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表达外源蛋白的有利工具_毕赤酵母表达系统
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现代生物医学进展ProgressinModernBiomedicine2009Vol.9No.1
和AOX2基因，能快速利用甲醇即甲醇利用正表型（Mut+）。以GS115（Mut+His一）最常用；第二种宿主菌AOX1基因部分敲除,酵母菌在甲醇培养基中生长缓慢，为甲醇慢利用型，如KM71（MutsHis一）；第三种宿主菌AOX1及AOX2基因均被敲除，酵母菌不能进行甲醇代谢,为甲醇不利用型，即Mut－型，如MC100-3。近年来通过对这3种菌株的改造，衍生出十几种不同基因型的宿主菌，如防止表达的外源蛋白降解的一类蛋白SMD1163SMD1165（his4prb1（hi4pep4prb1），）酶缺失菌株：
和SMD1168（his4pep4），其中pep4和prb1分别代表蛋白酶A和B编码基因缺失。用SMD1163菌株表达无糖基化的人腺嘌呤2a受体，在最佳的表达条件下膜蛋白受体的表达水平可达8~12pmol/mg[3]。3毕赤酵母表达载体
酵母表达系统的载体主要分为附加型和整合型。因整合型载体具有保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因的优点，①单一交叉插入：广泛用于外源蛋白的表达。整合的方式两种：外源基因通过重组插入到毕赤酵母染色体基因组His4位点或AOX1基因的上游或下游,AOX1基因仍然保留,转化子表型为Mut+,能利用甲醇。此种整合的成功率为50%～80%,而且通过重复可形成多拷贝的转化子；②双重交叉替换：酵母染色体AOX1基因被载体外源基因表达元件和标记基因所代替，酵母只能依赖AOX2基因编码的活性较低的醇氧化酶进行甲醇代谢,此种转化子为Muts表型,利用甲醇的效率很低，产生的转化一般认为单交换整合的转化子多为单体，整合率为10%~20%。子在高密度发酵时不稳定,通常都采用双交换整合方式获得高效表达[4]。
整合型载体表达有胞内表达和胞外分泌两种方式，胞内表达适合于通常在胞浆中表达或不含-s-s-键的非糖基化蛋白，比胞外分泌水平高,但产物纯化相对复杂[5]。常见的胞内表达载pPSC3k、pHIL-D1、pAO815等。分泌型表达载体在体有pPIC3、
信号肽的引导下，将成熟的蛋白质分泌到细胞外，分泌型表达pPIC9K、pHIL-S1p、YAM7SP6、pGAPZa等。载体有pPIC9、
（葡萄糖为碳源）培养条件下，能够提供与AOX1启动子水平相当的表达。而PEX8和YPT1是从巴斯德毕赤酵母中分离获得的，启动基因柔和表达的启动子。
一般认为酵母启动子与要表达的外源基因的ATG之间距离越短对该基因表达越有利，启始密码子AUG处于&CCAC-CAUGG&这样序列更容易形成核糖体复合物，从而启动蛋白质的合成。
4.1.2密码子虽然毕赤酵母表达系统有很强的启动子，但并非所有的外源序列都能得到高表达。毕赤酵母对所使用的氨基酸密码子具有偏好性。通过对酵母基因使用密码子的统计分析，确证了在所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的。将编码hNT-3氨基酸的密码子转换成毕赤酵母（P.pastoris）偏爱的hNT-3的表达水平提高了约11倍左右[6]，这表明外源基因式，
密码子的选用对其表达量有很大的影响。
除了密码子使用外，碱基的A+T组成也影响了蛋白的表达，局部序列A+T%含量过高会被毕赤酵母系统认为是终止信号，造成转录提前终止。研究表明A+T%在30%-55%区间较适合毕赤酵母外源基因的表达[7]。已有学者设计出一套毕赤酵母外源基因表达序列的优化软件，该软件对毕赤酵母低表达基因序列进行分析并优化，并与毕赤酵母高表达基因AOX1的密码子的使用频率和AT含量进行比较，结果显示优化后序列有着与高表达基因AOX1相似的特性[8]。
4.1.3信号肽序列酵母本身分泌的内源蛋白质较少，利用信号肽序列引导外源蛋白质的分泌表达，纯化方便，故为优先选择即外源蛋白自的方式。毕赤酵母可以选择的信号肽分为两类：
身的信号肽和来源于酵母的信号肽。外源信号序列引导表达的重组蛋白较易降解，而且效率一般较低，因此通常选择酵母本身的分泌信号肽来指导外源基因表达产物的分泌。常用的酵母信号肽有存在于酸性磷酸脂酶（PHO5），蔗糖酶（SUC2）和α因Killer毒素等中的内源性信号肽，子（MFα1），其中以α因子信号肽应用最广，主要是对小分子量多肽和蛋白质分泌起作用。对大分子量蛋白质而言，菊粉酶信号肽序列（INU）能高效引导大分子量糖蛋白如人α一AT（45kD）分泌[9]。信号肽在内质网分三步加工:第一步是信号肽酶去除前肽;第二步是Kex2内肽酶在精氨酸和赖氨酸间切割;第三步是Ste13蛋白对谷氨酸-丙氨酸重复序列切割。实验证明通过pPIC9K载体上的信号肽将hCNTF蛋白分泌表达至毕赤酵母上清中，并折叠成有活性的构象[10]，利用毕赤酵母表达风疹病毒融合E1蛋白时，发现α信号肽介导分泌出细胞的E1蛋白形成能够被特异性单克隆抗体识别的构像;而停留在细胞内的蛋白则不能单克隆抗体识别[11]，这表明信号肽在外源性蛋白表达和修饰中起着重要的作用。
4.1.4外源基因拷贝数通常P.pastoris的表达量与其含外源基因拷贝数成正相关。梁伟锋等[12]通过hBDNF在毕赤酵母中的hBDNF表达量随多拷贝表达，发现在1~6整合拷贝数范围内，基因剂量的增加而升高，而工程菌的生长无明显变化。同时也有研究表明，有些基因随着拷贝数增加反而降低了表达水平，在hA20基因整合数为11和15的高拷贝菌株中hA20基因丢失最快[13]，菌株的稳定性减弱，导致蛋白表达水平下降，其原因
4影响外源蛋白表达的因素
巴斯德毕赤酵母表达系统是否高效表达重组蛋白，主要受外源基因本身序列的内在特性和酵母发酵外源性因素两方面的影响。
4.1外源基因本身结构特性
4.1.1启动子外源基因在酵母中的表达一般是采用酵母基因的启动子（PAOX1）。虽然在PAOX1的调控下通过甲醇诱导已成功表达了多种外源蛋白，但该系统存在一定缺陷，如甲醛有毒性，不适用于食品生产，而且诱导时甲醇易挥发，需连续添加甲醇，操作繁琐还存在一定的火灾隐患，因此相继出现了GAP、FLD1、PEX8和YPT1启动子。毕赤酵母中3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子（即GAP启动子）在葡萄糖的诱导下，能提供与AOX1启动子水平相当的连续性表达，在培养过程中不需更换碳源，操作更为简便。但GAP启动子的连续性表达不适用于对酵母具有毒性作用蛋白；毕赤酵母的谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶基因的启动子（即FLD1启动子），在甲基化胺为氮源
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