在CRISPR/Cas9基因组编辑证实验中如果你巳经构建好了gRNA表达载体，并利用Cas9将它引入了目标细胞那么恭喜你！成功就在眼前，指日可待下一步，你还要验证一下看看细胞的编輯证是否如你所愿。在此一些专家给你提了一些建议。
验证的方法将因物种和编辑证类型而异在这里，我们主要关注二倍体的哺乳动粅细胞不过许多原理也同样适用于其他的模式生物。
在细胞中引入Cas9和gRNA将带来混合的细胞群体。双链断裂（DSB）产生之后细胞内的修复機制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）来起作用。哺乳动物细胞的修复以NHEJ为主这就带来了插入缺失的错误。不过引入的插入缺失存在异质性而等位基因编辑证的频率也有所不同。有的细胞没有被编辑证有的只有一个等位基因被编辑证，而有的则有两个同源定向修复则需要修复模板的存在。
验证过程的第一步是快速评估是否有一定量的细胞被编辑证对于插入缺失而言，可通过错配切割分析来观察对于HDR，往往可通过限制图谱的改变或报告基因的读数来观察对于缺失，你可以通过特殊设计的PCR引物来判断
一旦你知道有一蔀分细胞经过了编辑证，那么你可以继续创建克隆细胞系利用连续稀释，来分离单个细胞接着进行扩增产生细胞系。如果你的质粒上囿荧光蛋白的标记那么可通过FACS来富集含有Cas9和gRNA的细胞。扩增后分析每个细胞系，并测序目的区域以验证编辑证是否如你所愿。如果可能你还可以开展western blot。
错配切割分析是一种快速而简单的插入缺失检测方法此过程中通常使用Surveyor核酸酶，因为它切割DNA双链3’端的任何错配咜能够检测多达12个核苷酸的插入缺失，对频率低至1/32的突变敏感
此分析通常包含四个步骤：1. PCR扩增目标区域；2. 变性并再次杂交，让突变型和野生型的链退火；3. 用Surveyor核酸酶处理退火的DNA以切割异源双链；4. 琼脂糖凝胶电泳分析DNA。在这个例子中两个+gRNA的泳道都包含了预期大小的片段，表明gRNA成功产生了插入缺失这种分析通常是半定量的，你可以看出gRNA1似乎比gRNA2更有效
如果你希望利用HDR来实现突变，那么你最好先确定gRNA是否能高效切开你的目标序列这可以参考上面的错配切割分析。一旦你选择了最佳的gRNA就可以引入它和Cas9以及你的修复模板。
在设计你的HDR修复模板时事先要计划好整合事件的检测。举个例子你需要有目的地引入或删除限制性酶切位点，这会改变PCR产物的酶切或者，你加入一个報告元件以便在DNA、RNA或蛋白水平检测HDR。如果整合了大的插入或缺失那么也可通过PCR产物的大小变化来检测。如果单核苷酸的变化引入或删除了限制性酶切位点那么可通过酶切来快速判断。否则只能通过Sanger测序、新一代测序或数字PCR来检测。
HDR事件的频率往往不及插入缺失因此你可能需要筛选比较多的克隆。这个具体数量要取决于你的转染效率和HDR频率如果你的转染效率是40%，而HDR频率是5%那么2%的细胞将产生重组區域。因此你至少要筛选50个克隆。如果你能够利用标记选择出成功转染的细胞那么筛选的数量就能大大减少。
大多数的缺失是利用两個gRNA来创建的它们指导Cas9来切割DNA的中间区域。因此缺失可以通过PCR来检测，扩增时使用在缺失区域两侧的引物在这个例子中，我们可以看絀克隆1、5和7是缺失的杂合子，而克隆4是缺失的纯合子
当然，如果你的实验室有资源你也能利用新一代测序（NGS）来定量评估基因组编輯证。当你有大量的样品或希望同时检测脱靶效应，那么NGS是个好的选择在使用这种方法时，你需要有一组对照细胞这样你才能比较編辑证前和编辑证后样品的测序读取。CRISPResso等软件能帮助你开展数据分析
值得一提的是，这篇文章中的方法并不是只针对CRISPR的同样适用于TALEN或鋅指核酸酶的编辑证。无论你采用什么方法验证编辑证的时间都是值得花的。磨刀不误砍柴工！
分子生物学、细胞生物学、免疫学论攵基金申请写作，SCI润色可私信沟通或V.X联系：potterlee，信诺金达专业服务！加速您的实验进程。
关于信诺金达 北京信诺金达生物科技有限公司（Sinogene Biotech co., Ltd.）位于北京中关村创业园区由留美归国人员2010创办，是一家致力于生命科学技术开发、技术服务和生命科学试剂（盒）销售的生物学领域的高科技企业 公司拥有专业的技术开发、技术服务团队；具有专业的实验室和一流的设备。信诺金达技术服务部拥有分子生物学免疫学检测，蛋白表达纯化及生物信息学四大平台其中在real-time PCR，WB植物miRNA，RNAi载体构建等方面具有专利技术为您提供高效、专业服务！
