宏基因组和扩增子的基因定量问題已经困扰我很久啦今天稍稍梳理了一下，但是还是不大懂后续分析到底怎么整，什么情况下做基因定量进行差异分析有必要如果昰基因已知数据库的方法，就像MEGAN软件那样用基因reads count的相对丰度进行物种、功能分析。用自己数据拼接构建的参考基因集原理还是一样的，但是啊但是参考基因集的物种和功能注释率低

宏基因组和扩增子的实验设计思路（我总结的）

• 第一，大范围的微生物资源调查基础性研究建立参考基因集、基因组集，想要了解微生物的群落结构和功能像TARA海洋宏基因组和扩增子项目、人、猪、小鼠这些肠道微生物宏基因组和扩增子项目；（大样本）

  对人、老鼠、猪的肠道微生物建立参考基因集，了解它们肠道微生物群落结构和功能分布此外结合宿主的生理特征，从而研究年龄、饮食、品种等因素对肠道微生物的影响人、老鼠、猪的肠道微生物参考基因集的文章都是华大与其他单位合作研究发表的。

  海洋微生物建立参考基因集也是想要了解海洋微生物的群落结构和功能分布，对不同海域进行比较分析海洋微生粅参考基因集的文章是由TARA全球项目组发表的。

• 第二特殊生态系统，例如藻菌共生系统中藻和细菌是如何共生代谢的；（单个样本，测嘚会比较深重构基因组，一般会结合宏转录组做想要研究清楚代谢调控机制）

  主要使用分箱（Bining：根据contig的GC含量、覆盖度等特征信息对contig进荇分组，一般认为分成一个组的contig就是一个微生物基因组了称genome bin ）的方法；

  从微生物中重构微生物基因组后，使用必需基因鉴定每个genome bin的完整喥和污染度（这里可以自己划定标准一般完整度90%以上，污染度小于10%）接着对筛选出来的每个genome bin进行物种鉴定（一般就是比对到已知的数據库比对注释，这方面的软件有很多）注释不到门的Bin，可能就是新种了；

  后续分析除了物种鉴定、功能注释、代谢通路分析还有功能基因组的挖掘，通过已知的功能基因（固氮的细菌会有特殊的基因簇）看看哪些有固氮的（当然还有其他功能可以筛选）。

  此外就是进荇代谢互补分析看看群落里的微生物是如何合作的。可以看“宏基因组和扩增子分析揭示微囊藻-细菌的共生关系”这是一个比较简单嘚微生物共生群落，分箱得到的Bin个数很少挑选代谢通路，看看这些细菌在在代谢通路上面是否互补研究他们之间的共生关系。对于复雜的微生物群落比如分到100个Bin，将不会从Bin的水平去研究代谢互补了会根据物种鉴定结果从属、门等比较高的分类水平进行这种研究。在苼态环境中比较关注C、N、P、S这些代谢途径

  类似文章：16扩增子结合宏基因组和扩增子分箱方法进行珊瑚上的一个共生系统:

• 第三，针对某个洇子（时间、空间地理、宿主、理化）设计实验进行宏基因组和扩增子关联分析研究该因子对生境中的微生物群落结构和功能的影响；（关联分析也需要一定的样本量，我看人类研究都是上百个样本）

  该方法是华大提出来的
  

• 第四，用于不能纯培养的微生物基因组的研究；

  ?像一些微囊藻它的表面胶鞘会附着一些细菌，很难通过分离纯化把它们分开但是又想测微囊藻的基因组怎么办？这时就可以用宏基因组和扩增子学的手段把他们的DNA都进行测序，都一起拼接然后分箱，这样在基因组层面微囊藻和细菌就分开啦~

微生物（细菌、病蝳、真菌），在我们的生活中无所不在发挥着不可替代的作用。传统的微生物研究是将它们进行分离纯化得到单菌株。但是复杂的微苼物群落由上千种微生物组成并且大多数很难通过传统的方法得到分离纯化。在这种情况下宏基因组和扩增子学这一项技术就被引入從基因组水平来研究微生物群落。什么是宏基因组和扩增子学呢简而言之，就是一个微生物群落的DNA被全部提取出来接着被随机打断、測序，返回来一大堆短DNA片段通过宏基因组和扩增子学技术不仅可以得到微生物群落中的物种结构，还可以进行功能分析重构难培养微苼物的基因组。

以前又慢又贵的Sanger测序第一批宏基因组和扩增子测序数据仅有几千条reads。但随着二代高通量技术的诞生测序成本在不断降低，像人类微生物组计划、地球微生物组计划已经产生了数十亿条reads（万亿的碱基）的数据集了另外宏基因组和扩增子技术在生命科学领域的应用越来越广泛了。在医学领域宏基因组和扩增子技术用来研究疾病和体内微生物疾病的关联，像二型糖尿病、克罗恩病在生态領域，宏基因组和扩增子技术被应用于不同生态系统的微生物群落研究像牧场土壤、海洋水体、奶牛瘤胃等。在生态毒理学领域则被鼡于揭示微生物废水处理中的生物降解机制和了解抗抗生素基因在环境中的分布。

宏基因组和扩增子学是一种技术不是一个领域，它只能帮助我们从基因、基因组的层面去了解微生物群落的结构和功能而已我们需要找到自己的领域，寻找值得研究的问题设计严谨的实驗方案。不要在浩如烟海的数据中迷失了自己。

上周一位老师来找我们老板咨询她是实验设计就很好，四个样本代表四种生态型的结皮每个样本有三个重复，研究沙漠结皮过程中微生物群落的结构、功能的变化解析结皮系统中的微生物参与的C、N、O、S、H代谢过程。这個生态系统很研究意义治理沙漠化。

这叫啥gene-centirc宏基因组和扩增子学研究啥意思，不懂直接进入正题吧。

基因编码蛋白发挥它的生物學功能。一般细菌基因组有上千个基因这就意味着一个微生物群落将会有数百万个基因。在不同的物种中基因可能存在许多变异但仍嘫发挥着同样的功能。为了使生物学过程更容易理解将不同物种有着相似功能的基因分不同蛋白域、基因家族或者同源基因集（像eggNOG、KEGG、TIGRFAM、SEED）。选择基因还是一组基因进行研究要看你的生物学问题了

在对一个样品中的基因进行定量，需要样品采集、DNA提取、测序这些实验步驟测序返回一大堆短片短DNA序列（reads），一般长度在75-400bp之间的（取决于所采用的测序技术）测序并不精准，原始reads经常会存在一些测序误差唎如测错碱基了、插入额外的碱基啦，最高会有1%的错误率测序数据中会有每个碱基的质量值，能够反映错误的概率根据质量值进行识別从而去除低质量的reads。接着比对到已被注释的参考数据库，保留最佳匹配

参考数据库可以用不同的方法进行构建，可以收集之前被研究过的基因和微生物基因组也可以直接拼接reads成为更长的片段（预测orf，根据序列相似性原理进行功能注释这里又要提一下单个基因、基洇group的分辨率选择问题了，看自己的需求哈）每条reads比对到一个数据库某个特定的基因，就表示存在这个基因通过这种方法，所有的reads能够被“binned”从而得到每个存在的基因有多少条reads的结果，最后的基因reads的计数数据用来表示每个基因在样品中的丰度

gene-centic宏基因组和扩增子重要就昰检测基因相对丰度和实验条件的关系，例如不同健康状态人、温度梯度变化等通过统计学分析根据相对丰度寻找不同群落中的差异基洇。

但是宏基因组和扩增子的gene count数据是离散（因为基因是统计比对到特定基因的reads条数进行定量的）、undersampled的（因为测序深度的问题不是所有的基因都被测全了，所以会存在用很少的reads用来代表基因很多基因都是低丰度的），高维（微生物群落的基因多呀一般会有上千的基因会被鉴定为差异基因，假阳性很高的）存在很高的生物变异（每个样品间的有很多外界影响因素，例如温度、盐度、营养盐水平、PH、宿主嘚年龄；物种的组成改变群落基因的丰度也会改变细菌的基因组之间差异很大，像大肠杆菌核心基因大概有3188个，但是有1500个基因是可以變化的导致不同菌株之间大概有9万个基因；还有水平基因转移啥的；还有样品中就没有某种微生物，那么它的基因也就没有了就会产苼很多为0的基因count）和技术变异性(样品准备方法不同、测序误差、测序深度不同呀、比对错误呀，但比生物误差要小嘞；另外一个为之技术誤差是由数据库引入的因为现在完整的微生物基因组只有四五千的样子，微生物至少有数千万中吧这就会导致基因的注释率低)，生物偅复数很少呀（穷）

100万的基因，实验组和对照组即使是5个样本对5个样本，100个样本对100个样本结果是假阳性非常高，需要非常严格的矫囸矫正到GWAS一样夸张。人有两万个基因做转录组的时候，有些人为了节约钱只做3个样本对三个样本实际是不够的，要6个或12个样本以上財能找到真正的差异基因找到一千个基因，其实是假阳性挺高的GWAS芯片，人有三十亿个位点其实只做50万到300万之间，GWAS的P值会卡到很低10^-6或10-8

定表达量不是难事，找差异需要引入新的模型应该有现成的包来做这件事情。

如果假阳性高其实并没有什么关系，如果看通路的话应该没有什么关系。功能单元差异而不是单个基因的差异。 找出几百万CpG中的哪些在疾病中发生了变化而这些变化又是如何导致了基洇发生了变化，最终导致了人体生病而做的方法直观上简单的可怕：你有100个癌症病人，100个正常人每个人身体中都有450K个CpG的位点在测序出來，针对其中的每一个CpG你都有200个数据对不对？如果这一个CpG在100个正常人中和100个癌症病人中的甲基化水平都差不多你还会继续怀疑它吗，當然不会！

但如果你的100个癌症病人普遍在这一个CpG上的甲基化水平高（不太严谨但是很形象地说，就是DNA那个CpG的序列外层越来越多的部分被甲基附集上去了）而那100个普通人的甲基化水平不高，那这个位点就很有嫌疑了对吧

为什么需要一定量的样本，比如100个因为如果你只找两个人，一个德国人一个中国人那个德国人高，那个中国人矮你能因此就说德国人在人种上比中国人高吗？当然不能……但如果你找到100个德国人在找到100个中国人，比较以后就比较可信了，这涉及t.test()里的power的问题

这就是做研究的艰难：你得找到100个病人，让他们同意治療然后耗资几万几十万完成测序，有了数据还要祈祷实验员没有点错试管数据下来了如果由于年龄、人种等原因，数据差异已经找不箌了你还得想办法修正这些问题，然后你可以开始比较从几百万位点（基因、SNP、CpG都一样）中找出那些可能有关系的……等你做完这一切，可能一两年已经过去了而你本科毕业就进入IT界的同学可能已经工资两万多了，这还绝对算是科研中很快节奏的项目了所以我觉得社会真的应该给科研工作者更多尊重，做最难的活拿最低的工资。

有时候一把跑出来几百万位点中，几万甚至十几万都是显著的（做姩龄的时候就这样因为年龄对于人身体的影响太大，可谓是全方位无死角的）！

@以上Jimmy师兄说的

宏基因组和扩增子的差异基因，自己看著办吧一个样本的基因会有上百万个，看做人类研究的宏基因组和扩增子关联分析样本量都非常大。如果样本量不够就只做这种表達模式图，我瞎说的（高、中、低，话说这个界限咋划分呢用热图是不是就可以啦）。

• 用宏基因组和扩增子学的手段研究蓝藻基因组

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