测序文库构建，如何知道自己的fragmentpageradapterr有没

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-06-30 04:48 标签： basequickadapter
测序入门-常见文库在SAV中的碱基分布图（illumina）
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如何利用Illumina Sequencing Analysis Viewer查看和判定测序中常见的问题（一）
很多做过二代测序或者称作NGS测序的朋友都接触过illumina测序仪，诸如Hiseq系列：HiseqX,Hiseq,老的机型如Hiseq00；Nextseq 500/500;MMiniseq等。一般问题判定是否存在和存在的严重性可以通过Control software或者SAV（Sequencing Analysis Viewer）来确定和大致的进行分析，今天我们先来介绍下常见文库在SAV的碱基分布图是怎样的。
SAV(Sequencing Analysis Viewer软件和软件使用说明可在中查看和下载，这里就不再赘述。
当我们一张芯片或单独的每个lane上机的文库类型单一，我们就可以通过%Base去大致判断你上机的样本是否符合本文库该有的特征，以下结果和图片均为单一文库在一个lane或者一张芯片的测序结果。
（一）Phix
按照illumina惯例，每台机器在安装调试结束或者过程中需要用phix做一次Validation验证机器是否能正常符合预期的工作，也是大家在用机器时候见到的第一个SAV。Phix是一种寄生于大肠杆菌的噬菌体，其核酸为长度5836bases单链环状DNA,GC含量为44.7%，且有碱基偏好，（+）链T碱基含量高于A碱基。Phix总共经历了3个版本，2013年3月以后的phix V3 文库长度约500-525bp,插入片段约375-400bp，没有index，也没有index sequencing primer结合位置。
横坐标为测序cycle数，纵坐标为碱基百分比，右上角为每种颜色代表的碱基。
1.从图中可以看出Read1 A碱基含量约30%，T碱基稍少，约27-28%，C和G碱基含量一致，约22%-23%左右，Read2由于导链，测到其互补链，A,T碱基分布颠倒，CG碱基含量不变。
2.测序并没有测index，如果测了结果会是怎么样？大家可以发挥下想象会有什么结果？
（二）全基因组文库
人类全基因组文库整体为碱基平衡文库，GC含量约占38%，由于建库过程中的扩增酶的偏好等原因，实际在SAV中显示的结果如（图二）
从上图可以看出碱基分布GC约占40-44%，后期有一定的变化，但是基本A=T,C=G；图中没有展现的是测序读长为2*150，没有明显的波动。但是在Read2的尾部发现有部分GC分离。具体的原因可能无从考究，可能牵扯到算法、试剂、仪器很多因素。但是基因这种情况均发生在测序Read1和Read2的尾部，所以怀疑是在测序过程中由于信号衰减，很多质量较差或信号较弱的碱基被误判导致碱基分布分离。有效的解决方法就是测序完成后去除质量较差的数据，可以截短或者将整条reads去除。
（三）小文库
这里的小文库是指插入片段较小，但是由于读长较长显示出来的测序结果。以smallRNA和Adapter dimer为例。如下图（三）
&&对illumina文库了解较深刻的朋友一定知道，Read1，Read2前面是测得是插入片段，如果继续测得话将会测到将近60bp左右的接头位置，再到后面是一串长约10-30bp的poly A，再往下就是flowcell基质了，也就是没了。所以当测到smallRNA时，先是长约20-30bp的insert，然后是约60bp的接头，如果接头中含有多种index，则会在中后段有6-8bp碱基平衡区，然后再是读出来一串A碱基上扬，后面就是全部黑色一片，读出来的碱基分布也是不真实的。如果是接头二聚体则同理。
（四）甲基化文库
甲基化文库是将C转化为U，然后通过扩增变成了T，所以可以看到如图四的结果。
先是测到的C碱基比例极低（具体比例随建库方法有一定的浮动），T碱基比例极高。测到Read2的时候由于导链，测到的为其互补链，所以T碱基变成了A碱基，其他碱基也发生了颠换。
（五）其他文库
除此之外还有其他类型的文库如酶切文库RAD（图五）、RRAD 、Nextra文库等。由于特定方法酶切导致在一段或两端有特定的碱基不平衡。也有碱基非常均衡的外显子文库（图六）
当然很多结果都需要根据文库质检结果和当前测序的lane中混样文库类型和测序读长等因素综合考虑。以上内容仅限于参考学习和讨论。如有问题，欢迎大家留言讨论。Looking for more of the latest headlines on LinkedIn?二代测序文库构建流程_中华文本库
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