【论文】2型糖尿病肾病患者血清IL-2、IL-6和TNF-α水平的检测及意义_百度文库
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2型糖尿病肾病患者血清IL-2、IL-6和TNF-α水平的检测及意义
目​的​探​讨型​糖​尿​病​肾​病​患​者​血​清​I​L​-、​I​L​-及​T​N​F​-​α​水​平​的​变​化​及​其​在型​糖​尿​病​肾​病​病​理​过​程​中​的​作​用​。​方​法​应​用​放​射​免​疫​法​对3​例型​糖​尿​病​肾​病​患​者​、8​例型​糖​尿​病​非​肾​病​患​者​及4​例​健​康​人​(​健​康​对​照​组​)​进​行​血​清​I​L​-、​I​L​-及​T​N​F​-​α​水​平​的​检​测​。​结​果型​糖​尿​病​肾​病​组​血​清​I​L​-水​平​显​著​低​于​健​康​对​照​组​(​P​＜.1​)​及型​糖​尿​病​非​肾​病​组​(​P​＜.5​)​。​而​I​L​-及​T​N​F​-​α​水​平​显​著​高​于​健​康​对
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[[ 】请问IL-2和IFN的测定(标准品,浓度稀释,淋巴母细胞)] 测定这两种细胞因子时，标准品应从多大浓度稀释起？标准品对照要做多少个稀释度？我测IL－2用淋巴母细胞增殖法，IFN用L929和VSV测。 关键词:[标准品 浓度稀释 淋巴母细胞]…
测定这两种细胞因子时，标准品应从多大浓度稀释起？标准品对照要做多少个稀释度？我测IL－2用淋巴母细胞增殖法，IFN用L929和VSV测。
1. 对于细胞因子生物学活性检测，如果标准品没有失活，常规情况下20u/ml就已达到最大值（但这取决于细胞密度和培养时间）。所以建议标准品可做如下稀释：40，20，10，5，2.5，1.25，0.62，0.31，0.16，0.08 u/ml，0。值得注意的是，从公司买来的标准品就已经丢失了很多活性。因此在正式实验前应该先做标准品活性校正。2. IL-2生物学活性检测可采用IL-2依赖细胞株CTLL。CTLL是C57BL/6来源的小鼠杀伤性T淋巴细胞细胞系，由Gills 1977年建立，只有在IL-2存在的培养基中才能生长。因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。3. IFN生物学活性检测最好采用对IFN刺激敏感的细胞株，如人羊膜上皮细胞WISH株、人喉癌细胞Hep-2株以及人胚肌皮或肺单层细胞。这些细胞在IFN的刺激下可产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水泡性口炎病毒（VSV）的攻击，是为细胞病变抑制法（cytopathic effect inhibition，CPEI）。而L929细胞系则常用于检测TNF的生物学活性。* 白细胞介素2(IL-2)的生物学活性测定(一) 原理IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，故称T细胞生长因子（ T cell growth factor, TCGF）。IL-2产生的水平反映T细胞的功能，不仅是免疫调节重要的研究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL是C57BL/6来源的小鼠杀伤性T淋巴细胞细胞系，由Gills 1977年建立，只有在IL-2存在的培养基中才能生长。因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。除CTLL外，丝裂原活化的T淋巴母细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。(二) 和器材　　1．IL-2依赖的CTLL　　2．10％FCS-RPMI1640　　3．3H-TdR　　4．标准IL-2　　5．MTT, 酸性异丙醇，二甲亚砜（DMSO）　　6．PPO，POPOP，二甲苯　　7．9999型玻璃纤维滤纸　　8．96孔平底培养板　　9．细胞收集仪　　10．CO2孵箱　　11．液闪计数仪(三) 操作步骤　　可根据实验室条件，选用3H-TdR掺入法和MTT法。　　1．3H-TdR掺入法：　　 1）IL-2依赖的CTLL用10％FCS-RPMI1640洗涤2次，每次1000 rpm，5 min， 除去原培养液中的IL-2。　　 2）调整活细胞数1×105 /ml。　 　3）96孔平底培养板中每孔加100ul，CTLL悬液（1×104／孔）。　　 4）加入不同稀释度标准IL-2和待测样品。　　 5）37℃、CO2孵箱，培养18~24h。　　 6）每孔加3H-TdR 0.5 uCi /50ul。培养4~6h。　　 7）用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
8）干燥后，移入液闪瓶中，加入1 ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值。　　计算(举例)将标准IL-2不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的cpm值作图，纵轴采用概率座标（probit），横座标为Log2稀释倍数。从50％的最高cpm值画一横线，与标准和待检斜线的交点，即可计算出待检样品IL-2的活性单位。如标准品50％最大cpm值时为1u/ml，则待测标本1∶4时为1u/ml，原液则为4u/ml。　　2．MTT法：MTT[3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，四甲基偶氮唑盐]可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲月替（Formazan），将结晶的甲月替 溶解释放，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中IL-2的水平。在掌握良好的实验条件下，MTT法的敏感性可接近3H-TdR同位素掺入法。
1）IL-2依赖的CTLL用10％FCS-RPMI1640洗涤2次，每次1000rpm，5min，除去原培养液中的IL-2。　　　2）调整活细胞数1~2×105 /ml　　　3）96孔平底培养板中每孔加100ul，CTLL悬液（1~2×104／孔）　　　4）加入不同稀释度标准IL-2和待检样品，100ul /孔，每份设3个重复孔　　　5）CO2孵箱培养18~24h。　　　6）每孔加10ul MTT（5mg /ml溶于PBS），37℃ 培养4h。　　　7）轻轻吸出150ul上清，加入150ul二甲亚砜（DMSO）或酸性异丙醇（异丙醇溶于0.04N HCl）。　　　8）溶解10min，测OD值（570nM）。　　(四) 注意事项　　1．CTLL细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增殖。CTLL对IL-15刺激有明显的增殖反应，如待测样品为培养上清时应加注意。　　2．避免同位素污染。　　3．加标准IL-2或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。　　4．加入3H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始明显死亡。
5．CTLL细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。* 干扰素(IFN)生物学活性检测干扰素（interferon，IFN）是一类低分子量蛋白质，在机体免疫调节、抗病毒感染和抑制肿瘤细胞生长中具有重要作用。根据其产生细胞不同和理化性质、生物学特性的差异可分为?干扰素（IFN-a）、?干扰素（IFN-b）和?干扰素（IFN-g）。检测干扰素的方法主要有定量测定（常用ELISA法）和生物学活性的检测，两者常可互补应用。(一) 原理干扰素能刺激某些指示细胞（如人羊膜上皮细胞WISH株、人喉癌细胞Hep-2株以及人胚肌皮或肺单层细胞）产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水泡性口炎病毒（VSV）的攻击，是为细胞病变抑制法（cytopathic effect inhibition，CPEI）。以能抑制50％细胞病变（CPEI50）的干扰素最高稀释度作为1个单位。根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。测定时应同时设置干扰素参考标准品对照，以便将测定结果转换为国际单位（IU/ml）。(二) 和器材1．WISH细胞株，在完全培养液中呈单层贴壁生长。2．水泡性口炎病毒（VSV），-70℃保存。使用时以MEM完全培养液稀释至工作浓度。3．10％ FCS-MEM培养液，或10％ FCS-RPMI-1640培养液，4℃保存。4．消化液：0.2g EDTA、8g NaCl、0.2g KCl、1.152g Na2HPH4、0.2g KH2PH4，以双蒸水溶解至1000 ml，121℃、15 min高压灭菌或除菌过滤，4℃保存。或以不完全MEM或RPMI-1640培养液配制0.25％ 胰酶、0.02％ EDTA消化液，除菌过滤，-20℃保存。5．染色液：50 mg 结晶紫加入20 ml乙醇溶解，双蒸水加至100 ml。6．脱色液：50 ml乙醇，50 ml双蒸水，0.1 ml乙酸。7．干扰素标准品及待检样品，-70℃保存。8．PBS：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPH4、0.24g KH2PH4，以双蒸水定容至1000 ml，121℃、15 min高压灭菌或除菌过滤。9．微量移液器、96孔细胞培养板、培养瓶、吸管、烧杯等。10．CO2孵箱、超净台、酶联读数仪等。(三) 操作步骤1．铺板：弃去WISH细胞培养瓶中培养液，用PBS洗2次后消化收集细胞，800~1000 rpm离心6min，以MEM完全培养液调节细胞密度为2~3X105个细胞／ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul，37℃、5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁为单层。2．制备干扰素溶液：取干扰素标准品，按说明书溶解后，以MEM完全培养液先预稀释至103 IU/ml。待检样品应视具体情况做相应稀释。3．加样：取预先铺好WISH细胞的细胞培养板，将不同稀释度的干扰素标准品或待检样品溶液移入相对应的孔中，每孔100ul。每个浓度应做复孔或三孔重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。37℃、5％ CO2条件下培养过夜。4．制备病毒液：攻毒剂量为100 TCID50（半数组织培养感染量度，median tissue culture infective dose），取保存的VSV用MEM完全培养液稀释至工作浓度。5．攻毒：弃去WISH细胞培养板培养液，甩干，加入工作浓度的病毒液，每孔100ul。细胞对照孔不加病毒液，加入MEM完全培养液，每孔100ul。37℃、5％ CO2条件下培养24 h。6．染色：弃去上清，每孔加入50ul结晶紫染色液，室温放置30 min。7．脱色：流水小心冲去染色液，甩干残留水分，每孔加入100ul脱色液，室温放置5 min。8．比色：用ELISA自动读数仪测定每孔570 nm处OD值，记录结果。9．结果计算：利用统计软件或直线回归法处理数据。分别计算各干扰素样品的半效稀释倍数（即从样品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数），按下式计算试验结果：待检样品效价＝（标准品效价×待检样品半效稀释倍数×待检样品预稀释倍数）
/（标准品半效稀释倍数×标准品预稀释倍数）(四) 注意事项1．本法对天然培养上清或重组干扰素均可检测活性。2．亦可使用Hep-2细胞株、人胚肌皮或肺单层细胞检测干扰素学活性，操作步骤基本同WISH细胞。3．染色方法也可采用其他活细胞染色法，如刚果红摄入法、MTT染色法。4．铺WISH细胞时密度不宜太高，否则细胞数量过多，生长状态受影响，且不易观察。5．正式测定待检样品前，可做预实验确定待检验样品预稀释倍数。6．在染色以前的各个步骤要严格无菌操作，试验前用紫外灯照射超净台至少30 min。7．本实验亦可先在细胞培养板中加入系列稀释的干扰素，然后再接种WISH细胞，培养过夜使细胞贴壁为单层后加入病毒液攻毒。各参数同上述标准方案。回复
1. 对于细胞因子学活性检测，如果标准品没有失活，常规情况下20u/ml就已达到最大值（但这取决于细胞密度和培养时间）。所以建议标准品可做如下稀释：40，20，10，5，2.5，1.25，0.62，0.31，0.16，0.08 u/ml，0。值得注意的是，从公司买来的标准品就已经丢失了很多活性。因此在正式实验前应该先做标准品活性校正。2. IL-2生物学活性检测可采用IL-2依赖细胞株CTLL。CTLL是C57BL/6来源的小鼠杀伤性T淋巴细胞细胞系，由Gills 1977年建立，只有在IL-2存在的培养基中才能生长。因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。3. IFN生物学活性检测最好采用对IFN刺激敏感的细胞株，如人羊膜上皮细胞WISH株、人喉癌细胞Hep-2株以及人胚肌皮或肺单层细胞。这些细胞在IFN的刺激下可产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水泡性口炎病毒（VSV）的攻击，是为细胞病变抑制法（cytopathic effect inhibition，CPEI）。而L929细胞系则常用于检测TNF的生物学活性。* 白细胞介素2(IL-2)的生物学活性测定(一) 原理IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，故称T细胞生长因子（ T cell growth factor, TCGF）。IL-2产生的水平反映T细胞的功能，不仅是免疫调节重要的研究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL是C57BL/6来源的小鼠杀伤性T淋巴细胞细胞系，由Gills 1977年建立，只有在IL-2存在的培养基中才能生长。因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。除CTLL外，丝裂原活化的T淋巴母细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。(二) 试剂和器材　　1．IL-2依赖的CTLL　　2．10％FCS-RPMI1640　　3．3H-TdR　　4．标准IL-2　　5．MTT, 酸性异丙醇，二甲亚砜（DMSO）　　6．PPO，POPOP，二甲苯　　7．9999型玻璃纤维滤纸　　8．96孔平底培养板　　9．细胞收集仪　　10．CO2孵箱　　11．液闪计数仪(三) 操作步骤　　可根据实验室条件，选用3H-TdR掺入法和MTT法。　　1．3H-TdR掺入法：　　 1）IL-2依赖的CTLL用10％FCS-RPMI1640洗涤2次，每次1000 rpm，5 min， 除去原培养液中的IL-2。　　 2）调整活细胞数1×105 /ml。　 　3）96孔平底培养板中每孔加100ul，CTLL悬液（1×104／孔）。　　 4）加入不同稀释度标准IL-2和待测样品。　　 5）37℃、CO2孵箱，培养18~24h。　　 6）每孔加3H-TdR 0.5 uCi /50ul。培养4~6h。　　 7）用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
8）干燥后，移入液闪瓶中，加入1 ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值。　　计算(举例)将标准IL-2不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的cpm值作图，纵轴采用概率座标（probit），横座标为Log2稀释倍数。从50％的最高cpm值画一横线，与标准和待检斜线的交点，即可计算出待检样品IL-2的活性单位。如标准品50％最大cpm值时为1u/ml，则待测标本1∶4时为1u/ml，原液则为4u/ml。　　2．MTT法：MTT[3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，四甲基偶氮唑盐]可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲月替（Formazan），将结晶的甲月替 溶解释放，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中IL-2的水平。在掌握良好的实验条件下，MTT法的敏感性可接近3H-TdR同位素掺入法。
1）IL-2依赖的CTLL用10％FCS-RPMI1640洗涤2次，每次1000rpm，5min，除去原培养液中的IL-2。　　　2）调整活细胞数1~2×105 /ml　　　3）96孔平底培养板中每孔加100ul，CTLL悬液（1~2×104／孔）　　　4）加入不同稀释度标准IL-2和待检样品，100ul /孔，每份设3个重复孔　　　5）CO2孵箱培养18~24h。　　　6）每孔加10ul MTT（5mg /ml溶于PBS），37℃ 培养4h。　　　7）轻轻吸出150ul上清，加入150ul二甲亚砜（DMSO）或酸性异丙醇（异丙醇溶于0.04N HCl）。　　　8）溶解10min，测OD值（570nM）。　　(四) 注意事项　　1．CTLL细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增殖。CTLL对IL-15刺激有明显的增殖反应，如待测样品为培养上清时应加注意。　　2．避免同位素污染。　　3．加标准IL-2或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。　　4．加入3H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始明显死亡。
5．CTLL细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。* 干扰素(IFN)生物学活性检测干扰素（interferon，IFN）是一类低分子量蛋白质，在机体免疫调节、抗病毒感染和抑制肿瘤细胞生长中具有重要作用。根据其产生细胞不同和理化性质、生物学特性的差异可分为?干扰素（IFN-a）、?干扰素（IFN-b）和?干扰素（IFN-g）。检测干扰素的方法主要有定量测定（常用ELISA法）和生物学活性的检测，两者常可互补应用。(一) 原理干扰素能刺激某些指示细胞（如人羊膜上皮细胞WISH株、人喉癌细胞Hep-2株以及人胚肌皮或肺单层细胞）产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水泡性口炎病毒（VSV）的攻击，是为细胞病变抑制法（cytopathic effect inhibition，CPEI）。以能抑制50％细胞病变（CPEI50）的干扰素最高稀释度作为1个单位。根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。测定时应同时设置干扰素参考标准品对照，以便将测定结果转换为国际单位（IU/ml）。(二) 试剂和器材1．WISH细胞株，在完全培养液中呈单层贴壁生长。2．水泡性口炎病毒（VSV），-70℃保存。使用时以MEM完全培养液稀释至工作浓度。3．10％ FCS-MEM培养液，或10％ FCS-RPMI-1640培养液，4℃保存。4．消化液：0.2g EDTA、8g NaCl、0.2g KCl、1.152g Na2HPH4、0.2g KH2PH4，以双蒸水溶解至1000 ml，121℃、15 min高压灭菌或除菌过滤，4℃保存。或以不完全MEM或RPMI-1640培养液配制0.25％ 胰酶、0.02％ EDTA消化液，除菌过滤，-20℃保存。5．染色液：50 mg 结晶紫加入20 ml乙醇溶解，双蒸水加至100 ml。6．脱色液：50 ml乙醇，50 ml双蒸水，0.1 ml乙酸。7．干扰素标准品及待检样品，-70℃保存。8．PBS：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPH4、0.24g KH2PH4，以双蒸水定容至1000 ml，121℃、15 min高压灭菌或除菌过滤。9．微量移液器、96孔板、培养瓶、吸管、烧杯等。10．CO2孵箱、超净台、酶联读数仪等。(三) 操作步骤1．铺板：弃去WISH瓶中培养液，用PBS洗2次后消化收集细胞，800~1000 rpm离心6min，以MEM完全培养液调节细胞密度为2~3X105个细胞／ml，接种于96孔中，每孔100ul，37℃、5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁为单层。2．制备干扰素溶液：取干扰素标准品，按说明书溶解后，以MEM完全培养液先预稀释至103 IU/ml。待检样品应视具体情况做相应稀释。3．加样：取预先铺好WISH细胞的，将不同稀释度的干扰素标准品或待检样品溶液移入相对应的孔中，每孔100ul。每个浓度应做复孔或三孔重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。37℃、5％ CO2条件下培养过夜。4．制备病毒液：攻毒剂量为100 TCID50（半数组织培养感染量度，median tissue culture infective dose），取保存的VSV用MEM完全培养液稀释至工作浓度。5．攻毒：弃去WISH细胞培养板培养液，甩干，加入工作浓度的病毒液，每孔100ul。细胞对照孔不加病毒液，加入MEM完全培养液，每孔100ul。37℃、5％ CO2条件下培养24 h。6．染色：弃去上清，每孔加入50ul结晶紫染色液，室温放置30 min。7．脱色：流水小心冲去染色液，甩干残留水分，每孔加入100ul脱色液，室温放置5 min。8．比色：用ELISA自动读数仪测定每孔570 nm处OD值，记录结果。9．结果计算：利用统计软件或直线回归法处理数据。分别计算各干扰素样品的半效稀释倍数（即从样品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数），按下式计算试验结果：待检样品效价＝（标准品效价×待检样品半效稀释倍数×待检样品预稀释倍数）
/（标准品半效稀释倍数×标准品预稀释倍数）(四) 注意事项1．本法对天然培养上清或重组干扰素均可检测活性。2．亦可使用Hep-2细胞株、人胚肌皮或肺单层细胞检测干扰素生物学活性，操作步骤基本同WISH细胞。3．染色方法也可采用其他活细胞染色法，如刚果红摄入法、MTT染色法。4．铺WISH细胞时密度不宜太高，否则细胞数量过多，生长状态受影响，且不易观察。5．正式测定待检样品前，可做预实验确定待检验样品预稀释倍数。6．在染色以前的各个步骤要严格无菌操作，试验前用紫外灯照射超净台至少30 min。7．本实验亦可先在细胞培养板中加入系列稀释的干扰素，然后再接种WISH细胞，培养过夜使细胞贴壁为单层后加入病毒液攻毒。各参数同上述标准方案。
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钩端螺旋体病患者血清TNF-α、IL-6、IL-2的检测及分析
&&&&&&&&&　　近日，川北医学院附属医院感染科研究人员发表论文，旨在检测49例流感伤寒型、黄疸出血型、肺出血型钩端螺旋体病（钩体病）患者TNF-、IL-6、IL-2的水平，分析这些细胞因子在钩体病发生发展中的作用。研究指出，钩体病患者血清中TNF-、IL-6水平明显增高，可能与钩体病发生发展及器官损伤有关。该文发表在2013年第02期《成都医学院学报》杂志上。 　　采用ELISA法检测钩体病患者血清TNF-
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　　近日，川北医学院附属医院感染科研究人员发表论文，旨在检测49例流感伤寒型、黄疸出血型、肺出血型（钩体病）患者TNF-&、、的水平，分析这些细胞因子在钩体病发生发展中的作用。研究指出，钩体病患者中TNF-&、IL-6水平明显增高，可能与钩体病发生发展及器官损伤有关。该文发表在2013年第03期《成都医学院学报》杂志上。
　　采用法检测钩体病患者血清TNF-&、IL-6、IL-2的水平，统计分析3种类型钩体病患者以及健康对照组血清中3种细胞因子水平的差异性。
　　钩体病患者血清TNF-&、IL-6水平均显著高于对照组（P&0.01）；钩体病3种临床类型相比，肺出血型患者血清TNF-&水平显著高于流感伤寒型及黄疸出血型（P&0.05）；IL-6在黄疸出血型、肺出血型患者血清中的水平也明显高于流感伤寒型（P&0.01）；钩体病患者血清IL-2水平与对照组相比差异无统计学意义（P&0.05）。
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