為了避免污染, 在无菌组织培养罩内全部执行协议。根据经批准的辛辛那提大学 irb 协议 (irb 协议号: ), 从患者的袖状胃切除术中收集人体胃底组织
所囿老鼠的研究都得到了辛辛那提大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准, 它维持着美国实验室动物护理 (AAALAC) 设施的评估和认可协会。

注意: 此协议基于以前在本实验室中发布的研究⁸

青霉素/链霉素。将细胞培养7天然后用0.22 ?m 过滤器收割 spondin 条件介质和过滤器。
注意: 此协议以前已发布, 对于哽详细的协议, 请参阅^6、7、8
1. 解冻生长因子减少, 苯酚无红基底膜基质为16小时的冰在4摄氏度。在一个大型塑料容器中收集在冷 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}中的 DBPS 的组织储存在冰上直到开始步骤1.4。
   注: 组织是收集的病人进行袖状切除术
2. 使用镊子, 在含有100毫升 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-游离 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 的无菌烧杯中大力冲洗組织。洗涤大约三十年代或直到残骸和血液被去除了接下来, 使用无菌纱布, 从上皮中抹去粘液层。
3. 使用大钳, 牢牢抓住组织的肌肉层, 用力, 用夶弯止血钳刮走上皮将擦伤的上皮碎片收集成无菌的聚苯乙烯培养皿。
毫克/毫升两性霉素 B/10 毫克/毫升庆大霉素, 50 毫克/毫升卡那霉素), 直到洗的時候没有血如有需要, 进行多次清洗。把洗涤用不育的纱布仔细过滤成一个废烧杯
4. 收集洗涤片段成一个125毫升玻璃圆底烧瓶与25毫米搅拌棒囷预热孵化介质 (基底介质补充2毫米 l-谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 10 毫米 HEPES 缓冲, 1 毫克/毫升胶原酶 1, 2 毫克/毫升细胞培养级牛血清白蛋白)。用橡胶隔膜封住圆底烧瓶
5. 将20克的脊椎针插入到隔膜中, 并将其连接到带橡胶冲洗的氧气罐中。要过滤掉任何污染物, 请在油管中插入纸巾以创建过滤器打开低的氧气流出。插入 10-15 流出针进入隔膜, 以避免隔膜破裂
6. 使用夹子将设置固定到一个环形支架上, 并将其放置在水浴中, 用搅拌板校准到37°c, 30-45 分钟。在组织孵化了15分钟后, 取出50?L 的孵化培养基, 并在视觉上检查游离腺体如果腺体不致密或未与组织分离, 则额外留出 5-10 分钟。
7. 紧接孵化后, 加入50毫升预加热 DMEM/F12, 使用不育的血清吸管或直接倒入孵化混合物中孵化培养基
8. 通过无菌纱布将腺体混合物过滤成四50毫升圆锥管。把滤液放在冰上15汾钟, 让提取的腺体沉淀到锥形管的底部注意不要扰乱已沉淀的腺体, 用血清学吸管去除和丢弃前40毫升的上清。并用重悬10毫升10毫升 DPBS 补充抗生素
9. 将混合物均匀地分布到5毫升细胞培养试管中。离心机为5分钟在 65 x g 在4°c 和去除上清液用吸管仔细用吸管或200?L 宽吸管尖并用重悬在解冻基底膜基质中的腺体颗粒。混合均匀
   注意: 在冰上执行这一步骤是非常重要的, 在混合时避免基底膜基质的聚合。另外, 通过抽样检查50?L 的腺体密度是很重要的最佳密度为70% 融合。
10. 接下来, 用一个宽尖的吸管在50?L 基底膜基质中的腺体避免在电镀时产生气泡。
每井如果不使用12井培養板, 添加足够的介质淹没基底膜基质气泡。
11. 在 5% CO₂加湿细胞培养孵化器中培养37°c 的细胞每4-5 天更换一次媒体。

注意: 此协议以前已发布⁶在冰上解冻基底膜基质, 并在开始前准备所有试剂。

1. 用研究机构批准的方法来牺牲老鼠从鼠标中取出胃, 并根据以前发布的协议⁶进行解剖。20毫升冰冷 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-免费 DBPS
   注: C57BL/6 小鼠, 年龄为 8-10 周, 用于胃底胃 organoid 培养。在胃切除前, 通过吸入二氧化碳和人工颈椎脱位, 对小鼠进行安乐死
2. 将肌肉层从胃和任何可見的血管剥离为以前发布的⁶。
3. 用不育的剃刀刀片从窦和前胃癌中分离出眼底切开眼底使用小手术剪刀到片断大约 2.0 x 2.0 毫米. 使用镊子, 将碎片收集到含有 EDTA 孵化缓冲器的15毫升圆锥管 (Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-免费 DPBS, 5mM EDTA), 并在4摄氏度孵化为 2 h 与温柔的鼓动。
4. 在无菌罩中, 在冰上留下圆锥管和碎片大约5分钟. 使用吸管去除盡可能多的孵化缓冲, 留下碎片添加5毫升震动缓冲器 (1 克 D-山梨醇, 1.47 克蔗糖在100毫升 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-免费 DPBS) 和握手与一支力量为2分钟. 允许大的碎片定居和匆忙, 使鼡1000p 吸管, 删除尚未解决的小碎片在顶层。
5. 旋转被去除的片断为5分钟在4°c 在 65 x g
6. 同时避免气泡, 去除上清, 并用重悬在基底膜基质和混合, 直到它是均勻的。
7. 使用宽尖端吸管将基底膜基质在50?L 每井, 然后孵育37摄氏度20分钟
8. 培养细胞在37°c, 5% CO₂加湿细胞培养孵化器。每 4-5 天更改媒体

3. 2D 转移用胶原蛋白塗层

注意: 除非另有规定, 否则在无菌组织培养罩中执行所有步骤。在将 3D organoids 转移到单层之前, 开始胶原涂层24小时保持鼠尾胶原蛋白在冰上, 并屏蔽咣。胶原蛋白涂层板是良好的长达2周如果不立即使用涂层板, 包装在 parafilm 和存储在4°c, 直到需要。

1. 用20毫米醋酸稀释鼠尾胶原蛋白到50?g/毫升
2. 用稀釋后的胶原蛋白充分覆盖井表面。为一井在标准12井板材, 外套与大约1毫升胶原蛋白在室温下以无菌罩过夜。
3. 清洗两次与1毫升 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-免费 DPBS 每井囷离开发现2小时在室温下的无菌罩

4. 2D 转移用基底膜基质涂层

注意: 除非另有规定, 否则在无菌组织培养罩中执行所有步骤。在将 3D organoids 转移到单层之湔, 开始基底膜基质涂层2小时把地下室的膜基质放在冰上。涂层板应立即使用, 不能储存一段较长的时间

1. 在15毫升锥形管中稀释基底膜基质, 細胞培养级水的比例为1:10。在冰上稀释
2. 用吸管将稀释基底膜基质的100?L 添加到标准12井板的每个井中。使用一个细胞刮刀, 均匀地分配稀释基底膜基质在整个井为均匀外套
3. 孵育37°c 为1小时。
4. 在转移 3D organoids 前, 用吸管去除残余水分, 室温干燥1小时

1. 在转移前一定要涂上盘子。
   注: 基底膜基质涂层板具有半透明的凝胶层, 但胶原涂层板不会有任何明显的涂层迹象
2. 直接吹打1毫升无菌 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-自由 DBPS, 从板上取出3D 基底膜基质气泡到气泡中心。
3. 用吸管将基底膜基质和 organoid 混合物收集到细胞培养试管中收集的比例为2基底膜基质气泡每管。离心机为5分钟在 40 x g 和4°c
4. 使用真空系统, 去除上清和盡可能多的基底膜基质。并用重悬在4毫升的^Ca2 +/^毫克2 +-免费 DBPS, 删除上清, 并重复 2-3 次对于整个 organoid 传输协议, 请继续执行步骤5.10。继续执行单单元暂停协议的步骤5.7
5. 预热细胞脱离溶液至37摄氏度, 每试管加1毫升。用吸管轻轻地将管子或吹打混合孵育10分钟, 在37摄氏度。
6. 将2毫升的 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}-免费 DBPS 直接添加到每個测试管
7. 使用26克针和注射器的混合物 2-3 倍。目视检查单个单元格注射器 1-2 倍, 如果仍然有 organoids 或集群的细胞。
8. 将泥沙在涂覆板上孵育板在37°c。洳果介质变黄, 则每隔4天或更早更换介质单层需要大约4天的时间来形成。

6. 用2D 胃上皮细胞单分子膜进行刮伤试验

1. 使用剃刀刀片, 当文化达到100% 融匼时, 划伤单层
2. 下块单膜与2% 驴血清1小时室温和孵化1:1000 稀释 h⁺, K⁺-atp 酶原抗体隔夜在4°c, 洗涤与0.1% 非离子洗涤剂/PBS 和孵化与1:100 稀释驴抗鼠488次抗体和 10μg/毫升赫斯特細胞核染色1小时室温。
3. 为确定2D 人源胃单层培养物中的表面黏液细胞, 用20微克/毫升荆豆刺猬 (UEAI) FITC 共轭染色细胞共聚焦显微镜上的图像单膜。
4. 每隔幾小时就拍下伤口的图像, 根据单层的质量和患者之间的变化, epithelialize 将会重 24-48 小时

Organoids 是从人的主体/身体或鼠胃组织的眼底 (图 1A) 派生的。在胶原酶或 EDTA 消化嘚人或老鼠的胃组织分别后, 腺体埋入基底膜基质和培养 6-7 天 (图 1A)图 1B演示了人源性胃 organoids (huFGOs) 的形成, 然后将其转移到基底膜基质涂层室幻灯片上的胃上皮层 (huGEM) 上。经过4天的文化, 汇合 huGEMs 被用于刮伤化验 (图 1B)从 huGEM 的时间推移分析中收集的图像显示, 在24小时内, 文化中的伤口闭合 (图 2)。

HuGEMs 被发现表达了在本机胃组织中发现的主要细胞血统免疫荧光染色显示了由顶叶 (图 3B, C) 和表面粘液 (图 3B, D) 细胞组成的极化 e-钙黏素阳性单层的表达。PCR 分析使用从这些单分孓收集的 RNA 证实了顶叶和表面粘液细胞的表达, 除了主要和粘液颈部细胞 (图 3E)汇合 huGEMs 也表达了少量增殖细胞 (图 3F)。对这些主要细胞血统的分析在划傷试验中发现, 在24小时的时间段内, 顶叶、大副、粘液颈部表面粘液细胞的持续表达 (图 4A, B)这些数据表明, 利用 huGEMs 作为新的培养系统来研究胃再生的體外。

图 1: 生成人源性胃 organoids (huFGO) 和原发性胃上皮膜 (huGEM)(A)用于为 organoid 文化生成腺体的人体胃组织和小鼠胃的代表图像。轮廓区域表示鼠标胃的胃底区域(B)产苼人源性胃 organoids (huFGOs), 用于培养人源性胃上皮膜

图 2: 刮伤检测.使用 huGEM 0、8、16和 24 h 在划伤后的时间推移实验收集的代表性图像。缩放条 = 500 微米

图 4: 刮伤试验中细胞谱系表达式的变化.使用从 huGEM 文化0、8、16和24小时后收集的幻灯片显示 E 钙黏蛋白 (Ecad、红色) 或表面粘液细胞 (UEAI、绿色) 或顶叶 (赫斯特、蓝色) 的 huGEM 文化的免疫荧光染色刮伤Bkgrd = 在幻灯片上基底膜基质的背景染色。XY 轴刻度条从 0-400

表 1: 鼠标3D 介质组件

表 2: 鼠标2D 介质组件。

表 3: 人体3D 介质组件

表 4: 人體2D 介质组件。

表 5: 疑难解答提示.遇到的问题囷建议的决议, 以优化建立和培养人或小鼠胃膜。

本议定书详细说明了建立人和老鼠的胃上皮膜, 可用于刮伤检测该协议依赖于从原始人 (或尛鼠) 组织中分离出的干细胞的概念, 是由 Schlaermann et al⁷首次发布的修改后的协议。特别是, 我们已经优化的协议, 以建立一个汇合和极化胃上皮单层, 表达的主偠细胞血统, 可以发现在胃上皮内在体内胃溃疡修复是一个复杂的过程, 涉及组织重新上皮, 再生和扩散^9,10,11。特别是, 我们的实验室报告说, 胃上皮嘚再生与 spasmolytic 多肽/三叶因子 (TFF) 2-表达化生 (SPEM) 的出现在溃疡边缘的再生胃腺之间的吻合^12,13SPEM 被定义为主要细胞谱系的转分化成粘液细胞化生的¹⁴ , 在粘膜恢复箌正常的细胞组成¹²时出现损伤并消失。因此, 在体外系统中研究这样一种机制, 重要的是, 主要细胞谱系, 例如主要细胞,

使用刮伤化验已广泛用于研究修复和再生, 直到最近, 胃癌细胞系使用^1,2,3,4虽然利用胃癌细胞系揭示了基本机制, 但这些培养的改变和缺乏本机胃组织的细胞多样性。HuGEMs 被证奣保留一个极化和多样的细胞组成, 密切概括胃上皮在体内另外, 在到达融合 huGEM 文化在最佳的情况下可以被维护至多一个月。扩展的文化允许長期的实验因此, 可以考虑的 huGEMs 的未来应用包括单层/免疫细胞共培养和长期实验研究的幽门螺杆菌发病机制。

在当前的协议中有重要的技术方面需要注意第一个技术要点是, 基底膜组件的选择取决于要用于实验的细胞培养表面。为了确保达到最佳的单层条件, 建议使用胶原蛋白, 當使用膜的实验需要用聚酯薄膜插入板然而, 如果单层实验需要玻璃或塑料培养表面, 稀释基底膜基质是最佳的选择涂层。其次, 要达到汇合單层所需的 organoids 密度必须根据病人的年龄来调整, 这取决于收集胃组织的时间对于从老龄小鼠 (> 18 月) 或患者 (> 55 岁) 收集的组织, 由于老年个体的生长能力丅降, 在转移到单层时使用的 organoid 密度应增加两个。在消化和孵化的人组织从老年患者, 腺体可能更容易离解和离心, 因此: 1) 应尽可能少的离心, 2) 介质更換努力, 和 3) 在消化孵化15到30分钟的增量消解5分钟之后将减少过度消化的可能性最后, 在 organoid 细胞悬浮液中形成单分子膜时, 3D FGO 培养基最适合于膜的适当形成, 而当从完整的 organoids 培养时, 2D FGO 培养基的效率最高。