1、景杰生物有哪些蛋白质修饰抗体?答：按制备原理分为：单克隆抗体、多克隆抗体；& & & &按识别范围分为：泛抗体、位点特异性抗体；& & & &按修饰类型分为：常见类型修饰，Kac, Kme, phospho, K(gly-gly) 等；& & & &全球独有类型修饰，Ksucci, Kcro, Kbuty, Kprop, Kmal等。2、抗体产品的基本应用？答：ELISA、Dot Blot、Western Blot、IF、IP、ChIP。3、你们公司的泛抗体指的是什么抗体?答：我们公司的蛋白质修饰泛抗体是相对于组蛋白位点特异性抗体而言的。泛抗体可以识别某一类含有某种修饰性氨基酸残基的蛋白质。我们公司的泛抗体种类是目前业界最齐全的，不仅有常见的乙酰化、磷酸化等泛抗体，还有世界独有的琥珀酰化、巴豆酰化、丁酰化、丙酰化、丙二酰化等泛抗体。4、能否用泛抗体检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号?答：我们公司的蛋白质修饰泛抗体是指可以识别所有含该类修饰的蛋白质的抗体，与组蛋白位点特异性修饰抗体的区别在于不局限于某个蛋白的某个位点。如Lys三甲基化的修饰泛抗体可以识别所有含有Lys三甲基化的蛋白，而组蛋白H3K4Me3就只能特异性的识别组蛋白H3第4位Lys的三甲基化修饰。因此泛抗体是可以用来检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号。5、抗体生产的流程?答：(1) 单抗：多肽合成→交联KLH为免疫原（抗原）→免疫→小鼠（取血检测WB、Dot、Elisa）→取脾脏磨碎→与骨髓瘤细胞融合（在PEG作用下融合）→选择培养（HAT培养基）为融合的细胞死亡，杂交瘤细胞存活→阳性克隆的筛选及克隆化→克隆扩增及大量制备McAb（打腹水→Protein G纯化（一步）→QC检测。& & & &(2)&多抗：多肽合成→交联KLH为免疫原（抗原）→免疫→兔子（取血检测Dot,WB泛抗体时不用）→检测合格（大规模取血，每次取30ml，大约要150ml）→纯化→QC检测→上市入库。& & & &注：合成多肽一般15个氨基酸，抗原决定簇是3-5个氨基酸。种族的差异性越强越易产生抗体，但修饰位点固定，我们的抗体很难做，导致修饰的抗体贵。6、每批次抗体入库前，做过哪些验证?答：我们需要做Dot、WB和IP质谱三项检测。Dot检测是在开发过程中进行的检测，检测抗体是否识别自己的免疫原以及是否和其他位点、其他修饰交叉，抗体的特异性和灵敏度。Dot检测合格后进行WB检测。位点特异性抗体，WB主要检测抗体在不同细胞裂解液中是否有变化。泛抗体，主要是看WB条带丰度是否好，使用其免疫原能否把条带信号竞争掉，或在经药物处理的细胞裂解液前后修饰水平是否有变化，检测泛抗体的广谱性，并为客户提供抗体的合适工作浓度。IP质谱检测主要是针对泛抗体而言，看抗体能否从一堆肽段中抓到带有某种修饰的肽段，能否用于修饰组学技术服务。7、抗体产品用途? IP效果如何?答：(1)&抗体可以用来做 WB，ELISA，Dot，IP，IF（免疫荧光）等；& & & &(2) 我们的泛抗体可以用来做肽段水平的IP且效果非常好，但不建议直接做蛋白水平的IP，效果不是很好，客户用我们的位点特异性抗体尝试做过IP，结论是可以的；& & & &(3) ChIP：我们没有用自己的抗体专门做过相关的检测，但我们也准备对此进行验证。8、景杰生物的修饰类抗体是否可以用于ChIP实验?答：ChIP实验中由于Buffer体系调节恶劣，对抗体的要求比较高，即：结构稳定、亲和性高、选择性好。景杰生物的修饰性抗体现已验证出适用于ChIP的几种抗体，同时有多家实验采购我们的抗体用作ChIP实验，也反馈抗体可以很好的用于ChIP实验。9、抗体可以做免疫组化么？答：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。我们的抗体是可以做免疫组化、WB、ELISA等实验。10、甲基化抗体中单甲基、二甲基、三甲基的抗体如何区分同一位点的一、二、三甲基的基团而互不交叉?答：(1) 首先，我们在抗体研发过程中，抗原多肽的合成阶段已经区分开；& & & &(2) 其次，景杰生物的所有抗体都经过了严格QC验证，甲基化抗体也不例外。通过Dot Blot和ELISA验证抗体的同一位点不同修饰和相同修饰不同位点之间是否存在交叉。11、景杰生物的开发的抗体应有什么特点?答：蛋白质修饰的泛抗体是世界上最难开发的研究应用类抗体，这是因为抗原的免疫性低，抗体的灵敏度不高，亲和性差以及很容易产生不同修饰抗体之间的交叉反应。我们开发了独有的从抗原设计、抗原合成、免疫策略、抗体纯化到抗体检测的完成流程，从而能够开发出世界上最多类型的蛋白质修饰泛抗体。& & & 同时由于上述抗体开发方面的特点，蛋白质修饰泛抗体的WB实验是一项非常困难的实验。与普通的WB实验不同，蛋白质修饰泛抗体的WB成功实验至少需要一个月以上的专门训练。景杰生物建立的完整的蛋白质修饰泛抗体WB实验流程，如果您在我们抗体的WB应用方面有困难，可以由我们的专业人员帮助您完成实验。12、景杰生物有多少种类的组蛋白修饰位点特异性抗体?答：景杰生物除了自己开发了市面上已有的如组蛋白Kac、Kme等位点特异性抗体外，还开发了世界上独有的组蛋白Kcro、 Kprop、Kbuty、 Ksucci的位点特异性抗体。虽有表观遗传学研究的深入，上述新型的组蛋白表观遗传标记抗体必定对揭示全新的表观遗传现象有重要的价值。简而言之，景杰生物目前成功开发出了拥有最有修饰类型、覆盖最多修饰位点的组蛋白修饰的位点特异性抗体，并且所有抗体均通过了严格的交叉信号的检测。13、景杰生物修饰类抗体的优势?&答：(1) 鉴定并开发出世界上最多的修饰类抗体，其泛抗体数量远远大于其他公司（如Abcame，CST等）泛抗体的总和；& & & &(2) 每一批抗体在送到用户手中之前，都进行了严格的3项测试，表征抗体的亲和性、高度选择性、稳定性。对交叉反应的检测，是景杰生物有别其他抗体公司专门进行一项检测；& & & &(3) 国际知名药厂GSK，Roche等，知名大学哈佛，清华、北大等均大量使用景杰生物的修饰类抗体，得到了国际国内科研工作者的广泛赞誉；& & & &(4) 国内外知名科学工作者，和有丰富抗体研发经验的公司scientific board，可以为抗体使用提供优质的指导。同时为获得最佳实验结果，公司也接受WB等基础实验的外包。14、市面上有很多组蛋白修饰的位点特异性抗体，你们的同类型抗体有什么优势?答：是的，诸如CST，Abcam，Active Motif、Millipore均提供多种组蛋白修饰的位点特异性抗体，尽管他们的抗体看起来有比较好的QC检测，但组蛋白修饰的位点特异性抗体的核心在于高特异性，即和其他结构类型的修饰没有交叉反应。上述任何一家公司的均没有对他们的抗体进行任何类型的交叉反应检测。随着现在对组蛋白修饰类型的深入了解，越来越多的组蛋白修饰类型被鉴定出来，因为，上述公司开发的组蛋白修饰位点特异性抗体很可能和其他类型的修饰有严重的交叉反应。在这方面，景杰生物是全球唯一一家队自身开发的组蛋白修饰位点特异性抗体进行了严格交叉检验的公司，所有的上市的抗体均经过了特殊的技术流程确保了高特异性和高灵敏度。15、看到你们公司网站上，乙酰化抗体偶联树脂有普通和优质2种，而且价格差别很大，请问是为什么？规格是多少？我如果做IP的话，一次需要用多少？答：优质的乙酰化抗体偶联树脂是同时偶联了来自不同克隆株的乙酰化的单抗和多抗，抗体识别范围扩大，从而增加了树脂的捕捉抗体能力；而普通树脂只用了乙酰化的单抗。我们的树脂规格是0.25ml的干树脂溶在含有50%甘油的slurry里，总体积是0.5ml, 偶联的抗体可高达1mg（4mg/ml），相当于10支标准包装的乙酰化泛抗体（2880 元/支。100微升），所以说优质树脂售价14380元是性价比很高的。每个树脂可以做15次IP, 一次只需用15微升左右，可以用于1-2mg的肽段溶液样品。16、用你们公司的抗体偶联树脂，进行蛋白富集，然后进行WB鉴定或质谱鉴定可以么？答：(1) 首先，我们的抗体偶联树脂适用于修饰性肽段的富集，也可以用于直接的蛋白富集，但效果不佳，我们也不建议这么做。原因蛋白是大分子，直接用抗体偶联树脂来富集很困难，修饰性的抗体及偶联树脂都是识别被修饰的肽段残基，对于整个蛋白而言，修饰性位点可能在蛋白表面，也可能被蛋白三维结构包裹在内部，这样抗体及其树脂是很难识别到的。而蛋白经酶解后的肽段，修饰位点可以完全暴露在外面，肽段分子量很小，非常利于富集；& & & &(2) 其次，您如果是想鉴定目的蛋白某种修饰的有无，我们建议您直接用我们的修饰泛抗体进行WB鉴定，或者将蛋白进行SDS-PAGE，胶内酶解后鉴定。17、WB的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况?答：(1)&首先要确定这条带的大小；比如，组蛋白H3的信号会很强，经常出现在17kD左右，如果曝光时间短的话，很可能只存在信号强的条带；& & & &(2)&上样量是否足够；& & & &(3)&抗体浓度是否正确使用；& & & &(4)&荧光底物不灵敏，可调整荧光底物的孵育时间、曝光时间等。18、WB实验中是否条带越多，蛋白修饰的丰度越高?答：(1)&客户提到的修饰丰度指什么，是一种蛋白的修饰强弱，还是指修饰的广谱性?& & & &(2)&同一样品，不同处理的对比，可以这么说；& & & &(3)&不同样品，不同来源，无可比性；& & & &(4)&条带的强度，可以体现该条带大小的蛋白修饰丰度高。19、我们的泛抗体做WB的比例多少，100微升可以做多少次WB?答：我们推荐稀释比例都是1:1000，客户可以根据实际情况自行调整。20、用乙酰化、琥珀酰化泛抗体做WB检测，客户做不出条带的原因?答：我们的乙酰化、琥珀酰化泛抗体在生产之后都有专门的质量检测，且在所有抗体销售中是销量较好、客户评价最高的两类的抗体，质量是毋庸置疑的。建议帮助客户从自身WB检测的实验中找原因。21、WB显示条带丰度较好，质谱鉴定到的蛋白种类比条带丰度相对不好的蛋白种类要少?答：WB某一个条带不代表一种蛋白，而是相同分子量的一类蛋白群。因此一个丰度较好的条带里很可能既存在实际丰度高的蛋白，也存在丰度极低的蛋白，而这些丰度极低的蛋白在质谱中鉴定不到是很正常的。22、WB没有看出明显变化，为什么还需要做修饰定量分析?答：(1) 首先要确定客户样品种类，比如酶类，微量变化对生物体本身都会有很大影响；& & & &(2) 同一样品不同处理存在修饰类型变化的可能。23、修饰性WB中经常出现低质量处没有条带的原因?答：(1) 进行SDS-PAGE，看低质量处的蛋白条带丰度如何，确保蛋白的量是足够的；& & & &(2) 胶的压缩分离效果不好，低质量蛋白本身易弥散，且泳动速度快，易跑出分离胶。24、WB某蛋白有条带，但是MS没检测到该蛋白。为什么?答：(1) WB是在蛋白水平的检测，MS是基于肽段水平的检测；一般来说免疫水平的检测灵敏度是高于质谱检测的；& & & &(2) WB某条带为分子量相近的一类蛋白，包含蛋白的丰度不同，有高有低；而质谱一般检测不到过低丰度蛋白；& & & &(3) 某蛋白可能数据库不全，导致MS后搜库检索不到；& & & &(4) 样品制备过程中可能存在个别肽段的丢失，导致蛋白的漏检；& & & &(5) 蛋白氨基酸序列中K或R过多或过少，导致胰酶切割形成的肽段太短或太长，而质谱有参数设置，切割肽段在7aa以下的，可信度就不高了。25、为什么组蛋白位点特异性抗体的WB中会出现杂带?答：通常情况下，组蛋白位点特异性抗体只会出现一个特定的阳性条带；但在极少数情况下，位点特异性抗体所识别的构象与较大分子量的部分序列不可避免的相近时，会出现杂带，但并不会影响检测的结果。同时，合理提高抗体的稀释比可以让杂带消失，也可以尝试降低曝光时间或将上样量进行调整。26、关于磷酸化蛋白western blot的建议?答：(1) 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解，否则即使有条带也会很浅，结果也不可信； & & & &(2) 一抗孵育时最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分，4度也可使一抗重复使用多次；二抗则室温1小时即可；
& & & &(3) 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商；& & & &(4) 最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证；如Cell signaling会建议用含5% BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5% non-fat milk的TBST；& & & &(5) 抗体的稀释倍数也要适当；不同的厂商也会有不同的要求；& & & &(6)&最好也要检测该样品中总蛋白的表达量；如使用phospho-p38抗体做完修饰后，我们会把相同的membrane做strip后再压p38，然后再strip一次，再压内标Actin。27、WB中孵育一抗前封闭的原理以及封闭液的选择?答：(1)&在电泳转膜后，膜上其它没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免非特异性结合；封闭就是降低一抗的非特异结合的概率，因为封闭液本身就是蛋白，封闭就相当于把那些太容易发生非特异结合的位点先给堵上了；过度的封闭导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度；不完全封闭又会导致最终背景增高或信噪比太低；& & & &(2) 封闭液一般用BSA或者脱脂牛奶很多人的经验是：脱脂牛奶封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会干扰的）。
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　　1）翻译后修饰，比如磷酸化，糖基化等，这些变化会增加蛋白的大小。
　　2）翻译后剪切，比如很多蛋白在合成的时候是作为前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式，比如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶前体。
　　3）剪切异构体，同一基因经选择性剪切可能产生不同大小的蛋白。&
　　4）相对电荷，氨基酸组成（带电荷与不带电荷）。
　　5）多聚体，比如蛋白二聚化。尽管强相互作用会导致大分子量条带的出现，但是通常还原条件会抑制这种情况发生。
　　众所周知的p53蛋白，其表观分子量是53kDa（这也是该蛋白名字的由来），但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。
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融合蛋白原核载体的构建与表达
第 14 卷 第 4 期 2013 年 8 月北华大学学报（ 自然科学版） JOUＲNAL OF BEIHUA UNIVEＲSITY（ Natural Science）Vol． 14 No． 4 Aug． 20134822 （ 2013 ）
文章编号： 1009-DOI： 10． 11713 / j． issn． ． 2013． 04． 010GSTMIG ， GSTIP10 融合蛋白 原核载体的构建与表达德吉央宗， 李 勇（ 西藏大学医学院， 西藏 拉萨 850000 ） 摘要： 目的 MIG， GSTIP10 融合蛋白原核载体的构建与表达 ． 方法 探讨 GST高压水动力尾静脉注射 pCMV-tag2B 空载质粒的 12 只小鼠为对照组， tag2BHBx 质粒的 12 只小鼠为观察组． 采用 Elisa 法检测 IFN注射 pCMVIP10 表达； 扩增 MIG， IP10 基因至 pET42a， γ 表达； 采用免疫组化法检测小鼠肝脏中 MIG， 构建载体后行 IPTG 诱导表达； 采用 PAGE 和 Western blot 法鉴定蛋白表达； 采用 GST 柱纯化表达蛋白。结果 对照组小鼠肝脏中无 MIG， IP10 表达， IP10 表达； 观察组小鼠肝脏中 IFN观察组小鼠肝脏中有 MIG， γ 表达升高 21． 4% ， 对照组降低 IP10 表达一致； MIG 基因条带为 330 bp， IP10 基因条带为 246 bp， 了 54． 1% ， 与小鼠肝脏中 MIG， 经重组质粒测 pET42a 空载 IPTG 诱导仅有 序模版检测， 并与 Blast 进行对比， 测序结果与目的基因一致； 未诱导组无蛋白表达， GST 表达（ 26 kD） ， pET42amMIG， pET42amIP10 重组质粒 IPTG 诱导有 mMIG， mIP10 表达； 25 ℃ 下， IPTG 质量 GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白含量最高； 上清经 15% SDSPAGE 检测可提 转速为 150 r / min， 浓度为 0． 2 mmol / L， 经 GST 柱纯化后可见融合蛋白条带 ． 结论 高目的蛋白纯度； 采用 Western blot 检测融合蛋白， 10 融合蛋白原核载体可成功构建， 具有高效表达特征， 为制备抗体提供了良好条件 ． MIG； GSTIP10 ； 融合蛋白； 原核载体； 构建与表达 关键词： GST中图分类号： Q78 文献标志码： A GSTMIG， GSTIP-Construction and Expression of GSTMIG， GSTIP10 Fusion Protein Protokaryon VectorDEKYLI Yangzom， LI Yong（ Medical School of Tibet University， Lasa 850000 ， China）Abstract： Objective To investigate the construction and expression of GSTMIG， GSTIP10 fusion protein tag2B ptotokaryon vector． Method 12 rats treated high pressure hydrodynamic tail vein injection of pCMVplasmid were taken as control group and 12 rats treated high pressure hydrodynamic tail vein injection of pCMVtag2B-HBx plasmid were taken as observation group． The expression of IFNγ was detected by ELISA method； the 10 genes were expression of MIG and IP10 in liver were detected by immunohistochemical method； MIG and IPamplified to pET42a． After the construction of vector， IPTG expression was induced； the protein expression was detected by PAGE and Western blot method； the expression protein was purified by GST column． Ｒesults The while MIG results showed that there was no expression of MIG and IP10 in the liver of mice in the control group， and IP10 expressions were found in the observation group． IFNγ expression in the liver was increased by 21． 4% in the observation group and that in the control group was reduced by 54． 1% ， which was in agreement0315 收稿日期： 2013作者简介： 德吉央宗（ 1971 － ） ， 女（ 藏族） ， 实验师， 主要从事生物化学及分子生物学研究； 通信作者： 李 勇（ 1976 － ） ， 男， 讲师， 主要从事生物化学及分子生物学研究．414北华大学学报（ 自然科学版）第 14 卷with MIG and IP10 expressions； MIG gene band was 330 bp， IP10 gene band was 246 bp， and it was verified that the gene sequence was consistent with that of the target gene after the recombinant plasmid sequencing template detection and through the comparison with Blast； There was no protein expression in the noninduced group， there was only GST （ 26 kD） expression induced by pET42a IPTG， mMIG expression induced by pET42amMIG， pET42amIP10 recombinant plasmid IPTG； The mass concentration of IPTG at 25 ℃ was 0． 2 mmol / L， and speed， the content of GSTMIG， GSTIP10 fusion protein was highest at 150r / m； The purity of target protein in the supernatant could be improved by 15% SDSPAGE and the fusion protein band could be seen with Western blot method after the fusion protein was purified by GST column． Conclusion GSTMIG， GSTIP10 fusion protein protokaryon vector can be successfully constructed， which has a characteristic of high efficient expression and can provide good conditions for the preparation of antibody． Key words： GSTMIG； GSTIP10 ； fusion protein； prokaryotic vector； construction and expression 趋化因子是机体内与肝素相结合的一种小分 可将周围的白细胞输送至机体的炎症部 子蛋白， 位， 趋化因子与相应的受体结合后可引导单核细胞 有效穿透机体， 并在机体获得性免疫应答过程中起 着重要作用［13 ］1． 3仪器超净工作台 （ 上海博迅实业有限公司医疗设 备厂） ； 高速电动匀浆器 （ 江苏金坛市仪美仪器公 司） ； 凝胶图像分析仪 （ 上海培清科技有限公司 ） ； 电泳 仪 （ 北 京 留 意 仪 器 厂 ） ； 细 胞 培 养 箱 （ 美 国 Hepa Fliter 公司） ； PCＲ 仪、 高速台式低温离心机、 紫外分 光 光 度 计 （ 德 国 Eppendorf 公 司 ） ； 酶 标 仪 （ 澳大利亚 Tecan 公司 ） ； 电热恒温水槽 （ 上海精宏 实验设备公司） ． 1． 4 方 法 tag2B 对照 组 高 压 水 动 力 尾 静 脉 注 射 pCMV空载质粒， 观察组高压水动力尾静脉注射 pCMVtag2BHBx 质粒： 称 15 μg 质粒溶于 PBS 中， 给予小 10 s 内将液体快速推入小鼠的 鼠尾部红外线加热， 4 d 后采用颈椎处理方法处死小鼠， 尾静脉， 行 PCＲ 检测， 确认存在 HBx 基因即可． 1． 4． 1 IP10 表达 免疫组化法检测小鼠肝脏中 MIG， 取小鼠肝组织后用 4% 多聚甲醛进行固定， 然． IFNγ 是 CX3C 家族中趋化因子［4 ］中的一员， 可有效诱导部分单核因子的合成表达， 10 基因的表达 在体内诱导 MIG 基因和 IP究［56 ］． 有研表明： 过继性 HBV 特异性基因转移至小鼠后， 会造成肝脏内趋化因子的大量生成， 进而诱发 MIG 和 IP10 的高效表达， 通过特异的抗原识别， MIG， 进一步激活肝脏非实质细胞． 为了探讨 GSTGSTIP10 融合蛋白原核载体的构建与表达， 此次 研究选取小鼠 24 只， 随机分为两组， 行高压水动力 tag2B 空载质粒和 pCMVtag2B尾静脉注射 pCMVMIG， HBx 质粒， 然后进行对比研究， 以期探讨 GSTGSTIP10 融合蛋白原核载体的构建与表达的关系．11． 1一般资料研究对象 周龄为 6 ～ 8 周的小鼠 24 只， 平均为 （ 7． 3 ±再依次放入二甲苯 后切片． 在 60 ℃ 下烤片过夜， 110 mL、 95% 乙醇 二甲苯 210 mL、 无水乙醇 10 mL、 10 mL、 80% 乙醇 10 mL、 75% 乙醇 10 mL、 水5 mL， 使用 50 μL 3% H2 O2 滴 片， 室温下湿盒内放置 15 min以灭活内源性酶． 将 800 mL 柠檬酸修复液 煮沸， 并将片子置于其中， 加热 10 min 后自然冷却 37 ℃ 下湿盒内 到室温． 将 50 μL 羊血清用于滴片， 10 抗 放置 30 min， 然后孵育一抗． 使用羊抗鼠 IP用 体单抗和兔抗鼠 MIG 抗体单抗（ 1 1 000 稀释） ， 量 50 μL， 在 4 ℃ 下湿盒内放置过夜， 使用 PBS 冲 5 min / 次， 洗 3 次， 然后孵育二抗． 使用驴抗兔和兔 抗羊二抗（ 1 1 000 稀释 ） ， 用量 50 μL， 在 37 ℃ 下 5 min / 次． 放置湿盒内 60 min， 使用 PBS 冲洗 3 次， B 液、 双蒸水 1 mL 与蛋白浓度测定试剂盒中 A 液、 C 液各 1 滴进行混合， 用量 50 μL， 显微镜下观察直0． 6 ） 周， 其中雌雄各 12 只， 购自四川省实验动物繁 育中心． 1． 2 材 料 pCMVtag2B 空载质粒与 pCMVtag2BHBx 质粒均通过 B 型超纯大量质粒提取试剂盒进行提取 （ 北京博大泰克科技有限公司 ） ； 限制性内切酶和 DNA 连 接 酶 （ Fermentas 公 司 ） ； DNA Maker， Taq Pfu MasterMix （ 北京天根生化科技有限 MasterMix， ＲIPA 裂解液、 公司） ； 胎牛血清、 蛋白浓度测定试剂 盒（ 江苏碧云天生物技术研究所 ） ； GST 蛋白纯化 试剂盒 （ Thermo 公司 ） ； IFNγElisa 试剂盒 （ BD 公 司） ； 蒸 馏 水 （ 娃 哈 哈 纯 净 水， 杭 州） ； 琼 脂 糖 （ Biowest 公司） ．第4 期MIG， GSTIP10 融合蛋白原核载体的构建与表达 德吉央宗， 等： GST-415到显色． 冲洗 10 min， 使用苏木素染色， 着色后冲洗 5 min， 然后进行脱 水， 一 次 放 入 75% 乙 醇 5 mL、 80% 乙醇5 mL、 95% 乙醇 5 mL、 无水乙醇 10 mL、 二 二甲苯 110 mL， 风干后可封片． 甲苯210 mL、 1． 4． 2 Elisa 法检测 IFNγ 表达 肝组织 0． 05 g 放置于 1 mL ＲIPA 裂解液中， 提 前加入 PMSF， 控制其浓度为 1 mmol， 然后匀浆， 冰 浴 30 min， 蛋白裂解后在 4 ℃ 下离心 10 min， 设定 转速为 12 000 r / min． 取上清液， 然后固定酶标条， 每个孔内加入 Elisa Diluent 50 μL， 然后加入稀释 好的标准液和检测样本， 震荡混匀后可封板， 在室 温下孵育 2 h． 准备好 Working Detector， 向孔内加入 洗涤液 300 μL， 甩干清洗 5 次， 最后用吸水纸吸 干， 加入配好的 Working Detector 100 μL， 封板后在 室温下孵育 1 h， 然后洗 板 7 次， 控制间隔时间在 1 min． 加入 TMBOneStep Substrate Ｒeagent 100 μL， 在 室 温 下 避 光 孵 育 30 min， 然 后 加 入 Stop Solution 50 μL， 在 30 min 的终止时间内进行酶标仪吸光度数 值读取， 设定波长为 450 nm． 1． 4． 3 在不同时间点下 PAGE 和 Western blot 法 鉴定蛋白表达 接种重组菌 4 mL 到 4 mL 含有100 μg / mL那霉 37 ℃ 下250 r / min 震荡过夜． 取 素的 LB 培养液内， 50 μL 过夜液接种到 5 mL 含有 100 μg / mL 卡那霉 37 ℃ 下 250 r / min 震荡 3． 5 h． 素的 LB 培养液内， 取 1 mL 未诱导的培养液额外操作， 剩余培养液加 IPTG ， 1 mmol / L ， 37 ℃ 控制质量浓度到 下 250 r / min 4， 5， 10 h） 取 1 mL 样品， 震荡， 选择不同时间点（ 3 ， 12 000 r / min 离心1 min， 将沉淀悬浮于 80 μL PBS 12 000 r / min 离 液中， 加缓冲液20 μL， 沸浴 10 min， 心 1 min， 放冰上降温， 到室温后加入 15 μL 15% SDSPAGE ， 在 100 V 下进行电泳， 直到溴酚蓝迁移 到分离胶质底部， 行考马斯亮蓝染色， 观察条带． 1． 4． 4 GST 柱纯化表达蛋白 将 GST 柱放置室温平衡， 使用 10 mL PBS 平衡 凝胶， 控制流速 1 mL / min． 使用 0． 45 μm 滤膜进行 过滤， 然后上样， 同时控制流速 1 mL / min， 收集流 出物后检测 A280 值． 使用10 mL PBS 冲洗凝胶 3 次， 控制流 速 1 mL / min， 检 测 流 出 物 的 A280 值， 直到 A280 值到 0 为止． 加入 2 mL 洗脱液， 25 ℃ 在 下孵育 10 min， 收集流出物， 重复洗脱蛋白 3 次． 使用 2 mL 再生液 1 冲洗凝胶， 控 制 流 速 1 mL / min， 再使用 2 mL再生液 2 冲洗凝胶， 控制流速 1 mL / min， 重复 冲洗 3 次， 使用 5 mL PBS 平 衡 凝 胶， 纯化后使用 Western blot 检测 GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白．22． 1结果IP10 表达 免疫组化法检测小鼠肝脏中 MIG， IP10 表达 免疫组化法检测小鼠肝脏中 MIG，结果分析显示（ 见图 1 ～ 4 ） ： 40 倍镜下观察对照组 IP10 抗体未见棕黄色染色， 小鼠肝脏中 MIG 抗体、 无 MIG， IP10 表达， IP10 观察组小鼠肝脏中 MIG 抗体、 IP10 表达． 抗体呈棕黄色阳性染色， 有 MIG，Fig． 1图 1 对照组小鼠肝脏中 MIG 表达 The expression of MIG in the liver of mice in control group图 2 观察组小鼠肝脏中 MIG 表达 Fig． 2 The expression of MIG in the liver of mice in observation group10 表达 图 3 对照组小鼠肝脏中 IPFig． 3 The expression of IP10 in the liver of mice in control group416北华大学学报（ 自然科学版）第 14 卷pET42a 空载 IPTG 诱导仅有 GST 表达 蛋白表达， （ 26 kD） ， pET42amMIG， pET42amIP10 重组质粒 IPTG 诱 导 有 mMIG 表 达 （ 38 kD ） 、 mIP10 表 达 （ 35 kD） ．10 表达 图 4 观察组小鼠肝脏中 IPFig． 4 The expression of IP10 in the liver of mice in observation group2． 2Elisa 法检测小鼠肝脏中 IFNγ 表达MIG 融合蛋白在不同时间点诱导表达 图 7 GSTFig． 7 The expression of GSTMIG fusion protein at different time pointsElisa 法检测小鼠肝脏中 IFNγ 表达结果中， 观察组小鼠肝脏中 IFNγ 表达升高 21． 4% ， 对照 组小鼠肝脏中 IFNγ 表达降低了 54． 1% ， 与小鼠 IP10 表达一致． 肝脏中 MIG， 2． 3 2． 3． 1 pET42aMIG， pET42aIP10 载体构建和表达IP10 融合蛋白在不同时间点诱导表达 图 8 GSTFig． 8 The expression of GSTIP10 fusion protein at different time pointsMIG， IP10 基因扩增结果 MIG， IP10 基因扩增结果分析显示 （ 见图 5 ～ 6 ） ： MIG 基 因 条 带 为 330 bp， IP10 基 因 条 带 为2． 3． 2． 2GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白在不同诱246 bp， 经重组质粒测序模版检测， 与 Blast 进行对 IP10 表 比， 测序结果与目的基因一致， 表明 MIG， 达载体可成功构建．导条件下表达结果 GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白在不同诱导条 件下表达结果 分 析 显 示 （ 见 图 9 ～ 10 ） ： 25 ℃ 下， IPTG 浓度为 0． 2 mmol / L， GST转速为 150 r / min， GSTIP10 融合蛋白含量 最 高． 上 清 经 15% MIG， SDSPAGE 检测可提高目的蛋白纯度．MIG 载体 PCＲ 电泳结果 图 5 pET42aFig． 5 pET42aMIG vector PCＲ electrophoresis results MIG 融合蛋白在不同诱导条件下表达 图 9 GSTFig． 9 The expression of GSTMIG fusion protein under different induction conditionsFig． 6IP10 载体 PCＲ 电泳结果 图 6 pET42apET42aIP10 vector PCＲ electrophoresis results IP10 融合蛋白在不同诱导条件下表达 图 10 GSTFig． 10 The expression of GSTIP10 fusion protein under different induction conditions2． 3． 2pET42aMIG， pET42aIP10 表达结果 2． 3． 2． 1 GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白在不同时 间点诱导表达结果 GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白在不同时间点 诱导表达结果分析显示 （ 见图 7 ～ 8 ） ： 未诱导组无2． 3． 2． 3GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白鉴定结果 GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白鉴定结果分析第4 期MIG， GSTIP10 融合蛋白原核载体的构建与表达 德吉央宗， 等： GST-417显示（ 见图 11 ） ： 采用 Western blot 检测融合蛋白， 经 GST 柱纯化后可见条带．表达（ 35 kD） ， 说明扩增基因在测序检验后证实确 已克隆到 pET42a， 表明原核的载体构建非常成功． 25 ℃ 下，IPTG 浓 度 为 0． 2 mmol / L，转 速 为 150 r / min， GSTMIG， GSTIP10 融 合 蛋 白 含 量 最 PAGE 检测可提高目的蛋白纯 高， 上清经 15% SDS度． 采用 Western blot 检测融合蛋白， 经 GST 柱纯 化后可见融合蛋白条带， 说明原核的表达载体经转MIG， GSTIP10 融合蛋白鉴定结果 图 11 GSTFig． 11 The identification results of GSTMIG， GSTIP10 fusion protein化 IPTG 有效诱导后经 GST 柱可得到高纯度的融 合蛋白， 效果较好． GSTMIG， GSTIP10 融合蛋白原核 综上所述， 载体成功构建， 具有高效表达特征， 可为制备抗体 提供良好条件． 参考文献：［ 1］ 谭玉明， 钟丽， 陶晓杰， 等． 卒中后抑郁患者外周血单 核细胞趋化因子受体 1 、 锌指蛋白 A20 的表达及甲状 ． 中 国 新 药 杂 志， 2012 ， 21 （ 22 ） ： 腺功能 的 改 变［J］ ． ［ 2］ 李定良， 巫 相 宏． 急 性 冠 脉 综 合 征 患 者 趋 化 因 子 CXCL16 与 GＲACE 积 分 的 相 关 性 及 临 床 意 义［J］ ． 2011 ， 17 （ 3 ） ： 1921． 当代医学， ［ 3］ 林青， 王春平． 调节活化正常 T 细胞表达与分泌趋化因 J］ ． 中国实用妇科与产科杂志， 子与子宫内膜异位症［ 2012 ， 28 （ 7 ） ： 558560． ［ 4］ 李敏， 熊英， 母得志， 等． 机械通气前后早产儿动脉血 10 的 变 化［J］ ． 中 国 当 代 儿 科 杂 志， 中 IFNγ 和 IP2012 ， 14 （ 7 ） ： 496498． ［ 5］ 范梦柏， IFN王秀娥， 宋承平， 等． 细胞因子 TN Fα、 γ、 IP10 对结核性胸腔积液诊断价值的研究［ J］ ． 中国防 2012 ， 34 （ 8 ） ： 550552． 痨杂志， ［ 6］ 曹京燕， 10 和 李呼伦， 孙博， 等． 人缺血脑组织中 IPIFN． 中 国 免 疫 学 杂 志， 2006 ， 22 （ 5 ） ： γ 的 表 达［J］ 422425． ［ 7］ 王健， 赵金红， 江水清， 等． 丙型肝炎病毒慢性感染与 IL8、 IP10、 Mig 表达相关性研究 ［ J］ ． 第三军医大学学报， 2006 ， 28 （ 13 ） ： ． ［ 8］ 赵金红， 王健， 江水清， 等． 慢性乙型肝炎患者外周血 10 和 Mig 表达及其与干扰 单个核细胞中趋化因子 IP． 中 国 实 用 内 科 杂 志， 2007 ， 素治疗 的 相 互 关 系［J］ 27 （ 4 ） ： 285288． ［ 9］ 丁艳， 贾德胜， 王宝香， 等． γ 干扰素诱导单核因子和诱 ． 导蛋白 10 在婴儿巨细胞病毒肝炎相关性研究［J］ 2008 ， 23 （ 7 ） ： 523525． 中华实用儿科杂志， ［ 10］ 王洪艳， 龚守良， 齐亚莉， 等． 骨髓间充质干细胞对放 J］ ． 北华大学学报： 自然 射性胸腺损伤的修复作用［ 2011 ， 12 （ 3 ） ： 300303． 科学版，3讨论tag2BHBx 质 高压水动力尾静脉注射 pCMV［7 ］ 粒是目前用于检测基因变化的有效方法之一 ， 通过开展有效基因微阵列分析可以得到不同功能 的基因， 可为相关疾病的诊断和治疗提供有效的科［8 ］ 学依据 ． HBx 转基因能够引发体内趋化因子的 改变， 在机体内的各种炎症反应过程中起着重要作用， 通过荧光定量 PCＲ 检测可以掌握机体内的趋 化因子变 化 程 度 和 相 应 基 因 的 表 达 水 平 改 变 情 ［9 ］ IP10 基因 况 ． HBx 基因可直接诱导肝细胞 MIG， 表达的异常升高， 而这两个基因在白细胞迁移与肝 病发展过程中均起着重要作用． 机体内通过大量分 泌 IFNγ 可有效刺激肝细胞与肝非实质性细胞加 IP10 基因， 速分泌 MIG， 同时机体内 IFNγ 还可阻 同时对 断趋化因子减少单核淋巴细胞聚集到肝脏 ， ［10 ］ CTLs 的抗病毒能力也不会造成影响 ． 因而可将 MIG， IP10 作为此次研究的靶点， 进而构建 MIG， IP10 的原核表达载体． IP本次研究中， 对照组小鼠肝脏中 MIG 抗体、 10 抗体未见棕黄色染色， IP10 表达， 无 MIG， 观察 IP10 抗体呈棕黄色阳性 组小鼠肝脏中 MIG 抗体、 IP10 表达， IP10 蛋白表 染色， 有 MIG， 说明 MIG， 达与基因保持了良好的一致性． 观察组小鼠肝脏中 IFNγ 表达升高 21． 4% ， 对照组小鼠肝脏中 IFNγ IP10 表 表达降低了 54． 1% ， 与小鼠肝脏中 MIG， 达保持了高度的一致性． 其中观察组 IFNγ 表达明 显升高， 表明小鼠肝组织在 HBx 的诱导下可引起 MIG， IP10 表达明显升高． MIG 基因条带为330 bp， IP10 基因条带为 246 bp， 经重组质粒测序模版检 测， 与 Blast 进行对比， 测序结果与目的基因一致． pET42a 空载 IPTG 诱导仅有 未诱导组无蛋白表达， GST 表 达 （ 26 kD ） ， pET42amMIG， pET42amIP10 mIP10 重组质粒 IPTG 诱导有 mMIG 表达（ 38 kD） 、【责任编辑: 陈丽华】
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