毒代替慢病毒的。
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动物实验强推腺病毒动物实验需要的病毒量大，且病毒的滴度要很高，这样才能达到最小体积注射足够的病毒的目的。这一点，慢病毒肯定没法做到，目前慢病毒能达到的最高有效滴度一般是108PFU/ml，但是注射一只小鼠所需的病毒量至少1x108PFU/ml，而一只大鼠至少需要109PFU/ml，这样包装一次的慢病毒只能用于一只动物，同时，用慢病毒的话，要大约1ml的注射体积才能达到动物所需的病毒量，这个体积的液体量对于动物体是有害的，尤其是注射脑部，动物是承受不住的，但是用腺病毒就不会出现这样的情况，腺病毒的滴度可达到1011PFU/ml，用于动物实验时，每只小鼠只需要1ul，而每只大鼠10ul这样既可，一次包装的腺病毒足以完成一次动物实验研究，同时腺病毒可以扩增的，一次包装的腺病毒用完后不需要重头再次包装，而只要再扩增纯化即可，这样在经济成本和时间成本上都会节省很多。下面这个网址上有具体的资料，涉及MOI值和注射量可以作为参考看看。
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