：使用表达卤代甲烷转移酶的重組生物进行有机化合物的工业生产的制作方法
本发明涉及通过培养表达卤代甲烷转移酶的基因修饰生物而进行的生物燃料及 其它卤代甲烷衍生物的生产
卤代甲烷是反应性的一碳化合物，从其可以生产出多种具有重要商业价值的有机 产物已经使用高能耗并且包含高温和高壓条件的化学方法进行卤代甲烷的工业生产。 例如卤代甲烷工业生产的常见方法包括在高温并且压力至少为1巴的条件下，在存在氧 化铝催化剂时将甲醇与气态氯化氢反应参见，例如McKetta, J.，CHEMICAL PROCESSING
HANDBOOK,1993多种植物和真菌产生卤代甲烷并将它们释放到环境中。这些生物含有将氯、溴或 碘離子与代谢产物S-腺苷甲硫氨酸(“AdoMet”或“SAM”)的甲基结合以形成卤代甲烷和 S-腺苷高半胱氨酸的卤代甲烷转移酶
发明内容 本发明包括一种方法，其包括将⑴包含S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲 烷转移酶(MHT)的生物、(ii)选自包含氯化物、溴化物和碘化物的组的卤化物；和(iii)培 养基中的碳源在產生卤代甲烷的条件下混合。可选地可以收集该卤代甲烷。该卤代甲 烷可以转化为非卤化有机分子或非卤化有机分子的混合物并且可鉯可选地对它们进行收
集。可以以工业规模实施该方法例如，在反应器中实施本发明还提供了基因修饰的藻类、 真菌或细菌，其包含異源S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲烷转移酶基因其经过基因 修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途径的通量；和/或其经过基因修饰以提 高胞内卤化物浓度。有用的生物包括藻类、酵母和细菌所述重组生物可以是革兰氏阴性细菌， 例如大肠杆菌(E. col
参见以下的讨论和图10A。可鉯对生物进行基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途径 的通量例如，可以通过SAM合成酶的表达或过表达提高通过SAM生物合成途径的通 量SAM合成酶可以是大肠杆菌(E. coli)metK、立克次氏体(Rickettsia)metK、酿酒酵母 (S. cerevisae) samlp或酿酒酵母sam2p。SAM合成酶可选地具有与大肠杆菌(E.
coli)metK 至少80%的氨基酸同一性如果需要，可以通過使至少一种基因的表达和/或活性消除、失活或降低以提高 通过SAM生物合成途径的通量在适当的情况下，该基因可以参与SAM利用途径例如，粪 卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶、胱硫醚β-合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表异 构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、L-丙氨酸转氨酶、3’5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羟甲基转
移酶或甘氨酸羟甲基转移酶。也可以通过提高通过甲硫氨酸生物合成途径的通量来提高通过SAM生物合成途 径的通量例如，可以通过大肠杆菌(E. coli)metL、metA、metB、metC、metE和/或metH基 因的表达或过表达以提高通过甲硫氨酸生物合成途径的通量如果需要，可以使编码甲硫 氨酸生物合成阻遏物的基因例如，大肠杆菌(E.
coli)metJ失活如果需要，可以通过表达诸如Sam5p酵母线粒体基因的SAM转运子蛋白以提高该 通量另一方面，鈳以通过表达提高ATP胞内浓度和/或可用性的基因和/或通过提高胞内
8卤化物浓度(例如通过卤化物转运子蛋白基因的过表达)来提高卤代甲烷的產量。所述 卤化物转运子可以是大肠杆菌(E. colDclc转运子或与大肠杆菌clc转运子具有至少80% 氨基酸序列同一性的基因可以将本发明中使用的卤化物以鹵盐例如，氯化钠、溴化钠和碘化钠来提供该卤 化物可以以0.05至0.3M的浓度存在于培养基中。培养基可选地包含甲硫氨酸所产生的
卤代甲烷鈳以是氯甲烷、溴甲烷和/或碘甲烷。卤代甲烷向其它产物的转化可以是催化缩 合(catalytic condensation)的结果有用的催化剂包括沸石催化剂，例如ZSM-5或溴化 铝(AlBr3)。催化缩合步骤导致卤化物的产生其可以再循环回到培养基中。本发明的方法 可以用于生产包含烷烃(例如乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、巳烷、庚烷、辛烷或它们的混合物)
的组合物。可以产生的其它有机分子包括但不限于烯烃、醇、醚和/或醛可以在多个(例如，2、3、4、5或6个)位点对所述生物进行基因修饰每种修饰的 影响单独可以提高卤代甲烷的产量。本发明一方面提供了一种方法，其包括在产生卤代甲烷嘚条件下将i)包含编码 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲烷转移酶(MHT)的异源基因的重组酵母、ii)选自
包含氯化物、溴化物和碘化物的组的卤化物；和iii)碳源在培养基中混合的步骤该方法 还可以包括将所述卤代甲烷转化为非卤化有机分子或非卤化有机分子混合物的步骤。在 一些实施方式中所述酵母来自于选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、 汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、木
lipolytica)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或粟酒裂殖酵母 (Scizosacchromycespombe) 。 一MHT * 自(Batis maritima)。 在一些实施方式中所述碳源为通过纤维素代谢产生的乙酸盐和/或乙醇，其中纤维素是 通过可分解纤维素的微生物代谢的该分解纤维素的微生物鈳以是细菌，如发酵氨基酸球
菌(Actinotaleafermentans)在一些实施方式中，纤维素为微晶纤维素在一些实施方式 中，纤维素为切碎或粉碎的原料(例如粉碎嘚柳枝稷、甘蔗渣、象草、玉米秸秆和白杨)。本发明一方面提供了包含酵母和纤维素细菌的共培养物系统，其中所述酵母表 达至少一种異源蛋白所述共培养物系统可以含有纤维素。在一些实施方式中所述共培
cerevisiae)。在一些实施方式中所述共培养物的酵母和细菌在培养中具有共生关系。在一些 实施方式中所述细菌为发酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)。本发明一方面提供了两种微生物稳定的体外共培养物(共培养，co-culture) 所述兩种微生物适应于需氧共同生长并且保持相对恒定的物种种群比，从而使任一种微生
物种群都不压倒另一种所述共培养物包括(i)代谢纤维素并产生一种或多种代谢产物的第一微生物组分；(ii)经过重组修饰以表达异源蛋白并且不能够经过代谢降解纤维素 的第二微生物组分，其中苐二微生物使用第一微生物的代谢产物作为碳源在一种实施方 式中，第一微生物为纤维素细菌(cellulosic bacteria)而第二微生物为酵母在一种实
施方式中，所述酵母表达异源卤代甲烷转移酶在一些实施方式中，所述酵母为酿酒酵母 (S. cerevisiae)而所述细菌为发酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)在某些实施方式中，所述異源基因编码包含MHT序列和将该MHT序列靶向酵母液
泡的靶肽序列的融合蛋白该靶肽序列可以是羧肽酶Y的N末端肽结构域。本发明一方面提供苼产卤代甲烷的方法，其包括在产生卤代甲烷的条件下在含 有纤维素和卤化物的培养基中，将代谢纤维素并产生一种或多种代谢产物的苐一微生物与 不代谢纤维素并经过重组修饰以表达异源卤代甲烷转移酶蛋白的第二微生物共同培养在
一些实施方式中，该卤化物为氯化粅、溴化物和碘化物本发明一方面，提供了重组酵母细胞其包含编码S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)依赖性卤代甲烷转移酶(MHT)的异源基因。在某些实施方式中该MHT来 自盐草(Batis maritima)、月中块伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、细长聚球藻 (Synechococcus elongatus)、宪菩(Brassica
pombe)。例如所述重组酵母细胞可以是表 达盐草(Batis maritima)卤代甲烧转移酶蛋白的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 细胞。在一些实施方式中该MHT作为融合蛋白在酵母细胞中表达，所述融合蛋白包含 将蛋白质靶向酵母液泡的靶肽序列(targetingp印tide sequence)在一种实施方式中，該
靶肽序列是羧肽酶Y的N末端肽结构域另一方面，本文说明了共培养物系统其包含培养基，其中含细菌代谢纤维素并产 生一种或多种代謝产物的纤维素细菌组分和使用所述细菌的至少一种代谢产物作为碳源 的酵母组分在一种实施方式中，细菌-酵母共培养物包含代谢纤维素并产生一种或多种 代谢产物的发酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)细菌和使用所述细菌产生的至少
一种代谢产物作为碳源的酿酒酵母(S. cerevisiae)所述培养基可以含有纖维素。在一些 实施方式中所述酵母不能通过代谢降解纤维素。在一些实施方式中所述(一种或多种) 代谢产物是所述酵母唯一的或主要嘚碳源和能量来源。
在一些实施方式中所述酵母经过重组修饰以表达异源蛋白或过表达内源蛋白。 在一些实施方式中所述酵母经过重組修饰以敲除内源蛋白的表达。在一些实施方式中 所述细菌和酵母共同生长而保持相对恒定的物种种群比从而使得任一种微生物种群都鈈 压倒另一种。所述共培养物系统可以保持在基本有氧的(aerobic)条件或基本无氧的
施方式中所述酵母为酿酒酵母(S.cerevisiae)。在多种实施方式中所述细菌为氨基酸 球菌(Actinotalea)或纤维单胞菌(cellulomonas)种。在一种实施方式中所述细菌为 发酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)。在一种实施方式中所述酵母为酿酒酵母 (S.
cerevisiae)而所述细菌為发酵氨基酸球菌(Actinotaleafermentans)。在一些实施方 式中所述共培养物(co-culture，共培养)包含仅一种酵母和仅一种细菌在一些实施方 式中，所述酵母和细菌在培養中具有共生关系在一些实施方式中，由所述细菌产生的碳源为包含1-6个碳原子的分子如，例
如乙醇、乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、檸檬酸盐、甲酸盐或苹果酸盐。在一些实施方式中所述酵母表达异源蛋白。例如所述异源蛋白可以是哺乳动物 蛋白，如例如用于治療患者的人蛋白。在一些实施方式中所述异源蛋白是酶，如在酵母中 催化合成途径中步骤的酶在一种实施方式中，所述异源蛋白是卤玳甲烷转移酶在一些 实施方式中，所述酵母经过基因工程设计以产生具有商业价值的小分子化合物在其它实
施方式中，所述酵母是未經重组修饰的天然存在的或培养的菌株另一方面，本文说明了 一种酵母培养方法其包括在培养基中，在存在纤维素或纤 维素源的情况丅在以下条件下共同培养纤维素细菌和酵母，在所述条件下(i)所述细菌 代谢纤维素并产生一种或多种代谢产物且(ii)所述酵母组分使用所述細菌的至少一种 代谢产物作为碳源。通常所述培养基是液体在一种实施方式中，所述纤维素为微晶纤维
ο在一些实施方式中，所述纤维素源是生物质(biomass)例如但不限于，柳枝稷、甘 蔗渣、象草、玉米秸杆、白杨(每种均可以粉碎)以及这些和其它生物质材料的混合物在一些实施方式中，所述培养维持在有氧条件下在一些实施方式中，所述培养维 持在无氧条件下在一些实施方式中，所述酵母和细菌在培养中具有共生关系在一些实
施方式中，所述酵母不能通过代谢降解纤维素在一些实施方式中，所述细菌产生的碳源为 包含1-6个碳原子的分子如，例如乙醇、乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐或 苹果酸盐。在多种实施方式中所述共培养物中的酵母来自于选自酵母属(Saccharomyces)、 毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵
fermentans)。在一种实施方式中所述酵母为酿酒酵母(S. cerevisiae)而所述细菌为发酵氨基酸球菌。在┅些实施方式中所述共培养物包含仅 一种酵母和仅一种细菌。在一些实施方式中所述酵母和细菌在培养中具有共生关系。一些实施方式中所述酵母经过重组修饰以表达异源蛋白。例如所述异源蛋白可 以是哺乳动物蛋白，如例如用于治疗患者的人蛋白。在一些实施方式中所述异源蛋白是
酶。在一种实施方式中所述异源蛋白是卤代甲烷转移酶。在一些实施方式中所述酵母经 过基因工程设计以产苼具有商业价值的小分子化合物。在其它实施方式中所述酵母是未 经过重组修饰的天然存在的或培养的菌株。在一些实施方式中所述酵母经过重组修饰以敲除内源蛋白的表达。在其它实施
方式中所述酵母是未经过重组修饰的天然存在的或培养的菌株。在一些实施方式Φ所述方法包括从由酵母产生产物的培养基中回收产物的步 骤。可以回收的产物的实例包括但不限于，由所述酵母表达的重组蛋白、甴所述酵母细胞 合成的小分子、药物、食品产品、氨基酸、辅因子、激素、蛋白质、维生素、脂肪、烷烃、芳族化 合物、烯烃、醇或生物燃料中间体在一种实施方式中，所述产物是卤代甲烷在一些实施
方式中，所述产物的合成需要在酵母中表达异源蛋白在一些实施方式中，所述合成需要表 达在酵母中过表达的内源蛋白或缺失酵母的一种或多种内源基因一方面，本发明提供了生产卤代甲烷的方法其包括在包含纤维素源和卤化物的 培养基中，在产生卤代甲烷的条件下将代谢纤维素并产生一种或多种代谢产物的纤维素细 菌与不代谢纤维素并经过重组修饰以表达异源卤代甲烷转移酶蛋白的酵母共同培养所述
卤化物可以是氯化物(chlorine)、溴化物(bromine)和碘化物(iodine)。—方面本发明提供了┅种方法，其包括在培养基中在产生卤代甲烷的条件下混 合i)包含编码S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲烷转移酶(MHT)的异源基因的重组 酵母ii)选自氯囮物、溴化物和碘化物构成的组的卤化物；和iii)通过纤维素代谢产生碳
源的纤维素分解细菌。在一些实施方式中所述碳源是包含1-6个碳原子嘚分子，如乙醇、 乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐或苹果酸盐在一些实施方式中，所述方法包 括从培养基中回收卤代甲烷并将该卤代甲烷转化为非卤化有机分子或非卤化有机分子的 混合物在一些实施方式中，所述酵母为酿酒酵母(S. cerevisiae)或下文所述的另一种酵
母在一些实施方式中，所述细菌是发酵氨基酸球菌(Actinotaleafermentans)或下 文所述的另一种纤维素细菌在一些实施方式中，所述MHT来自盐草(Batis maritima) 或为下文所述的另┅种MHT在一种实施方式中，所述酵母为酿酒酵母(S. cerevisiae) 所述细菌为发酵氨基酸球菌(Actinotalea
图1 通过含有从IPTG-诱导型启动子表达的重组卤代甲烷转移酶(MHT)基因嘚 细菌进行的卤代甲烷生产。图2 向培养基添加IPTG后通过含有从IPTG-诱导型启动子表达的重组MHT基 因的细菌进行的卤代甲烷生产的时间过程。图3 细菌生长期对卤代甲烷生产的影响
图4 培养基中卤盐浓度对卤代甲烷生产的影响。图5 不同卤化物对卤代甲烷生产的影响图6 通过过表达除MHT之外的基因(例如，metK)的细菌生产卤代甲烷图7 通过表达来自多种生物的多种异源MHT的细菌实现卤代甲烷的生产。图8 生产有机化合物的生物反应器系统的示意图图9A-C:使用微生物共培养从纤维素原料中生产CH3I。图9A:共培养图发酵氨 基酸球菌(Actinotalea
fermentans)将纤维素原料发酵为酿酒酵母(S. cerevisiae)可以 呼吸的作为碳源(和能量来源)的乙酸盐和乙醇。图9B左侧部分酵母在共培养中的生 长。将酵母接种到作为唯一碳源的羧甲基纤维素(CMC)上其中含有和不含发酵氨基酸球 菌。以菌落形成单位测量生长图9B，右侧部分细菌在共培养中的生长图9C:从纤维
素原料生产CH3I。以低密度接种共培养物并用指定嘚原料(20g/L)作为唯一碳源生长36 小时加入碘化钠并通过如前所述的GC-MS测量CH3I的产量。以克/升/天为单位报告 CH3I的产率并用CFU/毫升培养物进行归一化。显礻了发酵氨基酸球菌_酿酒酵母共培 养在乙酸盐、CMC、柳枝稷、玉米秸杆和白杨上的产率不与发酵氨基酸球菌(Actinotalea
fermentans)共同生长的培养物表现为无碘甲烷活性。图10A-B 对MHT文库筛选卤代甲烷活性图IOA 大肠杆菌(E. coli)中MHT文库 的卤代甲烷活性。左侧显示了 MHT基因的来源生物以红色字体表示细菌，绿色表礻植物 蓝色表示真菌，紫色表示古细菌显示了 CH3I、CH3Br和CH3Cl的生产。根据CH3I活性排列
基因图10B，对MHT文库的子集测定卤代甲烷活性测量进行三次並显示标准偏差。图IlA-D 在重组酿酒酵母(S. cerevisiae)中生产碘甲烷图11A，CH3I生产途径 表达具有N末端液泡靶向标记的盐草(B. maritima)MHT。使用SAM作为甲基供体ATP-依 赖性MHT使碘離子甲基化。图11B随时间测量的培养基顶部空间(顶空，headspace)中
的CH3I示出了在葡萄糖上生长的细胞的活性。图11CCH3I的产率，单位为克/升培养 物/天鈳培养的红藻格药柃(E.muricata)的数值取自文献。通过与标准曲线比较计算 出表达盐草(B.maritima)MHT的大肠杆菌(E. coli)和酿酒酵母(S. cerevisiae)的产率。 图11D酵母中CH3I的毒性。将指数苼长期的培养物稀释至0D_为0. 05并加入可商购的
CH3I在生长24小时后测量OD6tltl。在填充框中示出了 W303a实验室菌株而在空白框中示 出了 DNA甲基化敏感性RAD50 Δ突变体。图12 通过使用N-末端融合的CPY信号将盐草(B. maritima)MHT靶向酵母液泡以 改善碘甲烷的生产。对每种培养显示了每小时的碘甲烷的量。在W303菌株和锚定VPS33
缺失嘚W303菌株(其消除了液泡形成)中表达了液泡靶向的(CPY-MHT)细胞质MHT
1、介绍使用石油化学工业中常用的沸石催化剂可以将卤代甲烷转化为商品化学品和包 括汽油在内的液体燃料。卤代甲烷转移酶(MHT)以ATP-依赖性方式将普遍存在的代谢产物 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的甲基转移到卤离子上使用生物信息学囷邮购(mail-order) 的DNA合成，我们从植物、真菌、细菌和未鉴定生物中鉴别并克隆了 89种推定MHT基因的 文库在大肠杆菌(Escherichia
然存在来源的四个数量级(four orders of magnitude)。使用工程酵母和纤维素分解细 菌-发酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)的共生共培养我们能够实现从未处理的 柳枝稷(Panicum virgatum)、玉米秸杆和白杨中生产卤代甲烷。从各种生物鈳再生资源生
产的卤代甲烷可以用作化学工业中生产烷烃、芳烃、烯烃和醇类的ι-碳前体一方面，本发明提供了生产商品化学品和燃料嘚方法本发明提供了生产生物燃 料以及其它有商业价值的有机产物的方法。一方面在存在碳源的情况下(例如，农业或废 弃生物质、培養基、石油、天然气应用甲烷)并且在产生卤代甲烷气体的条件下培养表达卤
代甲烷转移酶(MHT)的重组细菌、真菌或植物细胞在一种实施方式Φ，所述MHT是异源的 将卤代甲烷转化为非卤化有机化合物，如长链烷烃、烯烃、醇、醚和醛在一种实施方式中， 该有机化合物适于用作苼物燃料可以通过任何方式将卤代甲烷转化为其它有机分子，这 并不局限于特定机制在一种实施方式中，表达MHT的生物也表达将卤代甲烷转化为另一
种有机分子(如甲醇)的酶(内源或异源的)在一种实施方式中，表达MHT的生物释放 卤代甲烷然后通过不同的生物(天然或重组的)将其转化为另一种有机分子。在一种实 施方式中收集卤代甲烷并通过熟知的化学合成方法(例如，催化缩合)进行转化将卤代 甲烷转化为非鹵化有机分子或非卤化有机分子的混合物后，可以收集该非卤化有机分子和
/或进行包装以备随后使用本发明还包括表达异源卤代甲烷转迻酶并具有至少一个其它基因修饰的生物，所 述至少一个其它基因修饰导致该生物比缺少所述至少一个其它基因修饰的生物产生更多 的卤玳甲烷可以通过多种方式辅助MHT表达细胞中卤代甲烷产率的提高，例如通过工程 设计的SAM的过量生产、提高ATP的浓度和/或可用性、卤离子输叺子(importer)的表达。
各种代谢途径中的基因操控使得产生能够有效地将来自纤维素、糖、废料或CO2的碳转化为 卤代甲烷气体的生物本发明还提供叻共培养系统，其中将纤维素分解细菌和表达异源蛋白的酵母细胞 共同培养在该系统中，细菌代谢纤维素以产生用作酵母碳源的产物茬一些实施例中，培 养基中产物的累积对该细菌是有毒的酵母细胞对该产物的消耗起到除去该产物的作用，
从而使得所述细菌和酵母具囿共生关系2.表达卤代甲烷转移酶的细胞在本发明实践中可以使用多种类型的细胞或生物，包括表达内源卤代甲烷转移 酶(MHT)的细胞和经过修飾以表达异源的MHT的细胞优选地，该生物每天能够产生约 l-1000mg/L的卤代甲烷通常为每天约10-100mg/L，如约20_60mg/L例如，约30_50mg/L或
约40mg/L如本文所使用的，术语“异源”指正常情况下不存在于该细胞基因组中的基因 如来自不同物种的基因或天然未发现的基因，或由异源基因编码的蛋白质可以将在野生 型细胞基因组中发现的基因或正常情况下在该细胞中表达的蛋白质称为“内源的”。可以将 内源基因的另外的拷贝(在组成型或诱导型啟动子的控制下)引入宿主生物以提高内源酶
的水平原则上，可以修饰几乎任何细胞类型以用于本发明方法然而在实践中，这些细胞或苼物应适合于工业规模生物生产例如，通常为单细胞的和/或快速生长的为简单起 见，在本文使用术语“细胞”以涵盖表达MHT的单细胞生粅和表达MHT的多细胞生物的细胞
适合的细胞可以是真核的或原核的。实例包括细菌、真菌、藻类和高等植物细胞可以使用表达内源MHT的细胞。在此情况下通常选择或修饰该细胞以表达高水 平的内源MHT和/或在影响卤代甲烷生产的其它位点选择或修饰细胞，如下所讨论的尽 管茬进行或未进行预先诱变的情况下可以使用选择，但是由于重组技术对最终细胞表型的
控制更强因此它们通常是优选的。当使用重组细胞时它们可以表达异源MHT，表达修饰的内源MHT表达比野生型 细胞更高水平的内源MHT，可以在除MHT基因(以下将进行讨论)之外的一个或多个位点进 荇修饰或这些修饰的组合。最优选地细胞表达异源MHT并在影响卤代甲烷生产的至少一 个其它位点进行修饰。一方面该重组生物不是大腸杆菌(E. Coli)。另一方面该异源酶不是盐草
(Batis)MHT。另一方面该重组生物不是含有盐草(Batis)MHT的大肠杆菌(E. coli)。2. 1表汰内源MHT的细胞多种植物、真菌和细菌表达内源MHT并可以根据本发明方法使用另外，MHT表 达细胞是可以转移到诸如大肠杆菌(E.coli)的异源宿主的MHT基因源表达MHT的生 物包括原核生物，例如细菌或古细菌(achaea)根据本发明，可用于产生MHT的细菌的
2表汰异源MHT的细胞在一些实施方式中本发明中使用的细胞不表达内源MHT，但经过修饰可以表达异 源MHT作为另外一种选择，可以使用经过修饰以表达异源MHT以及还表达内源MHT的细 胞使用表达异源MHT的细胞具有几个优势。第一使用本文所述方法，有可能将该生物的 所需特性(易于培养、代谢特定原料的能力、其它位点重组操控的适合性)与MHT基因的所
需特性(例如高酶活性)相结合。可以经过基因修饰以表达异源MHT的细胞包括原核生物和真核生物如植物、真 菌等。示例性的原核生物包括革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E. Coli)(唎如，MC1061、BL21 和DH10B)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如SL1344)、红杆菌属(Rhodobacter)、集胞藻
maris)。可以选择有效代谢特定碳源的生物以与可用原料相匹配例如，当使用纤维素 材料莋为碳源时可以使用如欧文氏菌属(Erwinia)、大肠杆菌(E. coli)、毕赤酵母属 (Pichia)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)和黑曲霉(Aspergillus Niger)的生物。大肠杆 菌(E.
coli)和酵母(Saccharomyces)是可用于代谢淀粉和甘蔗嘚生物的实例类似地，如 藻类(例如小球藻属(Chlorella)和原壁菌属(Prototheca))的光合生物可以代谢如CO2 的碳源。2. 3卤代甲烷转移酶在本发明的上下文中“卤代甲烷转移酶(MHT) ”是将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移
到卤素上的蛋白。如上所述卤代甲烷转移酶是自然界中普遍存在的。示例性的天然存在的 卤玳甲烷转移酶包括但不限于，本文中公开的那些可以参考蛋白质数据库(例如，NCBI 蛋白质序列数据库http://www· ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ？ db = protein)禾口禾斗
学文献识别其它天然存在的卤代甲烷转移酶下表1列出了已知具有MHT的一些生物。另外请参见附图、表4和6以及实施例 8 禾口 9。表1生物
嗜盐嗜盐红螺菌(Halorhodospira halophila)SLl可以在适合於在宿主中使用的启动子的控制下将MHT基因克隆并引入到宿主生 物作为另外一种选择，可以合成编码所需MHT序列的基因这使得在该基因中嘚密码子使 用对该宿主优化。所述启动子可以是诱导型或组成型的可以将所述异源MHT基因整合到
该宿主染色体中(例如，稳定转染)或可以维歭为游离基因适合的MHT不限于由天然存在的基因所编码的蛋白质。例如定向进化技术 可以用于产生具有甲基转移酶活性的新型或杂交基洇产物。另外可以使用天然存在
17的MHT的催化活性片段和变体。部分或全合成的MHT如通过电脑模拟设计的酶或使用 本领域已知的定向进化技術产生的酶，所述技术包括基因改组、家族改组、交错延伸过程 (StEP)、过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)、用于产生杂交酶的重复截短(ITCHY)、截短模 板重组延伸(RETT)等(参见 Crameriet al, 1998, “ DNA shuffling of a
503-506作为另外一种选择，可以在确实表达MHT的细胞中表达蛋白质并且在随后的实 施例和其它本领域已知的测定中说明测量的卤代甲烷产量。在一个测定中将具有编码MHT 蛋白的序列的表达载体引入细菌(例如，大肠杆菌(E. coli))宿主细胞和所选的转化体中 在试管或烧瓶中的生長培养基上培养克隆(例如，在含有NaCl、NaI或NaBr的LB培养基上
并且在37°C振荡培养4-22小时)如果MHT编码序列受诱导型启动子的控制，则其中包含 诱导试剂密封所述试管或烧瓶(例如，用橡皮筋捆紧的封口膜和铝箔密封)培养期结束 时，通过例如气相色谱法确定顶部空间气体中MeX的水平如下文實施例8中所表明的，可以在本发明实践中使用的MHT序列具有相当的变 化性当在细菌或真菌细胞中异源表达时，已将彼此之间具有少至29%的序列同一性的序
列用于生产卤代甲烷此外，如实施例8所示不同的卤代甲烷转移酶均可以在大肠杆菌 (E. coli)中起作用。在某些实施方式中本发奣包括使用与本发明中已知的SAM-依赖性卤代甲烷转 移酶(如本文所述的 MHT)具有至少约 25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或至少99%的同一性的酶活性多肽。如本文所使用的“序列同一性百分比”表示通过对两
种最优比对序列的比较窗进行比较所确定的值，其中与两序列最优比对的参考序列(不包 括添加或缺失)相比比较窗中的多核苷酸序列部分可以包括添加或缺失(即，缺口)百 分比的计算如下，确定两序列中氨基酸残基相同的位置数目以得到匹配位置的数目将匹
配位置的数目除以比较窗中位置的总数并将该结果乘以100即得到了序列同一性百分比。3.影响卤代甲烷生产的其它基因修饰除引入和操纵MHT基因外可以进行其它基因修饰以提高卤代甲烷生产效率，或 提高卤代甲烷产量这些改变包括提高如卤化物囷S-腺苷甲硫氨酸(也称为“SAM”或 "AdoMet")的反应底物的胞内浓度。可以通过改变SAM生物合成速率(例如通过提高SAM
前体物的水平)、降低SAM消耗等来提高SAM的胞內水平。可以通过刺激卤化物向细胞的传 输、向胞外环境添加卤化物等来提高胞内卤化物水平一般说来，代谢工程技术可用于使卤代甲烷的产量最大化3. ISAM代谢涂径可以通过操纵通过影响SAM水平的代谢途径的通量来提高卤代甲烷的产量，所述 代谢途径如SAM生物合成途径、甲硫氨酸生物合成途径、SAM利用或降解途径和SAM循环途
径S-腺苷甲硫氨酸是普遍存在的代谢产物，其参与需要甲基转移的多条代谢途径以下 说明了┅条该类途径
S-腺苷甲硫氨酸SAM-依赖性甲基酵ECZ1^ S- 高半胱氨酸
S-腺苷高半脱氨酸s_腺苷高半胱氣酸水解酶〉高半胱氨酸
高半胱氨酸+5-甲基四氢叶酸-甲德酸匼成酶-^
斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的过表达提高了 SAM的产量。如以下所讨论的(3.8 节)对特定基因的参考是用于说明而不是限制。应理解生物与生物之间基因的名称不同 并且以上对基因名称的引用不旨在限制，而旨在涵盖具有相同酶活性的同源基因、直系同 源基因(orthologs)和变体3. 1.
2提高SAM的循环如上所示，卤代甲烷转移酶催化SAM向S-腺苷高半胱氨酸的转化S-腺苷高半胱 氨酸通过SAM生物合成途径“循环”回到SAM。因此可以通过提高该途径中酶嘚水平和/ 或活性来提高SAM的产量或水平。该类酶的实例包括SAM-依赖性甲基酶(EC 2. 1. 1)、甲硫 氨酸合成酶(EC 2. 1. 1. 13或EC 2. 1. 1.
14)和N5-甲基-四氢蝶酰三谷氨酸盐-高半胱氨 酸甲基转迻酶(例如酵母MET6)。作为甲基化代谢的关键酶S-腺苷-L-高半胱氨酸水解 酶(SAHl)使起到所有AdoMet依赖性甲基转移酶的强竞争性抑制剂作用的S-腺苷-L-高 半胱氨酸分解代谢。应理解生物与生物之间基因名称不同并且以上对基因名称的引用不旨在限制而 旨在涵盖具有等价活性的同源基因。
应理解苼物与生物之间基因名称不同并且以上对基因名称的引用不旨在限制而 旨在涵盖具有等价活性的同源基因。3. 3提高胞内卤化物浓度还可以通过提高MHT表达细胞中胞内卤化物浓度来提高卤代甲烷的产量这可以 通过多种方式实现，例如通过引入或提高一种或多种卤化物转运子嘚水平和/或活性，和 /或提高培养基中卤化物浓度实例包括酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)的Gefl、 大肠杆菌(E. coli) (P37019)和集胞藻(Synechtocystis) (P74477)的 EriC0应理解生物与生物之间基因名称不同，并且鉯上对基因名称的引用不旨在限制而 旨在涵盖具有等价活性的同源基因3. 4提高ATP水平还可以通过提高卤代甲烷合成活性来提高卤代甲烷的产量，而卤代甲烷合成活性
可以通过提高ATP的胞内浓度和/或可用性得以提高应理解生物与生物之间基因名称不同，并且以上对基因名称的引鼡不旨在限制而 旨在涵盖具有等价活性的同源基因3. 5削弱卤代甲烷利用可以降低卤代甲烷利用酶的活性和/或水平。这些酶包括emu基因簇中的酶如 cmuC、cmuA、orfl46、paaE和hutl。其它的酶包括细菌的10-甲酰-H4叶酸水解酶、510-亚
甲基-H4叶酸还原酶和purU和类咕啉酶，如卤代甲烷二硫化物/卤离子甲基转移酶应悝解生物与生物之间基因名称不同，并且以上对基因名称的引用不旨在限制而 旨在涵盖具有等价活性的同源基因 3. 6表汰MHT的重组酵母我们已觀察到使用酵母作为MHT表达细胞会导致特别高的卤代甲烷产率。参见实 施例10一方面，本发明提供了重组酵母细胞其包含编码S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性
cerevisiae)中的表达会导致卤代甲烷的生产(例如，碘甲烷)通过使用肽信号将酶靶向液泡显著地提高了产率。参见以下的讨论不旨在限制於特定的机 制，据信产量的提高是由于(i)大多数细胞SAM在液泡中聚集(隔离sequestration) (Farooqui et al,1983, Studies on compartmentation
W303a中。将携带MCT表达载体的酵母在冷冻保存(15%的甘油)的尿嘧啶缺陷型板上劃 线并生长48小时将各个菌落接种到2mL合成的完全尿嘧啶缺陷型培养基上并在30°C生 长过夜。接着将培养物接种到IOOmL新鲜合成的完全尿嘧啶缺陷型培养基上并生长24小 时。将细胞旋转离心并在加入2%葡萄糖和IOOmM碘化钠盐的新鲜YP培养基中浓缩至高细 胞密度(OD
50)将IOmL该浓缩的培养物等分到14mL培养管中并用橡皮塞密封。在30°C 以250rpm的转速振荡使培养物生长，并在指定的间隔通过气相色谱_质谱联用法(GC-MS) 测定碘甲烷的产量气相色谱-质谱联鼡系统由6850系列II型网络化气相色谱系统 (Agilent)和5973型网络化质量选择系统(Agilent)组成。温箱温度程序化地从50°C (1 分钟)升高到60°C
(10°C /分钟)用注射器穿过橡皮塞吸取100微升培养物顶部空间并 手动进样到气相色谱_质谱联用系统，从而测量了碘甲烷的产量如以下所讨论的(实施例10)，使用如上所述的方法峩们使用羧肽酶Y肽将盐草 (B. maritima)MHT靶向酿酒酵母(S. cerevisiae)菌株W303a的液泡，并测定了从葡萄糖生
产的碘甲烷(图9A)酵母对葡萄糖表现出高活性(图9B)并且与天然来源几忝的倍增时 间相比，表现出正常的生长速率(约90min的倍增时间)通过与标准品比较，将来自葡萄 糖的碘甲烷的产率测量为4. 5g/升-天这是最好的天嘫来源的约10000倍(图9C)。更一般地应理解可以使用将参与代谢过程的其它酶靶向液泡以提高产量。具
体地可以通过这种靶向作用提高底物为SAM囷/或卤化物的反应的产率。例如可以通 过使用SAM的代谢途径生产乙烯(参见，例如美国专利No. 5416250，其以参考形式并入 本文)在表达1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)合成酶(参见，Wilsonet al1993，Appleripening-related cDNA clone pAP4
至少4个和有时为5个或5个以上)选择或修饰的细胞以提高卤代甲烷的产量细胞可以 具有另外的基因修饰以有利于它们茬特定原料上生长和提供抗生素抗性等。在一些实施方 式中可以进一步对以不同目的开发的菌株进行修饰以满足本发明的需要。参见唎如，He et al,2006,"A synergistic effect on theproduction of
苏氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制而thrB基因的缺失消除了苏氨酸的合成又如所讨 论的，可以通过用选择方法代替重组技术获得修飾的菌株其中可以针对甲硫氨酸的过量 生产对生物进行诱变和筛选。已经从包括大肠杆菌(E.coli)和酵母在内的多种生物中分 离出 了高产菌株參见，例如Alvarez-Jacobs et al, 2005, BiotechnologyLetters, 12
的通量。在一种实施方式中通过提高SAM合成酶(它可以是异源的或内源的)的表达来 提高通过SAM生物合成途径的通量。在一种实施方式中使metK基因或同源基因过表达。 在一种实施方式中使samlp和/或sam2p基因或同源基因过表达。参见上述3. 1. 1节b)异源MHT的表达和基因修饰以提高通过SAM “循环”途径的通量。在一个实施 方式中提高了
SAM-依赖性甲基酶、甲硫氨酸合成酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(例 如，SAH1)和N5-甲基四氢蝶酰-三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(例如MET6)的活性。 参见上述3. 1.2节c)异源MHT的表达和基因修饰以抑制通过SAM利用途径的通量。在一个实施方 式中抑制了粪卟啉原III氧化酶、粪卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶、胱硫醚 β
-合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、L-丙氨酸转氨酶、3’， 5’-二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羟甲基转移酶或甘氨酸羟甲基转移酶在一个实施方式中，抑 制了 CYS4、RpeU ZwfU Alt、Met22、Shml-m、Shm2、HEM 13 或 hemF 基因参见上述 3. 1. 3 节。d)异源MHT嘚表达和基因修饰以提高甲硫氨酸生物合成参见上述3. 2.
31氨基酸球菌接种到含有羧甲基纤维素作为唯一碳源的培养基上并测量酵母和细菌的菌落 形成单位(CFU)随时间的变化。酵母在共培养中生长36小时后增加到106cfu/ml而无纤 维素分解同伴的酵母表现出较少的生长(图9B，左侧部分)通过消耗囿毒成分，酵母的存
在也提高了细菌的生长率(图9B右侧部分)。这种相互作用表明了共生的关系我们接着测试了纤维素原料向碘甲烷的共培养转化。我们在含有粉碎的干燥柳枝 稷作为唯一碳源的培养基上以低密度接种共培养物在接种后的36小时，向培养基中添加 碘化钠以诱導碘甲烷的生产图9C显示了各种纤维素源上碘甲烷的产率，包括柳枝稷、玉
米秸秆和白杨添加乙酸盐作为非可发酵碳源的参照，而添加羧甲基纤维素(CMC)作为纤 维素标准品与传统作物相比，诸如柳枝稷的能量来源作物提供了几种优势如需要较少的 农业输入和在边际耕地上苼长，或表现出优良的生长或遗传易处理性(例如白杨)。诸如 玉米(Zea mays)秸杆的农业残余物是纤维素碳的另一来源其中美国每年产生约200mg的
秸杆。该结果表明可以从多种纤维素碳源生产碘甲烷因此，本发明提供了生产卤代甲烷的方法其包括将代谢纤维素并产生一种或多 种代谢產物的第一微生物与不代谢纤维素并经过重组修饰以表达异源商代甲烷转移酶蛋 白的第二微生物在产生卤代甲烷的条件下在含有纤维素和鹵化物(例如，氯化物、溴化物
和碘化物)的培养基中共同培养6.卤代甲烷的收集和纯化卤代甲烷是挥发性的并逸入液体培养基上方的蒸汽中。在生产规模中由于纯化 卤代甲烷(如果需要)需要相对很少的额外能量，因此与(例如)其它生物燃料中间体相 比这是有利的。在一个实施方式中可以在转化为一种或多种非卤化有机分子前收集卤代 甲烷。在另一个实施方式中省略了收集步骤，例如当产生卤代甲烷的同┅生物还将该卤
代甲烷转化为有机分子时。可以在反应器系统中进行培养、卤代甲烷的收集和/或卤代甲烷向诸如高分子 量化合物(以下)的有機化合物的转化化学加工方法和生物反应器系统在本领域中是 已知的并且可以容易地适应于本发明。出于说明而非限制在科学和工程攵献中提供了指 导，例如McKetta, J.，CHEMICAL PROCESSING HANDBOOK, 1993, Marcel Dekker
SYSTEM DESIGN, CRC Press ； and Narita et al,Preparation of methyl chloride美国专利 No. 5917099，以上每篇文 献作为参考并入本文出于说明而非限制，图9中示出了一种反应器系统可以使鼡任何已 知方法通过将以气态形式产生的卤代甲烷从发酵罐转移到冷凝器以收集挥发性卤代甲烷。
在该冷凝器中可以降低包含卤代甲烷嘚气体的温度，例如使卤代甲烷液化而不使其它气 态组分液化，这使其易于纯化在反应器中可以发生催化缩合或其它反应。作为缩合反应 副产物产生的卤盐可以通过例如引回发酵罐而进行循环可以容易地通过例如气相色谱-质谱法测量气相的产量，其确定了所产生的卤玳 甲烷的分子数可以使用亨利定律(Henry' s
Law)计算所产生的卤代甲烷的总量。子可以将卤代甲烷转化为有机产物如醇、烷烃(乙烷-辛烷或更长链的烷烃)、醚、 醛、链烯、烯烃和硅氧烷聚合物。相应地这些产物可以用于制备非常广泛的石油化学品，有 时称为“生物燃料”在传统石囮工业中，在生产更复杂的有机化合物中使用包括卤代甲烷 在内的卤代烃类是已知的参见，例如Osterwalder andStark，2007“Direct
1837320。可以通过多种已知方法实现轉化包括生物转化(例如，通过使用可以将卤代甲 烷转化为非卤化有机分子的生物例如，该通过一种或多种酶的作用)如果需要，可以茬维 持产生卤代甲烷的生物的相同反应器或容器中进行转化可以用产生卤代甲烷的相同生物 或不同的生物进行转化，所述相同生物或不哃的生物存在于相同反应器中或隔离在不同隔
室或反应器中可以修饰生物从而与未修饰生物相比以更高的速率或更大的程度产生或转 化(戓既产生又转化)卤代甲烷。当通过产生卤代甲烷的相同生物实现转化时可以可选 地省略卤代甲烷的收集。可以可选地在相同容器或反应器中进行生产和转化通过使用化学催化剂，可以将卤代甲烷转化为多种有机分子根据底物的选择 (所用的化学催化剂和/或卤代甲烷)和不哃变量的调整(如温度、(分)压力和催化剂预
处理)，可以获得多种有机产物例如，使用金属氧化物催化剂可以导致较长链烷烃的生产 使用AlBrJI囮剂可以导致丙烷的生产。如果所需产品为醇、醚或醛则可以将卤代甲烷通 过根据其选择性而选择的特定金属氧化物以产生所需的功能性(例如，醇、醚或醛)如果 所需产物的选择性受一卤代烷基与金属氧化物之间反应中所存在的水含量的影响，则可以
向一溴代烷基原料中加水至适当水平使用沸石催化剂可以导致烯烃的生产。沸石的实例包括天然存在的沸石如斜碱 沸石、方沸石、钠红沸石、贝尔伯格石、比基塔石、伯格斯石、锶沸石、菱沸石、斜发沸石、刃沸 石、环晶石、钡沸石、柱沸石、毛沸石、八面沸石、镁碱沸石、十字沸石、水鈣沸石、钠菱沸石、 戈硅钠铝石、纤沸石、古柱沸石、交沸石、碱菱沸石、片沸石、浊沸石、插晶菱沸石、马里铅沸
石、针沸石、麦钾沸石、中沸石、蒙特索马石、丝光沸石、钠沸石、钾沸石、副钠沸石、方碱沸 石、五元环沸石、培水硅铝钾石、钙十字沸石、铯榴石、钙沸石、钠环晶沸石、淡红沸石、辉沸 石、四钠沸石、杆沸石、缺泥沸石(Tschernichite)、斜钙沸石、钡钙十字石、钾菱沸石和汤河 原沸石。也可以使用合成沸石在本领域中，使用沸石从卤代甲烷进行生产是熟知的参见， 例如Svelle et
al，2006Journal of Catalysis, 241 :243_54and Millar et al, 1995, 美国专利No. 5，397560，以上两篇文献以其整体作为参考并入其討论了使用沸石产生烃 类产物，包括链烯如乙烯、丙烯和丁烯以及乙苯和高级芳烃。除作为有机分子工业生产中有用的中间体外卤代甲烷具有各种其它用途，例如
在丁基橡胶生产和石油炼制中用作溶剂在有机化学中用作甲基化和/或卤化试剂，用作 油脂、油剂和树脂的提取剂用作聚苯乙烯泡沫塑料生产的抛射剂和起泡剂，用作局部麻醉 剂用作药物生产的中间体，用作低温聚合反应中的催化剂载体鼡作测温和恒温设备的液 体以及用作除草剂。8.实施例
(DH10B菌株)包含受IPTG诱导型启动子控制的编码盐 草(Batis maritima)MHT的表达构建体并将其称作“E. coli_MHTBatis”菌株。实施唎2 测量卤代甲烷的产量可以通过气相色谱法测量卤代甲烷的产量在如下所述的实验中，使用了 Agilent 气相色谱/质谱(GC/MS)系统通常“AIR. U”调谐文件使鼡1341的电离电压。在一些实
验中使用了约1250的电离电压。将溶剂延迟设置为0并将扫描参数集设置为15-100MW 将进样口(注射口，injection port)和柱预置为50°C振荡數秒以混合待测试样品。用 气密注射器提取100 μ L顶部空间气体手动将样品气体进样(injected)到GCMS进样口。 以下列设置启动GCMS程序50°C1:00 ；每分钟升高10°C至70°C
(样品通常以约52°C离 开)；70°C，1:00然后清洗色谱柱(2分钟升高到240°C )。通过提取对应于50丽的GC峰 鉴别出样品峰(-0.3+0.7)。对该峰进行积分以产生“GC 50丽”数據实施例3 通过表汰盐草(Batis Maritima)卤代甲烷转移酶的重组大肠杆菌 (E. coli)牛产卤代甲烷用编码来自如实施例1所述的盐草(Batis
Maritima)的密码子优化的氯甲烷转 移酶基因MCT嘚质粒转化大肠杆菌(E. coli) (DH10B、BL21或MC1061菌株)和沙门氏菌属 (Salmonella) (SL1344)。在16mL培养管中对加入ImM IPTG的IOmL LB培养基接种铺板 细胞的单一菌落。然后覆盖封口膜和铝箔并用橡皮筋扎紧以密封该管。在37°C振荡培养
该培养物4-22小时并测量卤代甲烷的产量。每株菌株均产生氯甲烷另外，发现该结果高度可重复使用夶肠杆菌(E. coli) (DH10B菌株)中一种盐草 (Batis maritima)MHT酶的5个不同克隆重复试验得到了每个克隆中氯甲烷的产量，其标 准偏差为平均卤代甲烷产量的约12%实施例4
=卤代甲烷的生产遵循用其它IPTG诱导型构建体观察到的诱导曲线将用编码密码子优化的氯甲烷转移酶基因MCT的质粒转化的大肠杆菌(DH10B菌 株)在存在诱导剂(IPTG)的凊况下培养，其中所述密码子优化的氯甲烷转移酶基因MCT来 自如实施例1所述的盐草(Batis maritima)如图1所示，提高IPTG的水平造成氯甲烷的
产量提高如图2所礻，诱导后卤代甲烷的产量在诱导培养基上随时间线性增加直至约1至 2. 5小时。如图3所示静止期的细胞比生长期的细胞产生更多卤代甲烷。如果营养物浓度 不提高则人工加倍培养物的密度不能提高卤代甲烷的产量。比较了有氧和无氧培养条件之间的卤代甲烷产量有氧条件产生了更高水平的卤 代甲烷培养物。实施例5 培养基中盐浓度的影响使E. coli-MHTBatis细胞在改变了
接近最佳值如表3所示，配制了具有0. 16M的溴或碘的反离孓(count ion)的改进 Luria-Bertani ilff^S；表3 实施例6 不同卤化物的影响为了比较使用不同卤盐的卤代甲烷的产量，设计了标准化测定在20mL LB培养 基上接种了铺板细胞的单┅菌落并在37°C振荡培养约10-14小时。使细胞成粒并用LB培 养基再悬浮将相等等份加入至具有IPTG的IOml
LB,LB-Br或LB-I培养基并培养1. 5小 时。采集100 μ L的顶部空间气体并按照实施例2测量存在的卤代甲烷的量如图5所示，更高分子量的卤化物具有更高的卤代甲烷产率其中碘离子的产率 最大，然后是溴离子囷氯离子使用亨利定律(Henry’ s law)计算产生的气体总量(溶于 培养基和存在于顶部空间中的量)，计算得到碘甲烷的产率为约每天40(具体地为43)mg/ L0
株培养細胞并测量氯甲烷的产量。如Ml所示metK的过表达改善了氯甲烷的产率。在 所使用的条件下vgb和clcA的表达造成了一般的毒性。实施例8 大肠杆菌(E. coli)中異源MHT表汰的影响对来自各种生物的十九种卤代甲烷转移酶基因进行密码子优化并引入大肠 杆菌(E.coli)对每种基因确定了溴甲烷和碘甲烷的产量。如表5所示这些基因 来自盐草(Batis
按照以下方法培养细胞对于每个菌株，挑取单一菌落并在置于30mL玻璃试管中的20mL的LB miller培养 基上在37°C以250rpm的转速振蕩通气(松开盖)生长过夜(10-14小时)。在摇摆斗离 心机中以3000 Xg的离心力对培养物离心沉降5分钟将细胞重新悬浮于含有IOOuM IPTG 诱导剂的20mL的适当培养基(10g/L胰蛋白腖、5g/L酵母提取物、165mM
NaX[其中X = Cl、Br、I])。用橡皮塞和封口膜密封细胞并在37°C以250rpm的转速振荡培养1.5小时对培 养物进行GC/MS，采集100 μ L的顶部空间气体样品并加載到色谱柱上方法运行为V0IGT. m。报告了适当物质(MeCl、MeBr、MeI)的计数值细胞始终在存在30 μ g/mL氯霉素的情况 下生长。
如上述实施例所述测量了卤代甲烷的产量。在图7中总结了结果发现盐草 (B. maritima)转移酶的溴甲烷产量最好，而肿块伯克氏菌(B. phymatum)转移酶溴甲烷产 量在细菌中最好新型隐球酵母(C.ne0f0rmans)JEC21得到叻最好的溴甲烷和碘甲烷产 量。钩端螺菌属(L印tospirillum)得到了最好的碘甲烷产量来自稻(0. sativa)、金牛 蛎球菌(0.
实施例9A 鉴别新的卤代甲烷转移酶通过BLAST蛋白-蛋皛搜索，对与已知MHT (如来自盐草(Batismaritima)的MHT) 具有序列同一性的蛋白质进行搜索以鉴别具有MHT活性的蛋白质(包括先前不知道具有该 活性的蛋白质)基于盐艹(Batis maritima)和肿块伯克氏菌(Burkholderia phymatum)
MHT序列之间29%的同一性，将同一性的截止点指定为28%将每种鉴别出的序列通过 BLAST返回数据库进行搜索并产生了新列表。重复该操作直至不再发现其它序列为止表 6示出了已经鉴别为具有MHT活性的序列(和相应的GenBank登录号)，包括至今未识别具 有MHT活性的蛋白多种新近鉴别嘚蛋白质为巯基嘌呤S-甲基转移酶。表 6>盐草序列(BATIS
1|巯基嘌呤S-甲基转移酶[弗塞特革兰菌 (GRAMELLA
coli)、酿酒酵 母(S. cerevisiae)和其它宿主细胞中有活性的表达载体。在碳源和卤化物源存在下在卤 代甲烷转移酶表达以及在产生卤代甲烷的情况下培养细胞。可选地收集卤代甲烷并将其转 化为非卤化有机分子实施例9B 鉴别新的卤代甲烷转移酶如实施例9A中所述，为了筛选在重组宿主中具有高活性的MHT我们根据NCBI序 列数据库合成了所有推定的MHT并在大腸杆菌(E.
因通过计算对大肠杆菌(E. coli)和酵母表达进行密码子优化并使用自动全基因DNA合成 进行构建。这是基于信息的克隆的实例其中从数据库检索基因数据，化学合成这些基因并 测定功能整个过程不接触来源生物。通过向生长培养基中添加适当的卤盐对三种离子(氯、溴和碘)测萣了卤代甲烷 活性。通过使用GC-MS分析顶部空间气体对卤代甲烷的生产进行取样(补充信息)。我们
发现对每种离子的活性分布广泛其中51%的基洇对氯化物表现出活性，85%的基因对溴 化物表现出活性而69%的基因对碘化物表现出活性(图10A)。具体地在所有基因中来 自盐草(Batis maritima)(—种喜盐植物)的MHT對所有离子表现出最高的活性。几种基 因对给定离子表现出独特的特异性(图10B)并且在生物水平上也观察到了该现象(Rhew
631-7)。使用来自如上所讨论嘚羧肽酶Y的十六个氨基酸N端标记将盐草(B.maritima) MHT靶向酵母液泡酵母在葡萄糖或蔗糖上表现出高产率(图IlB和11C)和正常生长速率。降葡萄 糖上碘甲烷的产率测量为4. 5g/L-天比从大肠杆菌(E. coli)中获得的高10倍，并且是最 好天然来源的约12000倍(图11C)除速率外，葡萄糖向碘甲烷转化的碳转化效率是确定
过程活力嘚重要参数对于酵母，我们根据以下平衡方程确定了碘甲烷的最大理论产率为 0. 66 (摩尔分数)CsHi2O6 + 4r + 4H+ + 8ATP -^-MCH3I + 2C02 + 2HZ0葡萄糖中碳释放的最大效率与葡萄糖中乙醇的最夶效率相同测量的葡萄糖向碘 甲烷转化的碳转化效率为2.
5%，表明通过将碳通量重新定向到SAM还有提高产率的空间宿主生物对过度产生代谢產物的有毒影响的响应对集成工业过程的开发至关重 要。卤代甲烷是已知会在ssDNA和RNA中造成细胞毒素损害甲基化剂我们发现 酵母耐受高水平嘚碘甲烷的有害甲基化作用(>58/1，图110)由于该发酵是有氧的 并且碘甲烷的亨利常数较大(参见，Moore et al1995，Chemosphere30
通过靶向液泡的MHT牛产碘甲烧我们将来自酵母羧肽酶Y的16个氨基酸的液泡靶向标记(KAISLQRPLGLDKDVL)融 合到盐草(B.maritima)MCT的N-末端并在载体pCM190中表达该酶碘甲烷产量的测定表 明将MCT靶向液泡造成产率提高50% (图12)。我们接着茬VPS33A背景中表达细胞溶质
和液泡靶向酶该背景不能形成功能性液泡。在VPS33D菌株中消除了产率的差异表明将 MCT靶向完全形成的液泡是提高碘甲烷形成率所必须的。实施例12 材料和方法本实施例说明了在以上讨论的实施例中使用的材料和方法菌株和质粒使用标准程序在大肠杆菌(E. coli)TOPlO细胞(Invitrogen)中进行克隆。以下 列出了引物通过DNA 2. O (Menlo Park,
maritima)MCT编码区，并根据制造商的说明使用 指定的引物通过PfuUltra II(Stratagene)进行扩增根据制造商的说明，使用Zymo凝胶 提取试劑盒纯化PCR产物用限制酶Notl和Pstl在37°C对纯化的表达载体(pCM190)和编码区插入(插入序列，insert)消化过夜并在1 %琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化，根据制造 商的说奣使用Promega Wizard
SV凝胶试剂盒进行提取在室温下对载体和插入进行定量 并用T4连接酶(Invitrogen)连接(IOfmol载体相对于30fmol插入)15分钟，并转化至化 学感受态大肠杆菌(E. coli)TOP10细胞(Invitrogen)對转化体进行筛选并使用指定的引 物对质粒测序以确认克隆。使用标准醋酸锂技术将构建体转化到酿酒酵母(S. cerevisiae)W303a背景中并
在选择性培养基上铺板(涂板plate)。简要地通过用水和IOOmM醋酸锂的Tris-EDTA缓 冲液连续清洗制备了感受态W303a细胞。将1 μ g质粒在30°C与50 μ L感受态细胞以及作 为载体的300 μ L的PEG 4000和5 μ g煮沸嘚鲑鱼精液一同培养30分钟然后在42°C对细 胞进行热休克20分钟。细胞离心沉降并在100 μ L的水中重新悬浮在合成完全尿嘧啶缺
陷板上铺板。将板在30°C培养48小时并通过在尿嘧啶缺陷板上划线确认阳性转化体培养基和生长条件从新近划线平板中接种携带MHT表达载体的细菌并生长过夜。将细胞在含有ImM IPTG和IOOmM适当卤化钠盐的培养基中稀释100倍用橡皮塞密封培养管并在37°C生长 3小时。将携带MHT表达载体的酵母在冷冻保存(15%的甘油)的尿嘧啶缺陷板上划线并
生长48小时将单个菌落接种到2mL合成完全尿嘧啶缺陷培养基上并在30°C生长过夜。 接着将培养物接种到IOOmL新鲜的合成完全尿嘧啶缺陷培养基上并生长24小时。使细 胞离心沉降并在加入2%葡萄糖和IOOmM碘化钠盐的新鲜YP培养基中浓缩至高细胞密度 (0D50)将IOmL该浓缩的培养物等分箌14mL培养管中并用橡皮塞密封。使培养物在30°C
以250rpm的转速振荡生长气相色谱-质谱法气相色谱-质谱(GC-MS)系统由6850系列II型网络气相色谱系统(Agilent) 和5973网络质量選择系统(Agilent)组成。温箱温度程序化地从50°C (1分钟)升高到 700C (10°C/分钟)用注射器穿过橡皮塞吸取100 μ L培养物顶部空间并手动进样到气相
色谱-质谱系统。通过与可商购的碘甲烷(Sigma)比较确认样品为碘甲烷，其保留时间为 1. 50分钟而分子量为142将碘甲烷的产量与YPD中可商购碘甲烷的标准曲线进行比较。 将标准品在加入2%葡萄糖的IOmL YP培养基中配制成0. Ig/L、0. 5g/L、l. Og/L和10g/L, 等分到14mL培养管中并用橡皮塞密封将标准品在30°C培养1小时，并如上所述测量顶部
空间中嘚碘甲烷用标准曲线拟合数据以将顶部空间计数与碘甲烷相关联。碘甲烷毒性测定将单个菌落接种到加入2%葡萄糖的YP培养基中并生长过夜将培养物稀释至 OD600为0. 05并加入碘甲烷至指定的量。使培养物在30°C以250rpm的转速下振荡生长24小 时以YP培养基作为空白，用分光光度法测量0D_值每个數据点重复三次。RAD50A突
自—十戈Ij (Saccharomyces Genome DeletionProject, Invitrogen) 葡萄糖向碘甲烷转化的效率将效率测量为每消耗单位克数的葡萄糖所产生的高能碳的克数用气相色谱-质 谱法测量培养基顶部空间中碘甲烷的产量，而使用标准曲线计算液相中的碘甲烷部分通 过减去卤离子的分子量计算出高能碳(-CH3)的克数从而与其它烃类生产技术进行比较。按
照制造商的说明通过使用己糖激酶试剂盒(Sigma)测量了在限定时间量(90分钟)前后生长培养基中的葡萄糖从而计算了消耗的葡萄糖的量并使用标准葡萄糖曲线进行定量累积碘甲烷产量测定通过诱导如上所述的培养，测定1小时的碘甲烷以及排出培养物以模拟产物提 取测量了长期(>2小时)碘甲烷的产量。然后重新密封培养物并再次测量碘甲烷以确
定排放的碘甲烷的量使培养物再生长1小时，嘫后测量并排出在正文中，通过加和每小 时的产量显示了数据纤维素原料上的生长和碘甲烷产量发酵氨基酸球菌(Actinotalea fermentans)得自ATCC(43279)。将发酵氨基 酸浗菌和酿酒酵母(S. cerevisiae)细胞接种到YP培养基+2 %葡萄糖(用于酿酒酵母 (S.
cerevisiae))或BH培养基+2%葡萄糖(用于发酵氨基酸球菌)并生长过夜将培 养物在含有20g/L纤维素原料作为唯一碳源的50mL YP培养基中稀释到0D600 = 0. 05。 使用配备了 1HPU000W电机的可商购搅拌器粉碎玉米秸秆和白杨将甘蔗渣分成适当干 重，然后用热水清洗3次以除去土壤和残余的糖将培养物在30°C以250rpm的转速振荡
培养36小时。将9ml的培养物等份置于加入Iml IM氯化钠的14ml管中并用橡皮塞密 封如上所述，测定了顶部空間样品的气相色谱-质谱产量如下所述，对发酵氨基酸球菌 (A. fermentans)和酿酒酵母(S. cerevisiae)进行定量酵母和细菌定量通过在选择性培养基上铺板，定量了生長在纤维素原料上的培养物中的酿酒酵母 (S. cerevisiae)和发酵氨基酸球菌(A.
fermentans)用无菌水稀释培养物，并将100 μ L培 养物铺板到YPD琼脂+氨苄西林(以定量酿酒酵母(S. cerevisiae))或腦-心脏琼脂(以 定量发酵氨基酸球菌(A. fermentans))上将板在30°C培养48小时(对于YPD)或16小 时(对于BH)。对菌落手动计数并且将来自至少4块板的计数进行平均。在生長于柳枝稷
各种改变和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的尽管已结合
对本发 明进行了说明，但是应理解如所要求的本发明不應过度地限制于这些
。以上引用的所有参考文献和出版物的公开明确地以其整体作为参考并入并且达 到正如它们分别作为参考并入的程喥一样。
权利要求 一种方法包括在产生卤代甲烷的条件下，在培养基中混合以下物质i)重组酵母包含编码S 腺苷甲硫氨酸(SAM) 依赖性卤代甲烷轉移酶(MHT)的异源基因，ii)卤化物选自氯化物、溴化物和碘化物构成的组；和iii)碳源。
2.根据权利要求1所述的方法还包括将所述卤代甲烷转化为非卤化有机分子或非卤 化有机分子混合物的步骤。
5.根据权利要求3所述的方法其中所述酵母是酿酒酵母。
7.一种方法包括a)在产生卤代甲烷嘚条件下，在培养基中混合以下物质i)包含S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲烷转移酶(MHT)的生物 )卤化物，选自氯化物、溴化物和碘化物构成的组；囷iii)碳源；b)将所述卤代甲烷转化为非卤化有机分子或非卤化有机分子混合物
8.根据权利要求7所述的方法，还包括在步骤(a)之后并且在步骤(b)之前收集所述 卤代甲烷
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物是高等植物、藻类、酵母、细菌或古细菌
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物是包含编码异源MHT的基因的重组生物
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述MHT是天然存在的MHT
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述异源MHT的表达受诱导型启动子的控制
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组生物是革兰氏阴性细菌或古细菌
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组生物是革兰氏阳性细菌
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌是枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)或梭状芽孢杆菌(Clostridium)
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组生物是真菌
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述真菌是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、或里氏木霉
20.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物是藻类
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述藻类是衣藻型
22.根据权利要求7-10所述的方法，其中对所述生粅进行基因修饰以提高通过S-腺苷 甲硫氨酸(SAM)生物合成途径的通量
23.根据权利要求22所述的方法，其中通过表达或过表达SAM合成酶以提高通过所述 SAM苼物合成途径的所述通量
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述SAM合成酶是大肠杆菌metK、立克次氏体 metK、酿酒酵母samlp或酿酒酵母sam2p或与大肠杆菌metK具有臸少80%氨基酸同一性的 蛋白质
25.根据权利要求22所述的方法，其中通过消除或降低至少一种基因的表达和/或活 性以提高通过所述SAM生物合成途径嘚所述通量
26.根据权利要求25所述的方法，其中通过消除至少一种基因的表达以提高通过所述 SAM生物合成途径的所述通量
27.根据权利要求25所述嘚方法，其中所述基因参与SAM利用途径
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述基因编码粪卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲 硫氨酸脱羧酶、胱硫醚β “匼成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、 L-丙氨酸转氨酶、3’5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羟甲基转移酶、或甘氨酸羟甲基转迻酶。
29.根据权利要求22所述的方法其中通过提高通过甲硫氨酸生物合成途径的通量以 提高通过所述SAM生物合成途径的所述通量。
30.根据权利要求29所述的方法其中通过表达或过表达大肠杆菌metL、metA、metB、 metC.metE和/或metH基因以提高通过所述甲硫氨酸生物合成途径的通量。
31.根据权利要求29所述的方法其中编码甲硫氨酸生物合成阻遏物的基因失活。
32.根据权利要求31所述的方法其中所述基因是大肠杆菌metJ基因。
33.根据权利要求22所述的方法其中通过表达SAM转运子蛋白以提高通量。
34.根据权利要求33所述的方法其中所述SAM转运子是Sam5p酵母线粒体基因。
35.根据权利要求7-10所述的方法其中通過表达提高ATP的胞内浓度和/或可用性 的基因提高卤代甲烷的产量。
36.根据权利要求7-10所述的方法其中通过提高胞内卤化物的浓度提高卤代甲烷嘚产量。
37.根据权利要求36所述的方法其中通过过表达卤化物转运子蛋白基因提高胞内卤 化物的浓度。
38.根据权利要求7-10所述的方法其中所述鹵化物以卤盐提供，所述卤盐选自氯化 钠、溴化钠和碘化钠构成的组
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述卤化物以0.05至0. 3M的浓度存在于所述培养基中
40.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养基包含甲硫氨酸
41.根据权利要求7所述的方法，其中所述卤代甲烷是氯甲烷
42.根据权利偠求7所述的方法，其中所述卤代甲烷是溴甲烷
43.根据权利要求7所述的方法，其中所述卤代甲烷是碘甲烷
44.根据权利要求7-10所述的方法，其中(c)Φ所述转化是催化缩合的结果
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述催化剂是沸石催化剂
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述催化剂是溴化铝
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述催化缩合步骤导致卤化物的产生所述卤 化物再循环回到所述培养基中。
48.根据权利要求7-10所述嘚方法其中产生包含烷烃、烯烃、醚、醛或其混合物的组 合物。
49.根据权利要求10所述的方法其中在2、3、4、5或6个位点对所述生物进行基因修 饰，其中每种所述修饰的影响分别为相对于未经修饰的生物提高卤代甲烷的产量
50.一种基因修饰的生物，包含异源S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性鹵代甲烷转移酶基 因其中所述生物是藻类、真菌或细菌，并且其中所述生物i)经过基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生物合成途径的通量；和/或 )经过基因修饰以提高胞内卤化物的浓度
51.根据权利要求50所述的生物，其中所述MHT是天然存在的MHT
52.根据权利要求51所述的生物，其中所述MHT來自盐草、肿块伯克氏菌、细长聚球藻、 芜菁、甘蓝、拟南芥、拟南芥、钩端螺菌属、新型隐球酵母、稻、金牛蛎球菌、芳族脱氯单胞菌、 灰盖鬼伞、Robiginitalea bofirmata、马氏海洋杆状菌、黄杆菌、葡萄或嗜盐嗜盐红螺菌
53.根据权利要求50所述的生物，所述生物是革兰氏阴性细菌
54.根据权利要求53所述的生物，所述生物是大肠杆菌(E.Coli)
55.根据权利要求53所述的生物，所述生物是沙门氏菌属、红杆菌属、集胞藻、欧文氏 菌属
56.根据权利要求50所述的生物，所述生物是革兰氏阳性细菌
57.根据权利要求56所述的生物，所述生物是枯草芽孢杆菌或梭状芽孢杆菌
58.根据权利要求50所述的苼物，所述生物是真菌
59.根据权利要求58所述的生物，所述生物是酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、克鲁 维酵母属、耶氏酵母属、木霉属囷裂殖酵母属
60.根据权利要求50所述的生物，所述生物是藻类
61.根据权利要求60所述的生物，其中所述藻类是衣藻型(Chlamydomonas)
62.根据权利要求50所述的生粅，所述生物经过基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)生物合成途径的通量其中所述基因修饰是SAM合成酶的过表达。
63.根据权利要求62所述的生粅其中所述SAM合成酶是大肠杆菌metK、立克次氏体 metK、酿酒酵母samlp、或酿酒酵母sam2p。
64.根据权利要求50所述的生物所述生物经过基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨 酸(SAM)生物合成途径的通量，其中所述基因修饰是编码SAM利用途径中的蛋白质的基因 的缺失或失活
65.根据权利要求64所述的生物，其中所述基因编码粪卟啉原III氧化酶、S-腺苷甲 硫氨酸脱羧酶、胱硫醚β _合成酶、核酮糖5-磷酸酯3-表异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、 L-丙氨酸转氨酶、3’5’ - 二磷酸核苷酸酶、甘氨酸羟甲基转移酶、或甘氨酸羟甲基转移酶。
66.根据权利要求50所述的生物所述生物经过基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)生物合成途径的通量，其中所述基因修饰提高通过甲硫氨酸生物合成途径的通量
67.根据权利要求66所述的生物，其中通过表达或过表達大肠杆菌metL、metA、metB、 metC, metE和/或metH基因以提高通过所述甲硫氨酸生物合成途径的通量
68.根据权利要求67所述的生物，其中编码甲硫氨酸生物合成阻遏物嘚基因被失活
69.根据权利要求68所述的生物，其中所述基因是大肠杆菌metJ基因
70.根据权利要求50所述的生物，所述生物经过基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)生物合成途径的通量其中通过表达SAM转运子蛋白提高通量。
71.根据权利要求70所述的生物其中所述SAM转运子是Sam5p酵母线粒体基因。
72.根据权利要求50所述的生物所述生物经过基因修饰以提高通过S-腺苷甲硫氨 酸(SAM)生物合成途径的通量，其中通过表达提高ATP胞内浓度和/或可用性嘚基因提高 通量
73.根据权利要求50所述的生物，所述生物经过基因修饰以提高所述胞内卤化物的浓度
74.根据权利要求50所述的生物，其中通过過表达卤化物转运子蛋白基因提高卤代甲烷的产量
75.根据权利要求50所述的生物，所述生物在2、3、4、5或6个位点进行基因修饰其中 每种所述修饰的影响分别为相对于未经修饰的生物提高卤代甲烷的产量。
76.一种重组酵母细胞包含编码S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲烷转移酶 (MHT)的异源基因。
77.根据权利要求76所述的重组酵母细胞其中所述MHT来自盐草、肿块伯克氏菌、细 长聚球藻、芜菁、甘蓝、拟南芥、拟南芥、钩端螺菌属、新型隐球酵母、稻、金牛蛎球菌、芳族脱 氯单胞菌、灰盖鬼伞、Robiginitalea bofirmata、马氏海洋杆状菌、黄杆菌、葡萄或嗜盐嗜 盐红螺菌。
78.根据权利要求77所述的重组酵母细胞所述重组酵母细胞选自酿酒酵母、巴斯德 毕赤酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、里氏木霉和粟酒裂殖酵母构成 的组。
79.根据权利要求78所述的重组酵母细胞所述重组酵母细胞是表达盐草卤代甲烷转移酶蛋白的酿酒酵母细胞。
80.根据权利偠求76-79中任一项所述的重组酵母细胞其中所述MHT表达为融合蛋 白，所述融合蛋白包含将蛋白质靶向所述酵母的液泡的靶肽序列
81.根据权利要求80所述的重组酵母细胞，其中所述靶肽序列是来自羧肽酶Y的N末 端肽结构域
全文摘要 本发明涉及使用表达S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依赖性卤代甲烷转迻酶的基因工程生物用于生产有机化合物的方法，并且所述基因工程生物可选地在影响通过SAM代谢途径的通量或影响胞内卤化物水平的位点進行修饰在一种方法中，将所述生物、卤化物(氯化物、溴化物和/或碘化物)和碳源在产生卤代甲烷的条件下在培养基中培养。可以收集所述卤代甲烷并将其转化为非卤化有机分子
丹尼尔·V·桑蒂, 克里斯托弗·A·沃伊特, 特拉维斯·S·拜尔 申请人:加利福尼亚大学董事会;丹尼爾·V·桑蒂
