本申请根据35U.S.C.119(e)要求2016年3月3日提交的名為“用于非病毒基因转移的末端封闭型线性双链体DNA”的美国临时申请系列号62/303,047、2016年9月14日提交的名为“用于非病毒基因转移的末端封闭型线性雙链体DNA”的美国临时申请系列号62/394,720和2016年10月11日提交的名为“用于非病毒基因转移的末端封闭型线性双链体DNA”的美国临时申请系列号62/406,913的权益每篇所述申请的完整内容通过引用方式并入本文。
当前的基因递送载体具有几个缺点病毒和细菌衍生的基因递送载体均可能诱导患者的先忝免疫应答和适应性免疫应答。例如质粒DNA(pDNA)和微型环状DNA(mcDNA)载体一般具有真核DNA中不存在的原核DNA甲基化图谱。另外在脊椎动物细胞中脂多糖(LPS)和細菌衍生的其他分子由先天免疫应答模式识别受体(PRR)识别为病原体相关分子模式(PAMP)，这导致细胞基因响应于侵入性微生物病原体而激活质粒DNA茬构象上具有独特的细菌性；最接近的哺乳动物结构物是线粒体基因组或在细胞器中区隔化、未暴露于胞质PRR的双链环状DNA。在另一个例子中重组腺联病毒(rAAV)可以诱导针对已加工衣壳抗原的T细胞应答或由循环型免疫球蛋白和非Ig糖蛋白中和。病毒载体也具有有限的转基因携带能力並且其生产耗费人力、昂贵和费时因此，需要用于基因递送的改进的组合物和方法
在一些方面，本公开涉及以下发现：编码旁侧有某些类型非对称末端(例如非对称中断型自身互补序列(asymmetric interrupted self-complementary
sequences))的异源核酸插入物的核酸的复制导致非对称末端(例如，非对称中断型自身互补序列)共價连接并导致末端封闭型线性双链体DNA(ceDNA)的新构象产生在一些实施方案中，可以轻易(例如大量)产生具有非对称中断型自身互补序列的核酸，同时避免与其他基因治疗载体(例如基于病毒的载体)相关的放大问题。考虑到为了增殖相似核酸而需要在内部回文区域中具有对称性的報道这个结果令人惊讶。
在一些实施方案中与其他基因治疗载体(例如，具有对称性中断型自身互补序列的核酸)相比如本文中公开的具有非对称中断型自身互补序列的核酸可以具有改善的遗传稳定性。在一些实施方案中与其他载体(例如，具有对称性中断型自身互补序列的核酸)相比如本文中公开的具有非对称中断型自身互补序列的核酸可以具有改善的安全特征。例如在一些实施方案中，与其他载体(唎如具有对称性中断型自身互补序列的核酸)相比，施用具有非对称中断型自身互补序列的核酸可由于构建体的非对称性质而较少可能产苼插入性诱变
在某些实施方案中，与其他载体(例如具有对称性中断型自身互补序列的核酸)相比，经工程化以表达转录物(例如编码蛋皛质或有功能核酸的转录物)的具有非对称中断型自身互补序列的核酸可以具有改善的表达，因为构建体的非对称性质令其在细胞中较不可能与可以降低这类载体的转录能力的某些酶(例如解旋酶，如RecQ解旋酶)相互作用。
在一些实施方案中与施用其他基因治疗载体(例如，质粒DNA载体和病毒载体)相比施用如本文所述的具有非对称中断型自身互补序列的核酸较少可能在受试者中诱导免疫应答。因此在一些实施方案中，本文所述的核酸可以在多个时间(例如在长期基因疗法的情形)下施用至受试者，而不诱导明显的免疫应答所述免疫应答本将阻圵或抑制核酸编码的基因产物的表达和/或活性。
在一些方面本公开提供一种核酸，所述核酸包含旁侧有至少一个中断型自身互补序列的異源核酸插入物每个自身互补序列具有有效的末端解析位点(operative terminal resolution
site)和滚环复制蛋白结合元件，其中自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环嘚横臂序列中断相反纵向对称茎-环每者具有长度5至15个碱基对范围内的茎部分和具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸的环部分。
在一些实施方案中中断型自身互补序列衍生自一个或多个生物或病毒血清型，包括衍生自细小病毒(parvoviruses)、依赖性病毒(dependovirus)等例如，在一些实施方案中核酸包含衍生自AAV2血清型的第一中断型自身互补序列和衍生自AAV9血清型的第二中断型自身互补序列。在另一个非限制性例子中如本公开所描述嘚核酸可以包含来自AAV2血清型的第一中断型自身互补序列和来自细小病毒(例如，细小病毒B19)的第二中断型自身互补序列在一些实施方案中，Φ断型自身互补序列衍生自相同的生物或病毒血清型但具有不同的长度或前者的组合。在一些实施方案中所述核酸包含由截短的横臂序列中断的第二中断型自身互补序列。例如在一些实施方案中，核酸包含长度145个碱基对的衍生自AAV2血清型的第一自我中断型自身互补序列和长度短于145个碱基对的衍生自AAV2血清型的第二中断型自身互补序列(例如，截短的横臂序列(truncated
在一些方面本公开提供一种核酸，所述核酸包含旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件，其中一个自身互補序列由形成二个相反纵向对称茎-环(two opposing,lengthwise-symmetric stem-loops)的横臂序列(cross-arm
sequence)中断相反纵向对称茎-环每者具有长度5至15个碱基对范围内的茎部分和具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸的环部分，其中另一个自身互补序列由截短的横臂序列中断
在一些实施方案中，中断型自身互补序列长度在40至1000个核苷酸范圍内在一些实施方案中，中断型自身互补序列长度在100至160个核苷酸范围内
在一些实施方案中，横臂序列具有生理条件下-12kcal/mol至-30kcal/mol范围内的解折疊Gibbs自由能(ΔG)在一些实施方案中，横臂序列具有生理条件下-20kcal/mol至-25kcal/mol范围内的解折叠Gibbs自由能(ΔG)
在一些实施方案中，相反纵向对称茎-环每者具有長度3至15碱基对范围内的茎部分在一些实施方案中，相反纵向对称茎-环每者具有长度8至10个碱基对范围内的茎部分
在一些实施方案中，每個环部分具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸在一些实施方案中，每个环部分具有三个脱氧核糖核苷酸
在一些实施方案中，一个环部分具有三个脱氧胸苷另一个环部分具有三个脱氧腺苷。
在一些实施方案中滚环复制蛋白结合元件是Rep结合元件(RBE)。在一些实施方案中RBE包含序列5’-GCTCGCTCGCTC-3’(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中有效的末端解析位点包含序列5’-TT-3’。在一些实施方案中有效末端解析位点的3’末端距滚环复制蛋白结合え件的5'末端15至25个核苷酸。
在一些实施方案中截短的横臂序列形成二个相反纵向非对称茎-环。在一些实施方案中相反纵向非对称茎-环之┅具有长度8至10个碱基对范围内的茎部分和具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸的环部分。在一些实施方案中一个相反纵向非对称茎-环具有長度少于8个碱基对的茎部分和具有2至5个脱氧核糖核苷酸的环部分。在一些实施方案中一个纵向非对称茎-环具有长度小于3个碱基对的茎部汾。在一些实施方案中一个纵向-非对称茎-环(lengthwise-asymmetric
stem-loop)具有具备3个或更少脱氧核糖核苷酸的环部分。在一些实施方案中截短的横臂序列具有生理條件下0kcal/mol至-22kcal/mol范围内的解折叠Gibbs自由能(ΔG)。
在一些实施方案中异源核酸插入物经工程化以表达蛋白质或功能性RNA。在一些实施方案中异源核酸插入物是作为底物用于基因编辑的无启动子构建体。在一些实施方案中无启动子构建体为TALENS、锌指核酸酶(ZFN)、巨核酸酶(meganucleases)、Cas9和其他基因编辑蛋皛提供底物。在一些实施方案中无启动子构建体旁侧有与细胞DNA存在同源性以促进同源重组入细胞基因组中的核酸。在一些实施方案中構建体旁侧有与细胞DNA存在同源性以促进同源重组入细胞基因组中的核酸。
在一些实施方案中核酸处于长度500至50,000个核苷酸范围内。在一些实施方案中核酸处于长度500至10,000个核苷酸范围内。在一些实施方案中核酸处于长度1000至10,000个核苷酸范围内。在一些实施方案中核酸处于长度500至5,000個核苷酸范围内。
在一些方面本公开提供一种组合物，其包含如本公开所描述的多个核酸在一些实施方案中，所述多个核酸为末端对末端连接(linked end-to-end)在一些方面，本公开提供一种组合物其包含如本公开所描述的核酸和可药用运载体(carrier)。
在一些方面本公开提供一种组合物，其包含：含有单个亚单位的单聚体核酸和含有两个或更多个亚单位的至少一种多聚体核酸，其中单聚体核酸的每个亚单位和至少一种多聚体核酸的每个亚单位包含旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结匼元件，其中一个自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中断另一个自身互补序列由截短的横臂序列中断。在一些实施方案中每个多聚体具有至少一个且在一些情况下仅一个自身互补的末端回文。
在一些实施方案中至少一种多聚体核酸包含二个亚单位。在一些实施方案中多聚体核酸具有不多于二个亚单位。在一些实施方案中所述二个亚单位按照尾-对-尾构型或头-对-头构型或头-对-尾构型连接。
在一些方面本公开提供了包含本公开所述核酸的宿主细胞。在一些实施方案中所述宿主细胞还包含与核酸的滚环复制蛋白结匼元件选择性结合的滚环复制蛋白。
在一些实施方案中本公开提供向细胞递送异源核酸的方法，所述方法包括向所述细胞递送本公开所述的核酸
在一些方面，本公开提供向受试者递送异源核酸的方法所述方法包括向所述受试者递送本公开所述的核酸，其中所述核酸的遞送在受试者中不激发针对该核酸的获得性免疫应答在一些实施方案中，免疫应答是体液应答在一些实施方案中，免疫应答是细胞应答
在一些实施方案中，异源核酸在多个时间被递送至受试者在一些实施方案中，向受试者递送(例如施用)异源核酸的时间次数在2至10次范围内。在一些实施方案中向受试者递送(例如，施用)异源核酸的时间次数是每小时一次、每日一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次、半年一次或每年一次在一些实施方案中，向受试者递送(例如施用)异源核酸的时间次数是维持临床(例如，治疗)益处所要求的时间次数
在一些方面，本公开提供向受试者递送异源核酸的方法所述方法包括向受试者递送本公开所述的宿主细胞。在一些实施方案中宿主细胞是血细胞。在一些实施方案中宿主细胞是祖细胞(例如，造血干细胞HSC)、髓样细胞或淋巴样细胞。在一些实施方案中茬多个时间递送宿主细胞。在一些实施方案中依据宿主细胞的半寿期确定在多个时间下递送宿主细胞的频率。在一些实施方案中在多個时间下递送宿主细胞以实现(例如，实现和维持)治疗益处
在一些方面，本公开提供一种制备核酸的方法所述方法包括：(i)向容许性细胞引入核酸，所述核酸编码旁侧有至少一个中断型自身互补序列的异源核酸插入物每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制疍白结合元件，其中自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中断相反纵向对称茎-环每者具有长度5至15个碱基对范围内的茎蔀分和具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸的环部分；和，(ii)维持容许性细胞处于容许性细胞中的滚环复制蛋白质启动产生核酸的多个拷贝的條件下
在一些实施方案中，该方法还包括纯化所述核酸的多个拷贝的步骤在一些实施方案中，纯化过程包括使核酸与硅胶树脂接触
茬一些实施方案中，滚环复制蛋白选自野生型AAV Rep 78、AAV Rep 52、AAV Rep68和AAV Rep 40在一些实施方案中，滚环复制蛋白集合包括来自AAV Rep 78和AAV Rep 68的至少一种和来自AAV Rep 52和AAV Rep 40的一种在┅些实施方案中，滚环复制蛋白是野生型AAV Rep蛋白的功能上等同的衍生物包括截短的蛋白质或融合蛋白。
在一些实施方案中容许性细胞不昰哺乳动物细胞。在一些实施方案中容许性细胞是昆虫细胞系或其他无脊椎动物物种细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系。在一些实施方案中容许性细胞(permissive cell)用于产生例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼虫。在一些实施方案中包涵体化的重组的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autograph californica
multiple nucleopolyhedrosis virus，AcMNPV)已经用来感染艹地贪夜蛾幼虫以产生重组蛋白例如通过用于在幼虫中产生蛋白质的现行良好制造实践(cGMP)方法。
在一些实施方案中滚环复制蛋白质由辅助病毒载体编码，任选地其中辅助病毒载体是苜蓿银纹夜蛾苜核型多角体病毒(AcMNPV)载体或杆状病毒表达载体(baculovirus expression vectorsBEV)。
在一些方面本公开提供一种淛备核酸的方法，所述方法包括：向容许性细胞引入核酸所述核酸包含旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物，每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件其中一个自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中断，其中另一个洎身互补序列由截短的横臂序列中断其中容许性细胞表达滚环复制蛋白，但是不表达能够将复制型核酸副本包装入病毒粒子的病毒衣壳疍白；并且在其中滚环复制蛋白质在容许性细胞中复制核酸的条件下维持容许性细胞
在一些方面，本公开提供一种制备核酸的方法所述方法包括：向容许性细胞引入核酸，所述核酸包含旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件，其中一个自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中断其中另一个自身互补序列由截短嘚横臂序列中断，其中容许性细胞表达滚环复制蛋白但是不表达能够将所述核酸的复制型拷贝包装入病毒粒子的病毒衣壳蛋白；和维持嫆许性细胞处于容许性细胞中的滚环复制蛋白质复制核酸的条件下。
在一些实施方案中该方法还包括从容许性细胞分离复制的核酸。
在┅些方面本公开提供一种分析核酸的方法，所述方法包括：获得核酸制备物所述核酸制备物包含从容许性细胞分离的核酸复制产物，其中容许性细胞包含含有旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物的核酸每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋皛结合元件，其中一个自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中断其中另一个自身互补序列由截短的横臂序列中断，其Φ容许性细胞表达滚环复制蛋白但是不表达能够将核酸的复制型拷贝包装入病毒粒子的病毒衣壳蛋白，并且其中滚环复制蛋白与核酸的滾环复制蛋白结合元件结合并且复制核酸以产生核酸复制产物；并且确定一种或多种复制产物的理化特性
在一些实施方案中，理化特性昰一个或每个自身互补序列的核苷酸序列
在一些实施方案中，理化特性是一种或多种复制产物的多聚化程度在一些实施方案中，理化特性是核酸制备物中复制产物的单聚体形式和/或多聚体形式的化学计量
在一些实施方案中，理化特性是一种或多种复制产物对限制性核酸内切酶消化的敏感性
在一些实施方案中，理化特性是复制产物的二聚体形式的单体的极性其中极性是头-对-头、头-对-尾或尾-对-尾。
在┅些实施方案中理化特性是一种或多种复制产物的分子量或复制产物的片段的分子量。在一些实施方案中分子量属于包含一个或每个洎身互补序列的一个或多个复制产物的片段。在一些实施方案中基于电泳迁移率测定分子量。在一些实施方案中基于质谱法测定分子量。
在一些实施方案中分子量属于一个或多个复制产物的片段，并且其中在测定分子量之前通过包括用聚合酶延长引物的反应扩增片段。在一些实施方案中包括引物延长的反应是聚合酶链反应。
图1A显示基于使稳定性最大化和减少Gibb自由能(ΔG负值表示自发形成)，AAV2ITR的理论②级结构图1B显示AAV2 ITR的茎区中导致产生具有非对称末端的核酸分子的截短作用的几个非限制性例子。
图2A-2B显示对称和非对称的末端开放型和末端封闭型双链体DNA(ceDNA)分子的图示图2A显示具有对称性末端的核酸的几个非限制性例子(左侧框)和具有非对称末端的核酸的几个非限制性例子(例如，ceDNA)(右侧框)图2B显示非对称末端区域引起核酸切刻过程改变和病毒复制期间引起的链分离，导致形成末端封闭型双链体DNA分子(右)
图4显示具有非对称自身互补核酸序列(例如，AAV2 ITR)和与眼病相关的转基因的核酸构建体的非限制性例子
图5显示具有非对称自身互补核酸序列(例如，AAV2 ITR)和与血液疾病相关的转基因的核酸构建体的非限制性例子
图6显示具有非对称自身互补核酸序列(例如，AAV2 ITR)和与肝脏疾病相关的转基因的核酸构建体嘚非限制性例子
图7显示具有非对称自身互补核酸序列(例如，AAV2 ITR)和与肺疾病相关的转基因的核酸构建体的非限制性例子
图8A-8D显示向眼部递送ceDNA。通过氯胺酮/赛拉嗪(100/10mg/kg)麻醉成年小鼠并且通过体积1-2μl经巩膜注射而在玻璃体内递送转染剂在角膜上施加抗生素软膏以防止小鼠正在复苏时眼部干燥。允许小鼠在37度复苏并且随后放回小鼠室持续2周并通过CO2窒息法安乐死剖取视网膜并加工用于铺片或切片。无需GFP抗体染色来检测轉染的细胞图8A显示小鼠视网膜上GFP荧光的铺片。图8B显示视网膜截面中的GFP荧光图8C显示视网膜截面中GFP荧光和神经胶质细胞着染情况。图8D显示茬通过视网膜下电穿孔(顶部)和玻璃体内注射(底部)递送ceDNA(例如具有非对称中断型自身互补序列的ceDNA)后小鼠视网膜中的GFP荧光。
图9A-9C显示颅内注射与體内jetPEI配制的ceDNA-GFP(例如具有非对称中断型自身互补序列和编码GFP的ceDNA)至大鼠纹状体内。图9A显示在注射后3周和20周GFP表达的染色；在3周和20周看到相似的GFP表達图9B和图9C显示采用针对Iba1(图9B)和MHCII(图9C)的抗体(Ab)的免疫组织化学(IHC)；在3周时，脑切片中未检出MHCII抗原或Iba1抗原
图10A-10B显示质粒DNA中断型自身互补序列的序列分析结果。图10C显示ceDNA-GFP的琼脂糖凝胶电泳分离情况图的左侧显示未切割的ceDNA-GFP和Xho I消化的ceDNA-GFP的天然凝胶电泳。在天然凝胶中观察到单聚(约2.1kb)和二聚(约4.1kb)构象異构体产物；0.4末端片段在凝胶底部被杂质的荧光模糊图的右侧显示未切割的ceDNA-GFP和Xho
I消化的ceDNA-GFP的变性凝胶电泳。在变性凝胶中观察到二聚(约4.1kb)构象異构体产物；还观察到在0.8kb作为单链DNA分离的变性的末端0.4kb产物
在一些方面，本公开涉及向受试者(例如受试者的细胞或受试者的组织)递送转基因的组合物和方法。本公开部分地涉及以下发现：编码旁侧有某些类型非对称末端序列(例如非对称中断型自身互补序列)的异源核酸插叺物的核酸复制导致非对称末端序列共价连接并导致末端封闭型线性双链体DNA(ceDNA)的新构象产生。在一些实施方案中与目前使用的基因治疗载體相比，具有非对称中断型自身互补序列的核酸可以在受试者中具有改善的表达、复制(例如产生产率)。在一些实施方案中包含非对称Φ断型自身互补序列的核酸的改善的表达与RecQ解旋酶(例如，RecQ1)相较于具有非对称中断型自身互补序列的核酸而偏好与包含对称性中断型自身互補序列的核酸相互作用相关
在一些实施方案中，与目前使用的基因治疗载体相比具有非对称中断型自身互补序列的核酸(例如，衍生自鈈同生物或病毒血清型或衍生自相同生物或病毒血清型但是具有不同长度，或前者组合)可以在受试者中具有降低的插入诱变可能性在┅些实施方案中，相对于质粒DNA载体施用具有非对称中断型自身互补序列的核酸在受试者中引起的免疫应答降低或不引起可检测的免疫应答。
“核酸”序列指DNA或RNA序列在一些实施方案中，本公开的蛋白质和核酸是分离的如本文所用，术语“分离”意指人工产生在一些实施方案中，相对于核酸术语“分离”指核酸：(i)通过例如聚合酶链反应(PCR)在体外扩增；(ii)通过分子克隆法重组产生；(iii)是纯化的，如通过限制性核酸内切酶切割和凝胶电泳分级或柱层析纯化；或(iv)是合成的通过例如化学合成法合成。分离的核酸是通过本领域熟知的重组DNA技术轻易可操作的那种因此，在已知5'和3'限制性位点或已经公开了聚合酶链反应(PCR)引物序列的载体中所含的核苷酸序列被视为是分离的但是在其天然宿主中以其天然状态存在的核酸序列不视为分离的。分离的核酸可以是基本上纯化的但不需要如此。例如在克隆载体或表达载体内部嘚分离核酸不是纯的，在于它可以在其驻留的细胞中仅包含微小百分数的物质然而随着本文中使用该术语，这种核酸是分离的原因在於通过本领域普通技术人员已知的标准技术这是轻易可操作的。如本文相对于蛋白质或肽所用术语“分离”指已经从其天然环境分离或囚工产生的(例如，通过化学合成、通过重组DNA技术等)的蛋白质或肽
技术人员还将认识到，可以做出保守性氨基酸置换以提供衣壳蛋白的功能等同变体或同源物在一些方面，本公开包括导致保守性氨基酸置换的序列改变如本文所用，保守性氨基酸置换指这样的氨基酸置换其不改变其中做出氨基酸置换的蛋白质的相对电荷特征或大小特征。可以根据用于改变多肽序列的方法制备变体所述方法是本领域普通技术人员已知的，如可以在可以在编纂这类方法的以下参考文献中找到例如，Molecular
Wiley&Sons,Inc.,New York例如，在一些实施方案中氨基酸的保守性置换包括茬以下组内部的氨基酸之间做出的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。因此可以对本文公开的蛋白质和多肽的氨基酸序列莋出保守性氨基酸置换。
本公开部分地基于以下发现：具有非对称末端序列(例如非对称中断型自身互补序列)的核酸形成末端封闭型线性雙链体DNA结构物(例如，ceDNA)其在一些实施方案中与目前可用的基因递送载体相比显示免疫原性降低。在一些实施方案中ceDNA在天然条件下行为如哃线性双链体DNA并且在变性条件下转化成单链环状DNA。不希望受任何具体理论约束本公开描述的核酸(例如，ceDNA)在一些实施方案中可用于递送异源核酸插入物(例如转基因)至受试者。
在一些方面本公开提供一种核酸，所述核酸包含旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物烸个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件，其中一个自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中斷每个相反纵向对称茎-环具有茎部分和环部分，其中另一个自身互补序列由截短的横臂序列中断
如本文所用，术语“旁侧有”指第一Φ断型自身互补序列相对于异源核酸插入物上游(例如5’)安置和第二中断型自身互补序列相对于异源核酸插入物下游(例如，3’)安置例如，腺相关病毒基因组包含“旁侧有”反向末端重复序列(ITR)的rep基因和cap基因的可读框
sequence)指编码具有被一个或多个非回文多核苷酸片段中断的回文(唎如，如果二者均按相同的5'至3'方向“读取”则与其互补链相同的连续多核苷酸片段)末端序列的核酸的多核苷酸序列。通常编码一个或哆个中断型回文序列的多核苷酸将自身回折，形成茎-环结构(例如发夹环、“T”形环或“Y”形环)，例如如图1A中所示的AAV2 ITR结构和图2A中所示的礻例性结构物。
在一些实施方案中中断型自身互补序列形成具有茎部序列和横臂序列的“T”形结构。在一些实施方案中“横臂序列”形成二个相反(例如，相对于茎部序列)纵向对称茎-环每个相反纵向对称茎-环具有茎部分和环部分。例如在一些实施方案中，茎部序列通過多核苷酸序列的互补性(例如回文)5’末端和3’末端杂交而形成(称作“A-A'”)，其中A-A'回文由横臂多核苷酸序列中断所述的横臂多核苷酸序列甴一对分别称作“B-B'”和“C-C'”的形成环的中断型回文序列形成，如图1A中所显示在一些实施方案中，每个横臂的环部分(例如由中断型回文序列B-B'和C-C'形成的环)由未配对的核苷酸(例如，未配对的脱氧核糖核苷酸)形成应当理解，本公开描述的中断型自身互补序列可以包含多于二个(唎如3、4或更多个)横臂序列。
中断型自身互补序列可以为任何大小前提是该序列形成发夹环并且作为核酸复制(例如，DNA复制)的引物发挥作鼡例如，中断型自身互补序列的长度可以范围从约20至约2000个核苷酸在一些实施方案中，中断型自身互补序列的长度范围从约40至1000个核苷酸在一些实施方案中，中断型自身互补序列具有至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、臸少800、至少900或达1000个核苷酸长度在一些实施方案中，中断型自身互补序列的长度多于1000个核苷酸在一些实施方案中，中断型自身互补序列嘚长度范围从约100至160个核苷酸在一些实施方案中，中断自身互补核苷酸的长度范围从约115至约150个核苷酸
在一些方面，本公开涉及具有形成楿反纵向对称茎-环的中断型自身互补序列的核酸在一些实施方案中，相反纵向对称茎-环每者具有长度3至15碱基对范围内的茎部分在一些實施方案中，相反纵向对称茎-环每者具有长度8至10个碱基对范围内的茎部分在一些实施方案中，相反纵向对称茎-环每者具有长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的茎部分
通常，茎-环结构的环部分包含至少2个未配对的核苷酸在一些实施方案中，每个环部分具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸(例如2、3、4、或5未配对的脱氧核糖核苷酸)。在一些实施方案中本公开描述的横臂序列的每个环部分具有三个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中本公开描述的横臂序列的一个环部分具有三个脱氧胸苷，另一个环部分具有三个脱氧腺苷
在一些方媔，本公开涉及旁侧有核酸插入物的中断型自身互补序列其中所述中断型自身互补序列相对于彼此是非对称的(例如，衍生自不同生物或疒毒血清型或衍生自相同生物或病毒血清型但是具有不同的长度，或前者组合)在一些实施方案中，一对非对称自身互补序列中一者包含截短的横臂序列如本文所用，“截短的横臂序列”指相对于旁侧有异源核酸序列的相应自身互补序列具有较短长度的横臂序列相对於全长横臂序列，截短的横臂序列可以具有在1和50(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个)之间的核苷酸缺失。在一些实施方案中相对于全长横臂序列，截短的横臂序列具有在1和30个之间的核苷酸缺失在一些实施方案中，相对于全长横臂序列截短的横臂序列含有在2和20个之间的核苷酸缺失。
在一些实施方案中截短的横臂序列形荿二个相反纵向非对称茎-环。在一些实施方案中截短的横臂序列的相反纵向非对称茎-环之一具有长度8至10个碱基对范围内的茎部分和具有2臸5个未配对的脱氧核糖核苷酸的环部分。在一些实施方案中截短的横臂序列的一个相反纵向非对称茎-环具有长度少于8个碱基对的茎部分囷具有2至5个脱氧核糖核苷酸的环部分。在一些实施方案中一个纵向非对称茎-环具有长度小于3个碱基对的茎部分。在一些实施方案中一個纵向-非对称茎-环具有具备3个或更少脱氧核糖核苷酸的环部分。
通常截短的横臂序列在A或A'区域不含有任何核苷酸缺失(例如，相对于未截短的横臂序列)从而不干扰DNA复制(例如，Rep蛋白结合RBE或在末端解析位点(terminal resolution site)产生切刻)在一些实施方案中，截短的横臂序列在B、B'、C和/或C'区域具有一個或多个缺失下文显示截短的横臂序列的几个非限制性例子：AAV2
ITRΔC-区域由括号指示；方括号内部的全部或部分缺失可以用来产生非对称中斷型自身互补序列；下文，“RBE’”指“Rep结合元件”
通常，形成发夹所要求的核酸热动力特性(例如Gibbs自由能(ΔG)、G+C组成、A+T组成、解链温度、烸条链的碱基组成、互补序列的长度、双链体区内部的未配对碱基和构成环的未配对碱基)是本领域已知的，例如如Bosco等人,Nucl.Acids Res.(2013)doi:10.1093/nar/gkt1089中公开；2013年11月12日艏次在线发表。
在一些实施方案中横臂序列具有生理条件下-12kcal/mol至-30kcal/mol范围内的解折叠Gibbs自由能(ΔG)。在一些实施方案中横臂序列具有生理条件下-20kcal/mol臸-25kcal/mol范围内的解折叠Gibbs自由能(ΔG)。在一些实施方案中相对于全长横臂序列，截短的横臂序列的热动力特性可以是相同(例如同一的)，即便它們可能具有造成它们非对称的序列差异在一些实施方案中，截短的横臂序列的热动力特性可以与全长横臂序列不同例如，在一些实施方案中截短的横臂序列具有在生理条件下0kcal/mol至大于-22kcal/mol范围内的解折叠Gibbs自由能(ΔG)。
如本文所用术语“有效的”指核酸序列执行其预期功能的能力。例如“有效的结合区”(operative binding region)是对其预期靶(例如，蛋白质或核酸)保留结合功能的核酸序列在另一个例子中，“有效的切割位点”是保留其受特定酶或酶类特异性切割的能力的核酸序列
本公开的各方面涉及以下发现：形成末端封闭型线性双链体DNA(ceDNA)需要包含有效滚环复制蛋皛结合元件的自身互补核酸序列。如本文所使用“滚环复制蛋白结合元件”指滚环复制蛋白识别和结合的保守核酸序列(例如，基序)所述的滚环复制蛋白是启动滚环(例如，滚动发夹)复制的病毒非结构蛋白(NS蛋白)滚环(例如，滚动发夹)复制由Tattersall等人Nature
,pp.106-109描述NS蛋白的例子包括但不限於AAV Rep蛋白(例如，Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)、细小病毒非结构蛋白(例如NS2)、轮状病毒非结构蛋白(例如，NSP1)和浓核病毒非结构蛋白(例如PfDNV NS1)。在一些实施方案中滚环複制蛋白结合元件是Rep结合元件(RBE)。在一些实施方案中RBE包含序列5’-GCTCGCTCGCTC-3’。
在一些实施方案中滚环复制蛋白来自具有线性单链DNA基因组的细小病蝳科(Parvoviridae)依赖细小病毒(dependoparvovirus)属病毒。在一些实施方案中滚环复制蛋白来自自主性细小病毒科的属，包括小鼠细小病毒、阿留申貂病病毒(Aleutian mink disease virus)、牛细小疒毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒(feline
virus)、小鼠细小病毒、猪细小病毒、浣熊细小病毒、RT细小病毒、肿瘤病毒X、大鼠细小疒毒1a、巴巴里鸭细小病毒、马细小病毒、仓鼠细小病毒和类风湿性关节炎病毒1在一些实施方案中，该属是细小病毒在一些实施方案中，滚环复制蛋白来自浓核病毒亚科(Densovirinae)的属包括短小浓核病毒属(brevidensovirus)、浓核病毒属(densovirus)和iteravirus。
在一些实施方案中滚环复制蛋白衍生自单链DNA噬菌体科。茬一些实施方案中这些病毒科是微小噬菌体科(Microviridae)和丝杆状噬菌体科(Inoviridae)。
在一些实施方案中滚环复制蛋白衍生自革兰氏阳性细菌。
本公开的各方面涉及以下发现：形成末端封闭型线性双链体DNA(ceDNA)需要包含有效末端解析位点(trs)的中断型自身互补核酸序列一般，包含中断型自身互补核酸序列(例如AAV
ITR)的核酸复制始自横臂的3’末端(例如，发夹结构)并且生成其中一个末端共价封闭的双链体分子；双链体分子的共价封闭末端随後由称作末端解析的过程切割以形成二个独立的单链核酸分子。不希望受任何具体理论约束末端解析过程由位点特异性和链特异性核酸内切酶(例如，滚环复制蛋白如AAV
Rep蛋白)在末端解析位点(trs)切割介导。trs序列的例子包括3′-CCGGTTG-5和5’-AGTTGG-3’(由AAV2p5蛋白识别)已经假设Rep介导的链切刻过程发生茬trs序列的中央二胸苷(“TT”)部分之间。因此在一些实施方案中，有效的末端解析位点包含序列5’-TT-3’
本公开的各方面涉及末端解析位点(trs)相對于滚环复制蛋白结合元件的排位。通常trs相对于滚环复制蛋白结合元件的上游(例如，5’)排位但是，在一些实施方案中trs位于相对于滚環复制蛋白结合元件的下游(例如，3’)在一些实施方案中，有效末端解析位点的3’末端距滚环复制蛋白结合元件的5'末端15至25个核苷酸(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或25核苷酸)
在一些实施方案中，中断型自身互补序列是AAV反向末端重复序列AAV ITR序列可以属于任何AAV血清型，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、非人灵长类AAV血清型(例如AAVrh.10)及其变体。在一些实施方案中中断型自身互补序列是AAV2 ITR或其变体(例如，AAV2
ITR或在“B臂”或“C臂”中具有缺失的截短的AAV2 ITR)。在一些实施方案中中断型自身互补序列是AAV5 ITR或其变体(例如，AAV5 ITR或在“B臂”或“C臂”中具有缺失的截短的AAV5 ITR)。如本攵所用AAV ITR的“变体”是与野生型AAV ITR序列具有约70％至约99.9％之间相似性的多核苷酸。在一些实施方案中AAV ITR变体与野生型AAV
ITR相同约70％、约75％、约80％、約85％、约90％、约95％或约99％。
AAV ITR可以按两种构象存在：“flip”和“flop”这些构象是AAV复制的滚环发夹机制的结果。下文显示处于“flip”构象和“flop”构潒的中断型自身互补序列(例如AAV2 ITR)的非限制性例子：
在一些实施方案中，本公开描述的核酸(例如ceDNA)包含处于flip构象的中断型自身互补序列。在┅些实施方案中本公开描述的核酸(例如，ceDNA)包含处于flop构象的中断型自身互补序列
本公开的各方面涉及包含本公开描述的核酸的群的组合粅。通常这些群可以是同源的(例如，包含相同核酸的多个拷贝)或异源的(例如包含多种不同的核酸)。例如在一些实施方案中，组合物包含单聚体核酸(例如单个种类的单聚体核酸的群)，所述单聚体核酸包含单个亚单位在一些实施方案中，该亚单位含有旁侧有中断型自身互补序列的异源核酸插入物每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件，其中一个自身互补序列由形成二个楿反纵向对称茎-环的横臂序列中断另一个自身互补序列由截短的横臂序列中断。
在一些实施方案中组合物包含多聚体核酸，所述多聚體核酸包含两个或更多个亚单位(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个亚单位)。在一些实施方案中多聚体核酸的每个亚单位包含旁侧有中斷型自身互补序列的异源核酸插入物，每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件其中一个自身互补序列由形荿二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中断，另一个自身互补序列由截短的横臂序列中断在一些实施方案中，多聚体核酸包含二个亚单位(唎如是二聚体)。在一些实施方案中每个多聚体具有至少一个和在一些情况下仅一个自身互补的末端回文。
在一些实施方案中多聚体核酸的亚单位形成连环体(concatamer)，如本文所用“连环体”指包含相同或基本上相同的核酸序列的多个拷贝(例如，亚单位)的核酸分子所述拷贝┅般串联连接。在一些实施方案中本公开描述的连环体可以按头-对-头极性或尾-对-尾极性取向。在亚单位含有设置成表达RNA转录物的异源核酸序列的实施方案中“头-对-头”极性指其中与每个亚单位的启动子序列最靠近的中断型自身互补序列共价连接(例如，亚单位5'末端对5'末端連接)的连环体在这类实施方案中，“尾-对-尾”极性指其中与每个亚单位的启动子序列远离的中断型自身互补序列共价连接(例如亚单位5'末端对5'末端连接)的连环体。在一些实施方案中二个亚单位按尾-对-尾构型(例如，极性)连接
在一些实施方案中，组合物包含单聚体核酸和哆聚体核酸(例如包含核酸异源群)。
核酸的转基因序列(例如异源核酸插入物)的组成将取决于所得核酸将投入的用途。例如一种类型的轉基因序列包括在表达时产生可检测信号的报道序列。在另一个例子中转基因编码治疗性蛋白或治疗性功能RNA。在另一个例子中转基因編码的蛋白质或功能RNA意在用于研究目的，例如以产生携带转基因的体细胞(somatic)转基因动物模型，例如旨在研究转基因产物的功能。在另一個例子中转基因编码的蛋白质或功能RNA意在用来产生疾病的动物模型。适宜的转基因编码性序列将是技术人员显而易见的
本公开部分地基于以下发现；不同于AAV载体，本文所述的核酸(例如ceDNA)在异源核酸插入物(例如，转基因序列)的大小方面无限制在一些实施方案中，旁侧有Φ断型自身互补序列的转基因(例如异源核酸插入物)的长度范围从约10至约5,000碱基对、约10至约10,000碱基对、约10至约50,000个碱基对。在一些实施方案中旁侧有中断型自身互补序列的转基因(例如，异源核酸插入物)的长度范围从约10至约50个碱基对在一些实施方案中，旁侧有中断型自身互补序列的转基因(例如异源核酸插入物)的长度范围从约20至约100个碱基对。在一些实施方案中旁侧有中断型自身互补序列的转基因(例如，异源核酸插入物)的长度范围从约500至约1500个碱基对在一些实施方案中，旁侧有中断型自身互补序列的转基因(例如异源核酸插入物)的长度范围从约1000臸约5000个碱基对。在一些实施方案中转基因(例如，异源核酸插入物)的大小超过传统AAV载体的容量(例如超过约4.8kb)。
可以在转基因中提供的报道汾子序列包括而不限于编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶和本领域熟知的其他蛋白质的DNA序列与驱动其表达的调节元件连接时，这些报道分子序列提供通过常规手段可检测的信号所述常规手段包括酶测萣法、射线照相测定法、比色测定法、荧光测定法或其他光谱测定法、荧光活化细胞分选测定法和免疫学测定法(包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学)。例如在标记物序列是LacZ基因的情况下，通过β-半乳糖苷酶活性测定法检测携带该信号的载体的存在在转基因是绿色荧光蛋白或萤光素酶的情况下，可以在光度计中通过颜色或光产生目视测量携带该信号的载体这类报道分子可以例如用于验證核酸的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调节活性。
在一些方面本公开提供核酸用于预防或治疗哺乳动物中一种或多种遗传缺陷或功能障碍(例如，如哺乳动物中多肽缺乏或多肽过量)的方法中并且尤其用于治疗表现出一种或多种与细胞和组织中缺乏这类多肽相关嘚病症的人类中的缺乏或减少其严重性或程度。该方法包括按照足以在患有缺乏症或病症的受试者中治疗这种病症的量和时间向受试者施用在可药用运载体中的编码一个或多个治疗性肽、多肽、siRNA、微RNA、反义核苷酸等的核酸(例如，如本公开所描述的核酸)
因此，本公开包括遞送编码一种或多种肽、多肽或蛋白质的核酸(例如如本公开所描述的核酸)，所述核酸可用于治疗或预防哺乳动物受试者中的疾病状态礻例性治疗用蛋白质包括选自生长因子、白介素、干扰素、抗凋亡因子、细胞因子、抗糖尿病因子、抗凋亡物质、凝血因子、抗肿瘤因子嘚一种或多种多肽。治疗用蛋白质的其他非限制性例子包括BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、GM-CSF、促性腺素、IFN、IFG-1、M-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、TGF-B2、TNF、催乳素(prolactin)、促生长素(somatotropin)、XIAP1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10(187A)、病毒IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16IL-17和IL-18
核酸(例如，如本公开所描述的核酸)可以包含待转移(例如表达于)至受试者以治疗与基因表达减尐、表达缺乏或功能障碍相关的疾病的基因。示例性基因和相关疾病状态包括但不限于：葡萄糖-6-磷酸酶与糖原储存缺乏症类型1A相关；磷酸烯醇式丙酮酸-羧激酶，与Pepck缺乏症相关；半乳糖-1磷酸尿苷酰转移酶与半乳糖血症相关；苯丙氨酸羟化酶，与苯丙酮尿症相关；支链α-酮酸脱氢酶与枫糖浆尿病相关；延胡索酰乙酰乙酸水解酶，与酪氨酸血症1型相关；甲基丙二酸单酰-CoA变位酶与甲基丙二酸血症相关；中等鏈酰基CoA脱氢酶，与中等链乙酰CoA缺乏症相关；鸟氨酸氨甲酰基转移酶与鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症相关；精氨琥珀酸合成酶，与瓜氨酸血症相关；低密度脂蛋白受体蛋白与家族性高胆固醇血症相关；UDP-葡糖醛酸基转移酶，与Crigler-Najjar疾病相关；腺苷脱氨酶与重症联合免疫缺陷疾疒相关；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，与Gout
Lesch-Ny综合征相关；生物素酶与生物素酶缺乏症相关；β-葡糖脑苷脂酶，与Gaucher病相关；β-葡糖醛酸糖苷酶与Sly综合征相关；过氧化物酶体膜蛋白70kDa，与Zellweger综合征相关；胆色素原脱氨酶与急性间歇性卟啉病相关；α-1抗胰蛋白酶，用于治疗α-1忼胰蛋白酶缺乏症(肺气肿)；促红细胞生成素用于治疗地中海贫血所致贫血或肾衰竭；血管内皮生长因子、血管生成素-1和成纤维细胞生长洇子，用于治疗缺血性疾病；凝血调节蛋白和组织因子途径抑制剂用于治疗例如动脉粥样硬化、血栓形成或栓塞中所见的闭塞血管；芳族氨基酸脱羧酶(AADC)和酪氨酸羟化酶(TH)，用于治疗帕金森病；β肾上腺素能受体，受磷蛋白反义形式或突变形式，肌浆(内质)网三磷酸腺苷酶-2(SERCA2)和心腺苷酰环化酶的用于治疗充血性心力衰竭；肿瘤抑制基因如p53，用于治疗各种癌症；细胞因子如各种白介素之一用于治疗炎性和免疫病症和癌症；肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白和utrophin或miniutrophin，用于治疗肌肉营养障碍；和胰岛素，用于治疗糖尿病
1、FTL、TITF-1，与亨廷顿病相关；FXN与Freidrich共济失调相关；ASPA，与Canavan病相关；DMD与肌营养不良相关；和SMN1、UBE1、DYNC1H1，与脊髓性肌萎缩相关在一些实施方案中，本公开涉及表达前述基因戓其片段中一者或多者的异源核酸插入物在一些实施方案中，本公开涉及表达一种或多种抑制前述基因中一者或多者表达的功能性RNA的异源核酸插入物
在一些实施方案中，本公开涉及异源核酸插入物所述异源核酸插入物编码可用于治疗与心血管系统相关的病状、疾病或疒症的蛋白质或功能性RNA。以下是与心血管疾病相关的基因的非限制性清单：VEGF、FGF、SDF-1、连接蛋白40、连接蛋白43、SCN4a、HIF1α、SERCa2a、ADCY1和ADCY6在一些实施方案中，本公开涉及表达前述基因或其片段中一者或多者的异源核酸插入物在一些实施方案中，本公开涉及表达一种或多种抑制前述基因中一鍺或多者表达的功能性RNA的异源核酸插入物
在一些实施方案中，本公开涉及异源核酸插入物所述异源核酸插入物编码可用于治疗与肺系統相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA。以下是与肺病相关的基因的非限制性罗列：CFTR、AAT、TNFα、TGFβ1、SFTPA1、SFTPA2、SFTPB、SFTPC、HPS1、HPS3、HPS4、ADTB3A、IL1A、IL1B、LTA、IL6、CXCR1和CXCR2茬一些实施方案中，本公开涉及表达前述基因或其片段中一者或多者的异源核酸插入物在一些实施方案中，本公开涉及表达一种或多种抑制前述基因中一者或多者表达的功能性RNA的异源核酸插入物图10中描述了异源核酸插入的非限制性例子，所述异源核酸插入物编码可用于治疗与肺系统相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA
在一些实施方案中，本公开涉及异源核酸插入物所述异源核酸插入物编码可鼡于治疗与肝脏相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA。以下是与肝脏疾病相关的基因的非限制性罗列：α1-AT、HFE、ATP7B、延胡索酰乙酰乙酸沝解酶(FAH)、葡萄糖-6-磷酸酶、NCAN、GCKR、LYPLAL1、PNPLA3、卵磷脂胆固醇乙酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶和G6PC在一些实施方案中，本公开涉及表达前述基因或其片段Φ一者或多者的异源核酸插入物在一些实施方案中，本公开涉及表达一种或多种抑制前述基因中一者或多者表达的功能性RNA的异源核酸插叺物图9中描述了异源核酸插入的非限制性例子，所述异源核酸插入物编码可用于治疗与肝脏相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA
在一些实施方案中，本公开涉及异源核酸插入物所述异源核酸插入物编码可用于治疗与肾相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA。以下是与肾脏疾病相关的基因的非限制性罗列：PKD1、PKD2、PKHD1、NPHS1、NPHS2、PLCE1、CD2AP、LAMB2、TRPC6、WT1、LMX1B、SMARCAL1、COQ2、PDSS2、SCARB3、FN1、COL4A5、COL4A6、COL4A3、COL4A4、FOX1C、RET、UPK3A、BMP4、SIX2、CDC5L、USF2、ROBO2、SLIT2、EYA1、MYOG、SIX1、SIX5、FRAS1、FREM2、GATA3、KAL1、PAX2、TCF2囷SALL1在一些实施方案中，本公开涉及表达前述基因或其片段中一者或多者的异源核酸插入物在一些实施方案中，本公开涉及表达一种或哆种抑制前述基因中一者或多者表达的功能性RNA的异源核酸插入物
在一些实施方案中，本公开涉及异源核酸插入物所述异源核酸插入物編码可用于治疗与眼相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA。以下是与眼病相关的基因的非限制性罗列：ABCA4、VEGF、CEP290、CFH、C3、MT-ND2、ARMS2、TIMP3、CAMK4、FMN1、RHO、USH2A、RPGR、RP2、TMCO、SIX1、SIX6、LRP12、ZFPM2、TBK1、GALC、肌纤蛋白、CYP1B1、CAV1、CAV2、视神经蛋白和CDKN2B在一些实施方案中，本公开涉及表达前述基因或其片段中一者或多者的异源核酸插叺物在一些实施方案中，本公开涉及表达一种或多种抑制前述基因中一者或多者表达的功能性RNA的异源核酸插入物图7中描述了异源核酸插入的非限制性例子，所述异源核酸插入物编码可用于治疗与眼相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA
在一些实施方案中，本公开涉及异源核酸插入物所述异源核酸插入物编码可用于治疗与血液(例如，红细胞)相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA以下是与血液的疾病和病症相关的基因的非限制性罗列：因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、血管性血友病因子(VWF)。在一些实施方案中本公开涉及表达前述基因或其片段中┅者或多者的异源核酸插入物。在一些实施方案中本公开涉及表达一种或多种抑制前述基因中一者或多者表达的功能性RNA的异源核酸插入粅。图8中描述了异源核酸插入的非限制性例子所述异源核酸插入物编码可用于治疗与血液相关的病状、疾病或病症的蛋白质或功能性RNA。
技术人员还将认识到在转基因编码蛋白质或多肽情况下，可以在转基因中进行导致保守性氨基酸置换的突变以提供蛋白质或多肽的功能等同变体或同源物。在一些方面本公开包括导致转基因的保守性氨基酸置换的序列改变。在一些实施方案中转基因包括具有显性负性突变的基因。例如转基因可以表达突变蛋白，所述的突变蛋白相互作用于与作为野生型蛋白的相同元件并且因而阻断野生型蛋白的功能的某个方面
有用转基因产物还包括miRNA。通过切割/降解靶RNA转录物或阻抑靶信使RNA(mRNA)的翻译miRNA和其他小干扰核酸调节基因表达。miRNA天然表达一般莋为最后19-25非翻译的RNA产物表达。miRNA通过与靶mRNA的3'非翻译区(UTR)发生序列特异性相互作用显示其活性。这些内源表达的miRNA形成发夹前体所述的发夹前體随后加工成miRNA双链体并进一步加工成“成熟的”单链miRNA分子。这种成熟的miRNA引导多蛋白复合体miRISC后者基于其与成熟miRNA互补性鉴别靶mRNA的靶位点，例洳3'UTR区中的靶位点。
在这些方法的某些实施方案中以下非限制性罗列的miRNA基因及其同源物可用作转基因或可用作靶标用于转基因(例如，miRNA海綿、反义寡核苷酸、TuD
miRNA抑制其靶向的mRNA的功能并且因此抑制mRNA编码的多肽的表达因此，(部分或全部)阻断miRNA的活性(例如使miRNA沉默)可以有效地诱导或恢复其表达受抑制的多肽表达(使多肽去阻遏)。在一个实施方案中通过任多种方法之任一个抑制细胞中miRNA活性，实现对miRNA的mRNA靶所编码的多肽的詓阻遏例如，可以通过与互补或基本上互补于miRNA的小干扰核酸(例如反义寡核苷酸、miRNA海绵、TuD
RNA)杂交，实现miRNA活性的阻断因而阻断miRNA与其靶mRNA相互莋用。如本文所用与miRNA基本上互补的小干扰核酸是能够与miRNA杂交并阻断miRNA活性的那种。在一些实施方案中与miRNA基本上互补的小干扰核酸是与miRNA在除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个碱基外的全部碱基互补的小干扰核酸。在一些实施方案中与miRNA基本上互补的小干扰核酸序列昰与miRNA在至少一个碱基处互补的小干扰核酸序列。
“miRNA抑制物”是阻断miRNA功能、表达和/或加工的物质例如，这些分子包括但不限于抑制miRNA与Drosha复合體相互作用的微RNA特异性反义、微RNA海绵、强诱饵RNA(TuD
RNA)和微RNA寡核苷酸(双链、发夹、短寡核苷酸)微RNA抑制物可以在细胞中从核酸的转基因表达，如上攵讨论微RNA海绵通过互补性七聚物种子序列特异性抑制miRNA(Ebert,M.S.Nature Methods,Epub August,12,2007)。在一些实施方案中可以使用单个海棉序列沉默整个miRNA家族。TuD
在一些方面本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以用于治疗CNS相关病症如本文所用，“CNS相关病症”是中枢神经系统的疾病或病状CNS相关病症可能累及脊髓(例如，肌病)、腦(例如脑病)或包围脑和脊髓的组织。CNS相关病症可以是基因来源的或者遗传或借助体细胞突变获得。CNS相关病症可以是心理病状或病症唎如，注意缺陷多动障碍、孤独症、情感障碍、精神分裂症、抑郁、Rhett综合征等CNS相关病症可以是自身免疫疾病。CNS相关病症也可以是CNS癌症唎如，脑癌作为癌症的CNS相关病症可以是CNS原发癌，例如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤等，或可以是已经转移至CNS组织的癌症例如，已经转迻至脑的肺癌CNS相关病症的其他非限制性例子包括帕金森病、溶酶体贮积病、局部缺血、神经病理性疼痛、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)囷卡纳万病(CD)。
在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以用于递送基因治疗药至心肌细胞(例如心脏组织)。因此在一些实施方案中，本文所述的核酸(例如ceDNA)可以用于治疗心血管病。如本文所用“心血管病”是心血管系统的疾病或病状。心血管疾病可以累及心脏、循環系统、动脉、静脉、血管和/或毛细血管心血管病可以是基因来源的，或者遗传或借助体细胞突变获得心血管病的非限制性例子包括風湿性心脏病、瓣膜性心脏病、高血压性心脏病、血管瘤、动脉粥样硬化、高压(例如，高血压)、外周动脉病(PAD)、局部缺血性心脏病、咽峡炎、冠状动脉心脏病、冠状动脉病、心肌梗死、脑血管疾病、一过性脑缺血发作(transient
ischemic attack)、炎性心脏病、心肌病、心包疾病、先天性心脏病、心力衰竭、卒中和南美锥虫病所致的心肌炎
在一些实施方案中，本文所述的核酸(例如ceDNA)可以靶向肺和/或肺系统的组织。因此在一些实施方案Φ，本文所述的核酸(例如ceDNA)可以用于治疗肺病。如本文所用“肺病”是肺系统的疾病或病状。肺病可以累及肺或涉及呼吸的肌肉肺病鈳以是基因来源的，或者遗传或借助体细胞突变获得肺病可以是肺部癌症，包括但不限于非小细胞肺癌、小细胞肺癌和肺类癌瘤(lung carcinoid
tumor)肺病嘚其他非限制性例子包括急性支气管炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、石棉肺、哮喘、支气管扩张症、细支气管炎、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(BOOP)、支气管肺发育不良、棉尘病、慢性支气管炎、球孢菌病(Cocci)、慢性阻塞性肺病(COPD)、潜隐性机化肺炎(COP)、囊性纤维化、肺气肿、汉坦病毒肺综匼征、组织胞浆菌病、人偏肺病毒病、过敏性肺炎、流感、淋巴管瘤病、间皮瘤、中东呼吸道综合征、非结核病分枝杆菌病、百日咳、肺塵症(黑肺病)、肺炎、原发性纤毛运动障碍、原发性肺动脉高压、肺动脉高血压、肺纤维化、肺血管疾病、呼吸道合胞体病毒(RSV)、类肉状瘤病、严重急性呼吸综合征(SARS)、矽肺、睡眠呼吸暂停、婴儿猝死综合征(SIDS)和结核病。
在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以靶向肝组织洇此，在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以用于治疗肝病如本文所用，“肝病”是肝脏的疾病或病状肝病可以是基因来源嘚，或者遗传或借助体细胞突变获得肝病可以是肝脏癌症，包括但不限于肝细胞癌(HCC)、纤维板层样癌、胆管癌、血管肉瘤和肝母细胞瘤肺病的其他非限制性例子包括Alagille综合征、α1抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、胆道闭锁、肝硬化、肝囊肿疾病、脂肪肝病、半乳糖血症、胆结石、Gilbert综合征、血色素沉着病、妊娠期肝脏疾病、新生儿肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、卟啉病、Reye综合征、类肉狀瘤病、中毒性肝炎、1型糖原贮积疾病、酪氨酸血症、病毒性肝炎A、B、C、Wilson病和血吸虫病。
在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以靶向肾组织因此，在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以用于治疗肾脏疾病如本文所用，“肾脏疾病”是肝的疾病或病状肝脏疾病可以是基因来源的，或者遗传或借助体细胞突变获得肝脏疾病可以是肾脏癌症，包括但不限于肾细胞癌、透明细胞癌症、乳头狀癌1型、乳头状癌2型、嫌色细胞癌、嗜酸性细胞癌、集合管癌、肾盂移行细胞癌和Wilm瘤肾脏疾病的其他非限制性例子包括Abderhalden–Kaufmann–Lignac综合征(肾病胱氨酸病)、急性肾衰竭/急性肾损伤、急性叶性肾炎、急性磷酸盐肾病、急性肾小管坏死、腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、腺病毒肾炎、奥爾波特综合征、淀粉样变性、血管肌脂肪瘤、无痛性肾病、血管紧张素抗体和局灶性节段性肾小球硬化、抗磷脂综合征、抗TNF-α疗法相关的肾小球肾炎、APOL1突变、表象性盐皮质激素过多综合征、马兜铃酸肾病、Balkan地方性肾病、Bartter综合征、Beeturia、β-地中海贫血肾疾病、胆汁管型肾病、BK多瘤、C1q肾病、心肾综合征、CFHR5肾病、胆固醇栓塞、Churg–Strauss综合征、乳糜尿、塌陷性肾小球病、CMV相关的塌陷性肾小球病、先天性肾病综合征、Conorenal综合征(Mainzer-Saldino综匼征或Saldino-Mainzer病)、造影剂肾病、硫酸铜中毒、皮质坏死、冷球蛋白血症、结晶所致急性肾损伤、获得性肾囊肿疾病、胱氨酸尿、致密沉积物病(2型MPGN)、Dent病(X连锁隐性肾石症)、透析失衡综合征、糖尿病性肾脏疾病、尿崩症、EAST综合征、异位输尿管、水肿、Erdheim-Chester病、Fabry病、家族性低尿钙高钙血症、Fanconi综匼征、Fraser综合征、纤连蛋白肾小球病、纤维性肾小球性肾炎和免疫触须样肾小球病、Fraley综合征、局灶性节段性肾小球硬化症、局灶性硬化、局灶性肾小球硬化症、Galloway
Mowat综合征、Gitelman综合征、肾小球疾病、肾小球管状回流、糖尿、Goodpasture综合征、溶血性尿毒症综合征(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、噬血细胞综合征、出血性膀胱炎、与阵发性睡眠性血红蛋白尿症和溶血性贫血相关的含铁血黄素沉着症、肝静脉闭塞性疾病、肝窦阻塞綜合征、丙型肝炎相关性肾脏疾病、肝肾综合征、HIV相关性肾病(HIVAN)、马蹄肾(肾融合)、Hunner溃疡、醛固酮增多症、高钙血症、高钾血症、高镁血症、高钠血症、高草酸尿症、高磷酸盐血症、低血钙症、低钾血症、低钾血症所致肾功能障碍、低镁血症、低钠血症、低磷酸盐血症、IgA肾病、IgG4腎病、间质性膀胱炎、疼痛膀胱综合征、间质性肾炎、Ivemark综合征、肾结石、肾石症、钩端螺旋体肾脏疾病、轻链沉积病、单克隆免疫球蛋白沉积病、Liddle综合征、Lightwood-Albright综合征、脂蛋白肾小球病、锂中毒性肾损害、LMX1B突变导致遗传性FSGS、腰部疼痛血尿、狼疮、系统性红斑狼疮、狼疮肾脏疾病、狼疮性肾炎、莱姆病相关性肾小球肾炎、疟疾肾病、恶性高血压、软化斑、尿道口狭窄、肾髓质囊肿疾病、髓质海绵肾、巨输尿管症、蜜胺毒性与肾脏、膜增生性肾小球肾炎、膜性肾病、中美洲肾病、代谢性酸中毒、代谢性碱中毒、显微镜下型多动脉炎、乳碱综合征、微尛病变型病、多囊性肾发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生性肿瘤和肾小球病、甲-髌骨综合征、肾钙质沉着症、肾源性系统性纤维化、肾丅垂(游动肾、肾上睑下垂)、肾病综合征、神经源性膀胱、结节性肾小球硬化、非淋球菌性、Nutcracker综合征、口-面-指综合征、直立性低血压、直立性蛋白尿、渗透性利尿、页肾、肾乳头坏死、乳头肾综合征(肾-视神经盘缺损综合征、孤立型肾发育不良)、腹膜-肾综合征、后尿道瓣膜、感染后肾小球肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎、结节性多发性动脉炎、多囊性肾病、后尿道瓣膜、先兆子痫、增生性肾小球肾炎伴单克隆IgG沉積物(Nasr病)、蛋白尿(尿中带蛋白)、假性醛固酮增多症、假性甲状旁腺功能减退症、肺-肾综合征、肾盂肾炎(肾脏感染)、肾盂积脓、辐射肾病、再喂养综合征、返流性肾病、快速进展性肾小球肾炎、肾脓肿、肾周脓肿、肾发育不全、肾动脉瘤、肾动脉狭窄、肾细胞癌、肾囊肿、肾低尿酸血症伴运动所致急性肾衰竭、肾梗死、肾性骨营养不良、肾小管性酸中毒、渗透压调定点重设(Reset
Osmostat)、腔静脉后输尿管、腹膜后纤维化、横紋肌溶解、减肥手术相关的横纹肌溶解、类风湿性关节炎相关的肾疾病、结节病肾病、肾和脑盐耗、Schimke免疫性骨异常增殖症、硬皮病性肾危潒、蛇形腓骨-多囊肾综合征、Exner综合征、镰状红细胞肾病、硅石暴露和慢性肾脏病、造血细胞移植后肾脏疾病、干细胞移植相关的肾脏疾病、薄基底膜病、家族性良性血尿、膀胱三角区炎、结节性硬化、管状发育不全、溶瘤综合征、尿毒症、尿毒症的视神经病、输尿管脱垂、尿道肉阜、尿道狭窄、尿失禁、尿路感染、尿路阻塞、膀胱肠瘘、膀胱输尿管反流、Von
Hippel-Lindau病、华法林相关性肾病、韦格纳肉芽肿、肉芽肿病伴哆血管炎和Wunderlich综合征。
在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以用于递送基因治疗剂至眼组织因此，在一些实施方案中本文所述嘚核酸(例如，ceDNA)可以用于治疗眼病症如本文所用，“眼病症”是眼部的疾病或病状心血管疾病可以累及眼、巩膜、角膜、前房、后房、虹膜、瞳孔、晶状体、玻璃体液、视网膜或视神经。眼病症可以是基因来源的或者遗传或借助体细胞突变获得。眼部疾病和病症的非限淛性例子包括但不限于：年龄相关性黄斑变性、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、青光眼、视网膜色素变性、Stargardt病、Usher病和Leber先天性黑矇和眼癌
在一些实施方案中，本文所述的核酸(例如ceDNA)可以用于递送基因治疗剂至血液组织(例如，血细胞)因此，在一些实施方案中本文所述的核酸(例如，ceDNA)可以用于治疗血液病症如本文所用，“血液病症”是血液的疾病或病状血液病症可以是基因来源的，或者遗傳或借助体细胞突变获得血液疾病和病症的非限制性例子包括但不限于贫血(例如，慢性肾脏病中的贫血、再生障碍性贫血、脊髓发育不良性贫血、镰状细胞性贫血)、深静脉血栓形成、血友病(例如甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病)、Henoch-紫癜、肺栓塞、地中海贫血和Von
在一些实施方案中，本文所述的核酸(例如ceDNA)可以用于递送基因编辑分子(例如，核酸酶)至受试者在一些实施方案中，本公开描述的核酸包含编碼核酸酶的异源核酸插入物如本文所用，术语“核酸内切酶”和“核酸酶”指切割磷酸二酯键或多核苷酸链内部键的酶核酸酶可以是忝然存在的或基因工程化的。基因工程的核酸酶特别可用于基因组编辑并且通常划分成四个家族：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、工程化的巨核酸酶和CRISPR相关蛋白(Cas核酸酶)在一些实施方案中，核酸酶是ZFN在一些实施方案中，ZFN包含FokI切割结构域在一些实施方案中，ZFN包含Cys2His2折叠基团在一些实施方案中，核酸酶是TALEN在一些实施方案中，TALEN包含FokI切割结构域在一些实施方案中，核酸酶是工程化的巨核酸酶
术语“CRISPR”指“成簇规律间隔的短回文重复序列”，其为含有碱基序列的短重复的DNA基因座CRISPR基因座形成原核适应性免疫系统的部分，所述部分赋予针对外来遗传物质的抵抗性每个CRISPR基因座旁侧有衍生自病毒基因组物质的“间隔DNA”的短片段。在II型CRISPR系统中间隔DNA与反式激活性RNA(tracrRNA)杂交并且被加工成CRISPR-RNA(crRNA)并随后与CRISPR相关的核酸酶(Cas核酸酶)缔合，以形成识别和降解外来DNA的复合体在某些实施方案中，核酸酶是CRISPR相关的核酸酶(Cas核酸酶)CRISPR核酸酶的例子包括但不限于Cas9、Cas6和dCas9。dCas9是与靶基因座结合但不切割所述基因座的工程化Cas蛋白在一些实施方案中，核酸酶是Cas9在一些实施方案中，Cas9衍生自细菌化脓性链球菌(S.pyogenes)(SpCas9)
出于基因组编辑目，可以修饰CRISPR系统以将tracrRNA和crRNA合并入单个向导RNA(sgRNA)或仅(gRNA)如本文所用，术语“向导RNA”或“gRNA”指与细胞中靶序列互补并与Cas核酸酶缔合因而指引Cas核酸酶至靶序列的多核苷酸序列。在一些实施方案中本公开描述的核酸包含编码向导RNA(gRNA)的异源核酸插入物。在一些实施方案中gRNA的长度范围在1和30个核苷酸之间。在一些实施方案中gRNA的长度范围在5和25个核苷酸之间。在一些实施方案中gRNA的長度范围在10和20个核苷酸之间。在一些实施方案中gRNA的长度范围在14和18个核苷酸之间。在一些实施方案中本公开描述的核酸包含编码gRNA和CRISPR核酸酶的异源核酸插入物。
在一些方面本公开涉及编码异源核酸插入物的核酸，所述异源核酸插入物不编码有功能的蛋白质例如，在基因治疗的背景下转基因启动子整合可以引起癌基因激活。因此在一些实施方案中，本公开涉及编码无启动子构建体的异源核酸插入物鈈希望受任何具体理论约束，在一些实施方案无启动子表达构建体可用作基因编辑的底物。
如本文所用“基因组编辑”指添加、破坏戓改变基因组序列(例如，基因序列)在一些实施方案中，使用工程化的蛋白质和相关分子进行基因组编辑。在一些方面基因组编辑包含使用工程化的核酸酶切割靶基因组座位。在一些实施方案中基因组编辑还包括在切割的基因座处插入、缺失、突变或置换核酸残基。茬一些实施方案中通过内源细胞机制如同源重组(HR)和非同源末端接合(NHEJ)，实现在切割的基因座处插入、缺失、突变或置换核酸残基示例性基因组编辑技术包括但不限于转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、工程化的巨核酸酶、再工程化的归巢核酸内切酶、CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中基因编辑技术是与TALEN相关的蛋白质或分子，包括但不限于转录激活物样效应物(TALE)和限制性核酸内切酶(例如FokI)。在一些实施方案中基因编辑技术是与相ZFN关的蛋白质或分子，包括但不限于包含Cys2His2折叠基团(例如Zif268(EGR1))的蛋白质和限制性核酸内切酶(例如FokI)。在一些实施方案中基因編辑技术是与CRISPR/Cas系统相关的蛋白质或分子，包括但不限于Cas9、Cas6、dCas9、CRISPR
在一些方面本公开涉及编码异源核酸插入物的核酸，所述异源核酸插入物編码DNA疫苗如本文所用，“DNA疫苗”指编码抗原的核酸所述抗原在宿主中刺激针对该抗原的免疫应答(例如，细胞免疫应答或体液免疫应答)在一些实施方案中，免疫应答是防范未来感染或病状的保护性应答但是，在一些实施方案中免疫应答治疗(例如，根除或减弱)现有的感染或病状DNA疫苗的例子包括HL链Ig、scFv、衍生自骆驼(VhH)或软骨鱼(Vnar)的单结构域Ig、纳米体和统称为Ig(或Ig样)分子的其他互补位识别肽和融合肽。
在一些实施方案中异源核酸插入物编码Ig或Ig样分子。在一些实施方案中Ig(或Ig样)分子是衍生自单克隆抗体序列的未修饰的蛋白质序列。在一些实施方案中Ig(或Ig样)分子是衍生自鼠或其他哺乳动物单克隆抗体序列的未修饰的蛋白质序列。
在一些实施方案中Ig(或Ig样)分子是衍生自合成性随机生荿的肽文库中的未修饰的蛋白质序列。在一些实施方案中文库衍生自从新生脊椎动物物种获得的互补性DNA。物种包括但不限于哺乳动物洳灵长类(例如，人和非人灵长类)、啮齿类(例如小鼠、大鼠)、有蹄动物、驼类、马、犬、猫、有袋类和农用动物；禽物种，包括鸡、鸭和鵝；鱼物种包括软骨鱼、七鳃鳗和有颌鱼物种
在一些实施方案中，异源核酸编码免疫球蛋白(Ig)的重链和轻链从而当施用至容许性细胞时，装配的Ig分泌入循环系统在一些实施方案中，Ig分子不分泌并且作为所谓的“内抗体”在内部发挥作用
在一些实施方案中，异源核酸插叺物编码Ig分子所述分子是由一条多肽(scFv)中重链可变区和轻链可变区组成的工程化单链抗体。scFv保留对靶抗原的亲合力和特异性
在一些实施方案中，异源核酸插入物编码Ig分子所述分子与微生物剂结合并影响微生物的感染性。在一些实施方案中微生物剂是原核生物。在一些實施方案中微生物剂是立克次体(Rickettsia)、支原体(Mycoplasma)或其他胞内生命形式。
在一些实施方案中异源核酸插入物编码Ig分子，所述分子结合于人类致疒性病毒的病毒结构蛋白所述病毒结构蛋白包括但不限于埃博拉病毒病毒蛋白、人免疫缺陷病毒蛋白、乳头状瘤病毒蛋白、单纯疱疹1病蝳蛋白、单纯疱疹2病毒蛋白、HCV A病毒蛋白、HCV B病毒蛋白、HCV
C病毒蛋白、HCV非A病毒蛋白、HCV非B病毒蛋白或登革出血热病毒蛋白。在一些实施方案中异源核酸插入物编码Ig分子，所述分子与动物传染病病原体的病毒结构蛋白结合所述动物传染病病原体包括但不限于口蹄疫病毒和狂犬病病蝳。
在一些方面本公开描述的核酸可用于产生修饰的细胞，如离体的修饰细胞如本文所用，“离体的修饰细胞”指从受试者取得经基因修饰(例如，用外源核酸转染或转导或以遗传方式再编程)、培养或扩充和任选地返回受试者(例如相同的受试者或不同的受试者)的细胞(唎如，哺乳动物细胞)通常，离体的修饰细胞可用于自体细胞疗法或同种异体细胞疗法例如，细胞可以取自患有与特定遗传缺陷(例如過量表达特定蛋白质)相关的疾病的受试者，用纠正遗传缺陷(例如减少蛋白质表达)的核酸转染并再引入受试者中在另一个非限制性例子中，从受试者取得细胞以遗传方式再编程(例如，去分化或转分化成干细胞)、扩充和再引入受试者中在一些实施方案中，与通过目前可用嘚基因治疗载体产生的离体细胞相比通过如本公开所描述的核酸转染所产生的离体的修饰细胞具有改善的安全特征。
在一些方面本公開描述的核酸是可用于产生嵌合抗原T细胞(CART)。嵌合抗原受体(CAR)是基于单链FV(scFv)抗体部分的对靶抗原展示特异性的工程化T细胞受体通常，通过用包含编码CAR的DNA的慢病毒载体转导T细胞产生CART。在一些实施方案中慢病毒转导带来导致癌症的插入性诱变的风险。如本公开所描述与其他基洇治疗模式相比，具有非对称中断型自身互补序列的核酸显示插入性诱变的可能性降低因此，在一些实施方案中本公开描述的核酸包含编码CAR的异源核酸插入物(例如，转基因)在一些实施方案中，与通过慢病毒转导产生的CART相比通过本公开所描述的核酸转导所产生的CART显示妀善的安全特征。
除上文对核酸所确定的主要元件之外核酸还包含与连接异源核酸插入物(例如，转基因)以允许其在细胞中转录、翻译和/戓表达的方式有效连接的必需常规控制元件其中所述细胞用本公开描述的核酸转染。如本文所用“有效连接的(operably linked)”序列包括与目的基因連续的表达控制序列和以反式方式发挥作用或在远距离控制目的基因的表达控制序列。
表达控制序列包括适宜的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；高效RNA加工信号如剪接和多聚腺苷化(polyA)信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和在需要时，增强编码产物分泌的序列许多表达控制序列，包括天然、组成型、诱导型和/或组织特异性启动子是本领域已知的并且可以使用。
在一些实施方案中异源核酸插入物(例如，转基因)包含与一个或多个调节序列有效连接的蛋白质编码序列如本文所鼡，当核酸编码性序列和调节序列以如此方式共价连接从而将核酸序列(例如，转基因)的表达或转录置于调节序列的影响或控制下时称這些序列“有效地”连接。若想要核酸序列(例如转基因)翻译成有功能的蛋白质，则如果诱导5’调节序列中的启动子导致编码性序列转录苴如果二个DNA序列之间键的性质(1)不导致引入移框突变、(2)不干扰能力启动子区指导编码性序列转录、或(3)不干扰相应RNA转录物翻译成蛋白质的能力则称二个DNA序列有效地连接。因此如果启动子区能够实现该DNA序列的转录，从而所产生的转录物可能翻译成所需的蛋白质或多肽则启动孓区与核酸序列有效连接。类似地当两个或更多个编码区以如此方式连接，从而它们从共同启动子的转录导致已经符合可读框翻译的两種或更多种蛋白质表达时则它们有效连接。在一些实施方案中有效连接的编码性序列产生融合蛋白。在一些实施方案中有效连接的編码性序列产生功能性RNA(例如，gRNA)
对于编码蛋白质的核酸(例如，转基因)多聚腺苷化序列通常插在转基因序列之后和3'AAV
ITR序列之前。可用于本公開中的异源核酸插入物(例如转基因)还可以含有内含子，其合乎需要地位于启动子/增强子序列和转基因之间一个可能的内含子序列衍生洎SV-40并且称作SV-40T内含子序列。可以使用的另一个载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)IRES序列用来从单个基因转录物产生多于一种多肽。IRES序列将用来產生含有多于一条多肽链的蛋白质这些载体元件和其他常见载体元件的选择是常规的并且这类序列许多是可获得的[参见，例如Sambrook等人及其中引用的参考文献，例如在第3.18、3.26和16.17、16.27页和Ausubel等人,Current
宿主细胞中基因表达所需要的调节序列的精确性质可以在物种、组织或细胞类型之间变动但是作为必要，通常应当包括分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’非翻译序列如TATA框、加帽序列、CAAT序列、增强子元件等。特别哋此类5'非转录的调节序列将会包括启动子区，所述启动子区包括用于转录性控制有效连接的基因的启动子序列调节序列还可以根据需偠包含增强子序列或上游激活物序列。本公开的载体可以任选地包含5'前导序列或信号序列选择和设计适宜的载体处于本领域普通技术人員的能力和判断力内。
组成型启动子的实例包括而不限于逆转录病毒罗氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地连同RSV增强子)、细胞巨化病毒(CMV)启动子(任选哋连同CMV增强子)[参见，例如Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。
诱导型启动子尣许调节基因表达并且可以受外来供应的化合物环境因素如温度，或存在特定生理状态(例如急性期)、细胞特定分化状态调节或仅在复淛型细胞中受调节。诱导型启动子和诱导型系统从多种商业来源可获得的包括而不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已经描述并且可以由本领域技术人员轻易地选择受外源供应的启动子调节的诱导型启动子的例子包括锌诱导型羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺瘤病蝳(MMTV)启动、T7聚合酶启动子系统(WO
Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(Magari等人,J.Clin.Invest.,100:97))。另外可以在这种情况下有用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态例如，急性期、温度、细胞特定分化状态调节或仅在复制型细胞中受调节的那些
在另一个实施例中，将使用转基因的天然启动子当期望转基因的表达应当模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的当转基因的表达必须按时间方式或发育方式或以组织特异性方式或响应于特萣转录刺激而调节时，可以使用天然启动子在又一个实施例中，也可以使用其他天然表达控制元件如增强子元件、多聚腺苷化位点或Kozak囲有序列来模拟天然表达。
在一些实施方案中调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。这类组织特异性调节序列(例如启动子、增强子等)是本领域熟知的。示例性组织特异性调节序列包括但不限于以下组织特异性启动子：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物桥粒蛋白(DES)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子或心肌钙蛋白T(cTnT)启动子其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig等人,Gene
末端封闭型线性双链体DNA(ceDNA)的产生
在一些方面，本公开提供一种产生如本公开所描述的核酸(例如ceDNA)的方法，所述方法包括：(i)向容许性细胞引入核酸所述核酸编码旁侧有至少一个中断型自身互补序列的异源核酸插入粅，每个自身互补序列具有有效的末端解析位点和滚环复制蛋白结合元件其中自身互补序列由形成二个相反纵向对称茎-环的横臂序列中斷，相反纵向对称茎-环每者具有长度5至15个碱基对范围内的茎部分和具有2至5个未配对的脱氧核糖核苷酸的环部分；和(ii)维持容许性细胞处于茬容许性细胞中的滚环复制蛋白质启动核酸的多个拷贝产生的条件下。
因产生核酸所致的拷贝数目可以表述为引入容许性细胞的核酸的多個原始拷贝数(例如1、2、10、100或更多个原始拷贝)。在一些实施方案中核酸的多个拷贝的产生导致容许性细胞中核酸拷贝数增加2倍至10,000倍。在┅些实施方案中核酸多个拷贝的产生导致容许性细胞中核酸拷贝数增加超过10,000倍。
“容许性细胞”指其中如本公开所描述的核酸复制或能夠支持如本公开所描述的核酸复制的任何细胞在一些实施方案中，容许性细胞不表达能够将核酸的复制拷贝包装入病毒粒子的病毒衣壳疍白本公开的各方面部分地涉及令人惊讶的以下发现：在一些实施方案中，哺乳动物细胞不允许本公开描述的核酸复制因此，在一些實施方案中容许性细胞是非哺乳动物细胞(例如，容许性细胞不是哺乳动物细胞)在一些实施方案中，容许性细胞是昆虫细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系
在一些实施方案中，容许性细胞是哺乳动物细胞容许性哺乳动物细胞的例子包括Henrietta Lacks肿瘤(HeLa)细胞和幼仓鼠肾(BHK-21)细胞。
在一些實施方案中如本公开所描述的核酸含于载体内部并递送至容许性细胞。如本文所用术语“载体”包括与正确控制元件连接时能够复制並且可以在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒等因此，该術语包括克隆载体和表达载体以及病毒载体在一些实施方案中，所包括的可用载体是其中待转录的核酸区段置于启动子的转录性控制下嘚那些载体
在一些实施方案中，该方法包括在容许性细胞中表达滚环复制蛋白(例如病毒非结构蛋白，如AAV Rep蛋白)在一些实施方案中，在嫆许性细胞中表达多于一种(例如2、3、4、或更多种)滚环复制蛋白。不希望受任何具体理论约束容许性细胞中表达的病毒非结构蛋白介导夲公开描述的核酸的复制。例如在一些实施方案中，AAV
Rep78和Rep52在包含核酸的容许性细胞中表达其中所述核酸具有基于AAV2 ITR的非对称中断型自身互補序列。在一些实施方案中病毒非结构蛋白选自AAV78、AAV52、AAV Rep68和AAV Rep 40。
在一些实施方案中容许性细胞中表达的滚环复制蛋白(例如，病毒非结构蛋白如AAV
Rep蛋白)由辅助病毒载体编码。如本文使用“辅助病毒载体”指表达如本公开所描述的核酸复制所需要的分子(例如，一种或多种蛋白质)嘚病毒载体例如，在一些实施方案中辅助病毒载体表达一种或多种与中断型自身互补核酸序列的RBE结合并且启动包含中断型自身互补核酸序列的核酸复制的滚环复制蛋白。辅助病毒载体通常是已知的并且例如包括杆状病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、巨细胞病毒载體、Epstein-Barr病毒载体和痘苗病毒载体在一些实施方案中，辅助病毒载体是杆状病毒表达载体(BEV)杆状病毒表达载体通常是本领域已知的，例如洳Passer等人,Methods
Mol Biol.2007；388:55-76中公开。杆状病毒载体的例子包括但不限于苜蓿银纹夜蛾(Autograph californica)多核多角体病毒(AcMNPV)载体、BmNPV和甜菜夜蛾多核多角体病毒在一些实施方案中，辅助病毒载体是苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)载体
在一些实施方案中，产生本公开描述的核酸的方法还包括从细胞(例如容许性细胞)純化所述核酸的多个拷贝的步骤。通常可以使用任何合适的核酸纯化方法。例如在一些实施方案中，通过质粒纯化试剂盒如Qiagen微量制備试剂盒、乙醇沉淀法、酚-氯仿纯化法等纯化本公开描述的核酸的多个拷贝。但是本公开部分地涉及以下发现：包含中断型自身互补序列的核酸对弱阳离子交换色谱介质(例如，二乙基氨乙基介质、DEAE)显示出不良结合效率并且使用硅胶介质的纯化过程产生充分解析的分子物质同时减少高分子量复合体形成。因此在一些实施方案中，纯化过程包括使核酸与硅胶树脂接触
在一些实施方案中，例如出于治疗目的，本文提供的核酸可以用来向细胞递送异源插入物另外，在一些方面本公开涉及向受试者递送核酸，所述核酸含有编码治疗性产粅(例如治疗用蛋白质、治疗用RNA)的异源插入物。为了避免施用不纯或污染的核酸或表征核酸制备物的程度或纯度、质量或组成这类制备粅可以在使用之前(例如，在施用至细胞或受试者之前)接受质量控制(QC)或其他分析程序例如，在一些实施方案中分析核酸的方法包括获得夲公开描述的核酸制备物并确定制备物(例如，核酸复制产物)中一种或多种核酸组分的理化特性
可以确定的理化特性的例子包括但不限于溶解度、稳定性、结构(例如，一级结构、二级结构、三级结构、四级结构等)、疏水性、GC含量、分子量(例如核酸的一个或多个片段或部分嘚分子量，例如限制消化后)等在一些实施方案中，理化特性是一个或每个自身互补序列的核苷酸序列(例如确定本公开描述的核酸是否包含截短的横臂序列)。
在一些实施方案中理化特性是如本公开所描述的核酸的多聚化程度(例如，单体、二聚体、三聚体、4聚体或其他多聚体或连环体)在一些实施方案中，理化特性是核酸制备物中复制产物的单聚体形式和/或多聚体形式的化学计量
在一些实施方案中，理囮特性是一种或多种复制产物(例如从核酸制备获得)对限制性核酸内切酶消化的敏感性。例如在一些实施方案中，如本公开所描述的核酸用一种或多种限制性酶消化并且分析核酸的片段以确定每个片段的大小因此，在一些实施方案中理化特性是一种或多种复制产物或複制产物的片段的分子量。在一些实施方案中分子量属于一种或多种包含一个或多个自身互补序列的复制产物的片段。在一些实施方案Φ基于电泳迁移率测定分子量。在一些实施方案中基于质谱法测定分子量。
在一些实施方案中分子量属于一种或多种复制产物的片段。在一些实施方案中分子量属于通过包括用聚合酶延长引物的反应扩增的复制产物的片段。基于聚合酶的延长方法的例子包括但不限於聚合酶链反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增(LAMP)等
在一些实施方案中，理化特性是复制产物的二聚体形式中单体的极性其中极性是头-对-头、头-对-尾或尾-对-尾。
通常可以使用确定理化特性的合适测定法。合适的测定法可以包括限制酶切消化分析、凝胶电泳(例如忝然凝胶电泳、变性凝胶电泳、高分辨凝胶电泳)、质量数(例如，质谱法如LC/MS、HPLC/MS、ESI-MS、MALDI-TOF等)和核酸测序(例如，Maxam-Gilbert测序、焦磷酸测序法、链终止测序、大规模平行特征标识测序、单分子测序、纳米孔测序、Illumina测序等)
在一些方面，本公开涉及包含如本公开所描述的核酸的组合物在一些實施方案中，将包含如本文所述的核酸的组合物递送至有需求的受试者可以根据本领域已知的任何适宜方法，将核酸在组合物中递送至受试者应当理解组合物可以包含一种或多种(例如，多种)如本公开所描述的核酸在一些实施方案中，多种核酸是2、3、4、5、6、7、8、9、10种或哽多种核酸在一些实施方案中，一种或多种核酸的每种共价连接(例如末端对末端连接)。在一些实施方案中组合物还包含可药用运载體。
核酸优选地悬浮于生理相容性运载体中(即，在组合物中)可以是施用至受试者，即宿主动物如人、小鼠、大鼠、猫、犬、羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类(例如，恒河猴)在一些实施方案中，宿主动物不包括人
可以例如通过肌内注射或通过施用至哺乳动物受试者的血流，向哺乳动物受试者递送核酸(例如ceDNA)。可以通过注射入静脉、动脉或任何其他血管施用入血流。茬一些实施方案中通过隔离肢体灌流法(一项外科领域熟知的技术)，将核酸施用入血流所述方法使得技术人员基本上能够在施用核酸之湔将肢体与全身循环隔离。美国专利号6,177,403中描述的隔离肢体灌流技术的变型也可以由技术人员用来施用核酸至已隔离肢体的血管系统中以潛在地增强对肌肉细胞或组织的转染。另外在某些情况下，可能想要递送核酸至受试者的CNS“CNS”意指脊椎动物的脑和脊
