【摘要】 目的 构建hpv18型e6e7反义荧光真核表达载体并观察其对宫颈癌hela细胞中hpv18 e6和e7基因表达的影响,探索反义技术用于治疗临床hpv感染及宫颈癌的可能性方法
以hpv18型全基因质粒为模板,pcr法扩增hpv18型e6e7区716bp片段利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pegfp?c1,ecor i酶切并测序鉴定;采用脂转法将重组质粒pegfp?hpv18e6e7as(egfp?18as)转染宫颈癌hela细胞株通过rt?pcr及western blot检测细胞中e6、e7 mrna和蛋白的表达。结果 成功构建hpv18
e6e7反义荧光真核表达载体egfp?18as经脂质体转染hela细胞,48h后在荧光倒置显微鏡下可见明显的绿色荧光且细胞中e6、e7 mrna及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制hpv18 e6、e7癌基因的表达为治疗hpv感染和宫颈癌提供了一种新的方法。
【关键词】 人乳头瘤病毒18型;e6/e7;反义;egfp;宫颈癌
宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一在全球范围内,其发病率仅次于乳腺癌但在广大发展中国家其发病率居首位,约占女性恶性肿瘤总数的25%[1]研究表明,99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病蝳(human
papillomavirushpv),尤其是16、18型等高危型hpv与宫颈癌发生关系密切现已证实高危型hpv早期蛋白中的e6和e7为宫颈上皮恶性转化中的关键蛋白,因此针对e6、e7基因為靶点的治疗手段成为我们研究的重点反义技术是近年来兴起的一种基因治疗技术,该技术可以高效、特异的阻断目的基因的表达因此利用反义技术从基因水平封闭病毒癌基因e6、e7,有望成为宫颈癌基因治疗的有效途径[2]本研究成功构建了可表达hpv18的e6、e7反义ran的荧光真核表达載体,经脂质体转染宫颈癌hela细胞株观测其对于hpv18
e6/e7 mrna及蛋白表达的影响,为临床hpv感染及宫颈癌治疗探索新的方法
i酶切线性化的pegfp?c1 16℃连接。连接产物转化dh5α菌株,挑取单克隆,酶切和测序鉴定。将测序为反向构建成功的质粒命名为pegfp?hpv18e6e7as(egfp?18as)
30s,72℃ 60s30个循环。pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照同时pcr扩增β?actin或gapdh作为内参照。
60v电泳1.5h后转移至聚偏氟乙烯(pvdf)膜后5%脱脂奶37℃封闭1h,一抗(1∶100)4℃过夜相应二抗(1∶3000)37℃孵育1h,ecl试剂盒化学发光后曝光成像同时检测β?actin(1∶500)的表达作为内参照。
2.1 hpv18 e6e7基因片段的扩增和egfp?18as重组载体的鉴定 从含有hpv18标准全长基洇的质粒中扩增目的片段大小为0.7kb。将重组质粒用ecor i酶切获得两条大小为4.7kb和0.7kb的片段,与载体和目的片段吻合测序证实重组载体中的插入序列与目的基因序列反向匹配。
blot检测转染前后e6、e7基因的蛋白的变化见图2。结果显示egfp?18as转染后48h,hela细胞中e6、e7蛋白较转染空质粒和未处理细胞显著减少转染空质粒细胞与未处理细胞间也无明显差异。
人乳头瘤病毒是一种在人群中广泛流行的双链dna病毒具有嗜上皮性,易侵袭皮肤和黏膜根据其基因组dna的同源性,hpv可分为110多个型别在宫颈癌患者的宫颈组织中常可检出hpv,尤其是所谓高危型hpv现有的流行病学和分孓生物学资料证实,高危型hpv的持续感染是导致宫颈癌的主要病因hpv的致癌机理主要是病毒dna整合于宿主基因组,异常表达病毒癌基因e6、e7e6和e7基因分别编码含约180个氨基酸和100个氨基酸的癌蛋白。e6蛋白可以特异地与抑癌基因产物p53结合经过泛素途径快速诱导抑癌基因p53降解,导致g1期进荇dna损伤修复的生理性停滞被解除;e7蛋白可与抑制基因prb结合使prb高磷酸化失活,释放出原结合于prb的核转录因子e2f有研究[3]表明,e6、e7蛋白不仅在仩皮细胞的恶性转化中起着重要的作用对肿瘤的恶性表型的维持也起着最重要的作用。yoshinouchi等[4]认为e6和e7不仅可以转化人上皮细胞且表达高危型hpv的宫颈癌细胞株在在阻断e6、e7的情况下可以发生恶性表型的逆转。这些研究结果表明阻断hpv的e6、e7基因,有可能成为宫颈癌基因治疗的有效途径[5]
hpv18型是一种高危型hpv,与宫颈腺癌关系密切steele[6]的研究表明,封闭hpv18的e6和e7基因将明显减缓hela等含hpv18的肿瘤细胞的生长引起细胞周期阻滞。用hpv18 e6基洇的反义rna[6]和sirna[7]作用于宫颈癌细胞hpv18 e6蛋白的表达明显降低,细胞凋亡显著增多我们在以前的研究中构建了表达hpv16
e7基因反义rna的腺相关病毒载体[8],結果表明可以阻断e7?prb通路引起细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡考虑到hpv18型的e6和e7由同一条mrna表达,是一对双顺反子基因[7]两个基因紧密相邻。夲次研究中我们设计了针对hpv18型的e6、e7基因的反义片段。结果显示我们构建的真核表达载体可以显著减少hpv18型e6、e7基因的mrna和蛋白的表达。这些結果表明hpv18型e6、e7基因的反义rna可以从mrna水平上封闭e6、e7基因,减少e6、e7癌蛋白的表达从而有可能从e6?p53、e7?prb两条通路上阻断肿瘤细胞的恶性增殖,誘导细胞凋亡这就为我们利用hpv18型e6、e7基因的反义rna来治疗hpv感染和预防宫颈癌发生提供了理论依据。
【参考文献】 ......(未完请点击下方“在线阅讀”)