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报道基因技术|
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什么是质粒（plasmid），常用的质粒结构组成是什么
回答者：匿名用户
&1．概念：质粒是存在于细菌染色质之外的具有自主复制能力的双链环状DNA分子。
&&& 用作克隆载体的质粒应具备以下条件：①分子量较小，在细胞中有较多的拷贝数。②松弛型。③具有一个以上的遗传标志。④具有数个或一个单一的酶切位点。
2．常用质粒的结构组成
&&&（1）最常用的pBR322：大小，4362bp，Mr 2.7&106；松弛型复制；含有两个抗性基因（ampr、tetr），两个抗性基因有独特的插入DNA片段的克隆位点，从而使耐药基因失活，在另一个抗生素存在下进行选择性培养，使转化的细胞生长。例如，若克隆在pBR322的PstI切点，转化大肠杆菌中的质粒具有抗四环素能力，而失去了抗氨苄青霉素的能力。
（2）pUC质粒：pUC质粒兼有M13和pBR质粒的许多特点，使用起来更为方便。这些小的质粒（2.7kb）系列含有pBR322抗氨苄青霉素基因，pBR322复制原点和大肠杆菌lacZ基因，在lac区内有由独特限制酶识别点组成的多接头顺序。pUC质粒属于&松弛型&质粒，可在氯霉素存在下扩增。当DNA片段被克隆到pUC的lac区时，lac基因就失活。将这些质粒转化到lac&大肠杆菌中，在IPTG和X-gal存在下培养，会得到白色或清亮的克隆。不含插入物的pUC质粒转化同样的细胞就能产生蓝色克隆。pUC质粒系列可在克隆区构建内切酶位点顺序相反的一对载体，这种载体对于一个有不对称末端插入物的测序从两端都可以进行。下面述及的M13系列也有这些特性。
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大肠杆菌DH5α中的D,H,5,α分别代表什么意思啊
hsdR17，基因型, relA1：supE44属于K12系列的,recA1,endA1,gyrA96, thi-1，常用作克隆载体, Δ lacU169 (φ80 lacZΔM15)
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出门在外也不愁第一节 基因工程
第一节 基因工程
经限制性酶酶切的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆。一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(host
cell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体BAC、HACYAC等。现在使用的各种载体都是用基因工程方法构建的。作为载体DNA分子，需要具备以下四个条件：
具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制，
具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS或称为polylinker
region)，即具有多种限制性酶的切点，而每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内，以保持载体的自主复制特性及表型标记性状。
至少具有一个选择标记基因，这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因，而宿主细胞则没有这种基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。
易从宿主细胞中回收。
(一) 细菌质粒 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子(见第六章第七章)。早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于10kb(
1000bp =1kb)的外源DNA片段。这些质粒的适应范围广，拷贝数多。尽管在转化时仅一个质粒进入一个宿主细胞，但复制后每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。这一特点十分有利于大量扩增克隆的DNA片段，作为克隆载体应用。
现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。例如pUC18质粒(图9－3
)就具有以下特点：①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段；②拷贝数多，在每个宿主细胞的拷贝数可达到500个；③多克隆位点的酶切位点多，克隆方便；④具有a
互补显色表型，可作为检测重组质粒存在与否的选择标记。a
- 互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(a
- 肽)，在与a - 肽缺失的lacZ酶混合后(体外或体内)，能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象。pUC
系列的载体就是利用这一特点而设计的。如图9－3所示,
pUC18质粒带有细菌DNA lacZ基因启动子、操纵子、调节基因以及lacZ基因a
- 肽(N端的146个氨基酸)，在lacZ基因内插入了一个多克隆位点，这段序列与lacZ在同一阅读框架内。pUC18表达的a
- 肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基，仍具有a -
互补功能。因此，将pUC18质粒转入带有lacZ基因a -
肽缺失的宿主细菌细胞后，在含有5-溴-4-氯-3-引哚-b -半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoly-b
-galactopyranoside, X-gal)及IPTG的培养基上，质粒产生N端的146个氨基酸，宿主菌产生C端的氨基酸，经a
- 互补可产生有功能的lacZ酶，水解X-gal产生一种蓝色物质，附着于细菌细胞上使菌落呈蓝色。当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时，破坏了a
- 肽的阅读框架, 或导入转录或翻译终止信号，使a -
肽不能正确表达，仅宿主菌产生的C端氨基酸没有lacZ酶活性，结果在上述同样培养条件下，形成的菌落为白色。所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆。
(二) λ噬菌体 λ噬菌体基因组全长49kb,其核酸序列及基因功能和表达调控已研究得十分清楚。λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇(central
gene cluster)，位于两端的为DNA左、右臂。研究表明，λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,
而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。根据这一特点，在改造利用λ噬菌体作载体时，在两个臂与中间基因簇连接处导入限制性酶切点(如EcoRⅠ)，酶切λDNA后分别得到两个臂(lambda
arms)，再将经同一种酶酶切的外源DNA片段与两个臂连接构成重组DNA分子(图9－4)。形成的重组DNA分子用噬菌体蛋白包装提取物体外包装(in
vitro packaging)后，经转导感染具有适宜基因型的宿主细菌菌株，噬菌体再在细菌细胞内繁殖、扩增，在平板培养基上形成噬菌斑。然后据噬菌斑的形态或显色表型(a
- 互补，如M13系列载体)，即可鉴定出阳性克隆。
λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，用作cDNA(如λgt10,
λZAPⅡ)或核DNA(如 EMBL3 ，GEM12)克隆的载体。在基因库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。
(三) 柯斯质粒 柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图9－5)。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)
，细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因。
尽管这种质粒的分子量较小，但它可接受长达50kb的外源DNA片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克隆，还与YAC克隆(见下面YAC载体)系统结合，用于基因作图分析。
(四) 穿梭载体 穿梭载体(shuttle vectors )是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(Autonomously
replicating sequence, ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。
酵母菌的YEp系列载体(图9－6 )以及YIp、YCp和YRp系列载体均是穿梭载体。YEp(yeast
episomal plasmid)为酵母菌附加体质粒,它的ARS序列来自酵母菌的内源附加体2μ,可使每个细胞的拷贝数保持在100个左右。YEp
还具有2μ的两个顺式调控元件,质粒分配序列和2μ调控元件。这两个元件可使在细胞分裂中各细胞分配的质粒数相近，2μ序列不断扩增。YEp
的Amp和四环素(Tc)抗性用于在细菌中选择，而 URA3(
尿嘧啶 )基因用于在酵母菌中选择。YEp24具有Amp及Tc二个抗生素抗性基因，可将外源DNA片段插在抗生素基因中，通过插入失活,选择阳性克隆。尿嘧啶营养缺陷型菌株URA3―不能合成尿嘧啶，在不含附加尿嘧啶的培养基上不能生长。将带URA3基因的YEp转化URA3―酵母菌菌株后，阳性克隆可在不含附加尿嘧啶的培养基上生长，而非阳性克隆则不能生长。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究。
(五) 细菌人工染色体 在进行真核生物基因组的分析及作图中，发现上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体(bacterial
artificial chromosome, BAC)载体就是为了克隆更大的外源DNA片段而设计构建的。
BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。如第六章第七章所述，F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100
kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9－7)，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)及质粒分配(par
E，par A, par B )所必须的最少序列。这些基因均来自F因子。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在pBeloBAC11中，多克隆位点位于lacZ基因内，因此可采用选择pUC18阳性重组子的方法，即α-互补显色法选择阳性BAC重组子。此外，在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。
定，为分析YAC克隆提供了直接依据。将来自YAC克隆的序列与酵母菌基因组序列比较，即可以完全排除重组YAC载体来自酵母菌DNA的可能性。
同YEp载体一样，YAC也具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100-1000
kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(human
artificial chromosome，HACYAC)的研究。
目前应用最多的YAC载体是pYAC4(图9－8)，这个载体具有以下主要结构特点：①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌着丝粒序列(centromere
4， CEN4)；③一个自主复制序列(ARS 1)；④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymenna)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuffer,
HIS 3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点;⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4
tRNA 基因内。Sup4基因编码赭色抑制tRNATYR,抑制赭色表型(成为白色)。如果用不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆的筛选工作。
在利用pYAC4载体克隆时，要将pYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。
(七) Ti质粒及其衍生载体 应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物的载体系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。
Ti质粒是一种细菌质粒(图9－9 )，它自然存在于一种革兰氏阴菌――土壤农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤(grown
gall tumors)。植物产生的这种根瘤细胞与动物的癌细胞(tumors)
相似，它们能独立地、不受控制地生长。根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor-
inducing,Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA(transfer
DNA,T-DNA)，当T-DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine),作为土壤农杆菌的碳源和氮源。
利用缺失、突变、转座及互补等方法对Ti质粒的研究，发现Ti质粒具有以下特点：
(1) Ti质粒具有五个主要功能区域(图9－9)，它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmid
transfer)、冠瘿碱代谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。
(2) T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfect
direct repeats)，右端的这段序列称为右界(right border, RB),
左端的序列称为左界(left border,LB)。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
(3) Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。根据Ti质粒的特点，现已构建成以下二套由Ti质粒衍生的载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体。
(1) 双元载体(binary vectors)：这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及农杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外，还有细菌选择标记基因，在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如pBin19载体，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记。双元载体的另一个质粒，如与pBin19匹配使用的pAL4404质粒是非致病Ti质粒，该质粒没有T-DNA序列，具有Ti质粒的毒性基因，毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导入土壤农杆菌后，经农杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。
(2) 共整合载体(integrated vectors)：这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒(如pMON200)，另一个带有毒性基因(如pTIB6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在土壤农杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。
还有另一类用于植物基因工程的载体，不经土壤农杆菌介导而是在其它物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中。这种载体与Ti衍生质粒不同，与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作细菌选择标记；具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如pAHC25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞。&&网络课程
：网络课程--多媒体课件&&
&第一节 基因工程
本章教学时数：4学时。
本章重点：基因工程和基因组计划的基本流程。
本章难点：分子标记和基因图谱；研究基因功能的方法。
&&&&“遗传工程”有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常所讲的基因工程。本节只介绍基因工程。
&&&&遗传工程或基因工程，是人类将分子遗传学的理论与分子生物学技术相结合，有目的地改造、创建动植物新品种、工业化生产生物产品、诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。本章将介绍遗传工程的基本原理和方法，以及一些应用实例。此外，还将介绍基因组学的发展及应用前景。
一、基因工程概述
基因工程(gene
engineering)的定义：
&&&&基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并将其导入原先没有这类分子的寄主细胞内，能够持续稳定地繁殖。
&&&&基因工程是20世纪70年代初应运而生的一门新技术。1971年美国的H.O.Smith等人利用从细菌中分离的一种限制性核酸内切酶酶切病毒DNA分子，标志着基因工程或DNA重组时代的到来。
&&&&1972年美国斯坦福大学的P.Berg等人于用一种限制性核酸内切酶EcoRⅠ在体外分别切割猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体DNA，再将这两种DNA片段放在一起，用T4
DNA链接酶链接起来，结果得到了一种新的DNA分子DDSV40和λDNA的重组DNA分子。由于他们完成了世界上第一个体外DNA重组试验，Berg同Gilbert、Sanger分享了1980年度的Nobel化学奖。
&&&&1973年S.Cohen等人进一步将酶切后的外源DNA
片段与质粒DNA链接起来，构成一个重组质粒(recombinant
plasmid)，并将这个重组质粒转入E.coli细胞。这些开创性的工作为基因工程建立了一套完整的方法和体系，成为现代生物学发展史上的里程碑。
&&&&基因工程技术的建立，使实验生物学领域产生了巨大变革。1982年，经美国食品及药物管理局批准，采用基因工程方法在细菌中表达生产的人胰岛素进入市场，成为第一个直接造福人类的基因工程产品。1985年转基因植物获得成功，1996年克隆羊诞生。现在，人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态，生产药品、疫苗、牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。现在，基因工程技术已经与人类的日常生活息息相关。
&&&&基因工程中的DNA重组主要是指将来源不同的DNA拼接重组，创造自然界中原本没有的DNA分子。这种重组不同于经典遗传学中经过遗传交换产生的重组，它跨越了天然的物种屏障，可以把来自任何一种生物的基因放置到与其毫无亲缘关系的物种中去，实现有目的的遗传物质交流。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。
这一技术主要包括以下内容:
&&&&①从细胞和组织中分离目标DNA，通常是人类感兴趣的目的基因。
&&&&②利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restriction
endonuclease)酶切DNA 分子，制备人类所需要的DNA片段。
&&&&③将酶切的DNA
片段与载体DNA链接，构建重组DNA分子（recombinant DNA
molecule）。
&&&&④将载体与DNA片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞。该重组DNA分子能在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆(clone)。
&&&&⑤重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞,使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝。
&&&&⑥能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子，供理论研究使用。或者使克隆的DNA转录成mRNA、翻译成蛋白质，并分离、鉴定基因产物，直接供人类应用。
&&&&因此，因工程又可称为重组DNA技术(recombinant
DNA technique)、分子克隆(molecular cloning)、基因操作(gene manipulation)、基因克隆(gene
cloning)等。
基因工程的工具酶
体外重组DNA实验需要各种各样的工具酶，如：
&&&&核糖核酸酶（RNase）
&&&&脱氧核糖核酸酶（DNase），包括外切核酸酶(exonuclease)和内切核酸酶(endonuclease)
&&&&DNA连接酶(ligase)
&&&&DNA聚合酶（DNA
polymerase）
&&&&RNA聚合酶（RNA polymerase）
&&&&反转录酶（reverse
transcriptase）
&&&&最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restriction endonucease）
限制性内切核酸酶
&&&&限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction
enzyme)是基因工程的基本工具。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。这是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断（）。
限制性内切核酸酶的命名原则：
&&&&根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。
&&&&名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母，大写，斜体。
&&&&名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母，小写，斜体。
&&&&名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，正体。如果没有菌株名称就不写。
&&&&名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来的第一种酶为Ⅰ，第二种酶为Ⅱ，等等。
&&&&如EcoRⅠ来自大肠杆菌Escherichia
coli，读作echo-r-one；
&&&&Hind Ⅲ 来自Hemophilus
influenzae,读作hind-three。现在已经分离和鉴定出300多中不同的限制性内切核酸酶。
&&&&限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤：识别特定的DNA序列；在特定的位置切割DNA分子。根据其作用特点,可以将限制性酶分为三种类型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。在基因工程中用途最广泛的是Ⅱ型限制酶。
&&&&Ⅰ型限制酶有特定的识别序列，但切割位置远离识别位置，有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子。在基因工程中没有什么用途。
&&&&Ⅲ型限制酶有特定的识别序列，切割位置在识别序列3’端相距说20bp处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。
&&&&Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列，而且其切割位点就在识别序列内部。基因工程中广泛应用的是这一类限制性酶。
&&&&第Ⅱ类限制性酶识别的位点是对称的，在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同，称为回纹对称序列(palindrome)。EcoR
Ⅰ识别的回纹对称序列及切割点如所示。
&&&&EcoR Ⅰ以交错方式切割DNA
双链,产生两个相同的单链黏性末端(sticky end)。如果来自不同生物的DNA 具有相同的回纹对称序列，经EcoR Ⅰ酶切后的DNA
片段就具有相同的单链黏性末端。若将这两种片段放在一起，在适宜的条件下，他们可以经过碱基互补配对使黏性末端的形成氢键，再在DNA链接酶的作用下形成磷酸二脂键,链接成重组DNA
&&&&第Ⅱ类限制性酶中还有另一类酶，如Sam
Ⅰ,它们酶切DNA双链后，产生的片段具有平齐末端(blunt end)。将两个具有平齐末端的片段放在一起，也可在DNA链接酶的作用下连接成重组DNA分子。（）中列出部分常用的限制性酶，其中有的酶酶切DNA
后产生黏性末端，有的产生平齐末端。
&&&&在重组DNA实验中，将外源DNA片段运送进宿主细胞(host
cell)进行扩增或表达的运载工具称为载体(vector)。载体也是DNA分子
&&&&所有的载体都是在实验室里加工而成的，自然界不存在现成的、可以直接应用的载体。
&&&&经限制性酶酶切的DNA
片段或基因，是不能直接进入宿主细胞进行克隆的。一个DNA片段只有与适合的载体DNA链接构成重组DNA，在载体的运载下才可以高效率地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增或者表达。
&&&&可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体（BAC）、酵母菌人工染色体（YAC）和人类人工染色体（HAC）等。现在使用的各种载体都是用基因工程方法构建而成的。作为载体DNA
分子，需要具备以下4个条件：
&&&&①具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动所携带的外源DNA片段一起复制。表达载体还需要有转录启动子。
&&&&②具有多个克隆位点(multiple
cloning site，MCS，或称polylinker region)，即具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA
片段。这些酶切位点不能存在于复制原点或抗性选择标记基因内，以保持载体的自主复制特性及表型选择标记性状。
&&&&③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个，否则当用这种限制酶切割时就会将载体切成2个以上的片段，无法用于实验。
&&&&④至少具有一个选择标记基因，这个基因通常是抗菌素的抗性基因或编码某种酶的基因，而宿主细胞没有这种基因，使有或无载体的宿主细胞具有容易鉴别的表型。
&&&&此外，载体还必须容易从宿主细胞中回收。
㈠细菌质粒
&&&&质粒（plasmid）是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、且容易导入和回收的环状双链DNA分子。早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于10kb的外源DNA片段。这些质粒的适应范围广，拷贝数多，尽管在转化时仅一个质粒进入宿主细胞，但复制之后每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。这一特点十分有利于作为克隆载体大量扩增外源DNA片段。
现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。例如pUC18质粒（)。
pCU18具有以下特点：
&&&&①分子量小(2.69kb),但可以接受较大的外源片段；
&&&&②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个；
&&&&③酶切位点多，克隆方便；
&&&&④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在与否的选择标记。
α-互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象。pUC系列的载体就是利用这一特点而设计的。
pUC18质粒带有细菌DNA lacZ基因启动子、操纵子、调节基因以及lacZ 基因α-肽(N端的146个氨基酸)，在lacZ
基因内插入了一个多克隆位点，这段序列与lacZ在同一个阅读框架内。
pUC18表达的α-肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基，仍具有α-互补功能。因此，将pUC18质粒转入带有lacZ
基因α-肽缺失的宿主细菌细胞内后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-galactopyranoside,
Xgal)及IPTG的培养基上，质粒产生N端的146个氨基酸，宿主菌产生C端的氨基酸，经α-互补可产生有功能的lacZ酶，水解X-gal产生一种蓝色物质，附着于细菌细胞上使菌落呈蓝色。当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时,破坏了α-肽的阅读框,或导入转录或翻译终止信号，使α-肽不能正确表达，仅宿主细菌产生的C端氨基酸没有lacZ
酶活性，结果在上述同样培养条件下，形成白色菌落。所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆（）。
㈡λ噬菌体
&&&&λ噬菌体基因组全长49kb，其核酸序列及基因功能和表达调控已研究得十分清楚。
λ噬菌体的DNA中间约1/3的序列为中间基因簇(central gene cluster),位于两端的为DNA
左臂和右臂。研究表明，λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA
片段取代而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。根据这一特点，在改造λ噬菌体做载体时，在两个臂与中间基因簇链接处导入限制性酶切点(如EcoR
Ⅰ)，酶切λDNA后分别得到两个臂(lambda arms)，再将经同一种酶酶切的外源DNA片段与两个臂链接构成重组DNA分子()。形成的重组DNA分子用噬菌体蛋白包装提取物在体外包装(in
packaging)后，感染具有适宜基因型的宿主细菌菌株，噬菌体再在细菌细胞内繁殖、扩增，在平板培养基上形成噬菌斑。然后根据噬菌斑的形态或显色表型(α-互补，如M13系列载体)，即可鉴定出阳性克隆。
&&&&λ噬菌体载体可接受15－30kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体也可作为表达载体，用作cDNA(如λgt10,λZAPⅡ)或核DNA(如EMBL3,GEM12)克隆的载体。在基因库筛选中,
λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。
㈢柯斯质粒
&&&&柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因.
&&&&这种质粒尽管分子量较小，但它可接受长达50kb的外源DNA片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个DNA
片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其他调控序列。柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克隆，还可以与YAC克隆(见下面YAC载体)系统结合，用于基因作图分析。
㈣穿梭载体
&&&&穿梭载体(shuttle
vector)是指能在两种不同的生物中复制的载体，例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。
&&&&酵母菌的YEp系列载体以及Yip、YCp和YRp系列载体均是穿梭载体。YEp为酵母菌附加体质粒，它的ARS序列来自酵母菌内源附加体2μ，可使每个细胞的拷贝数保持在100个左右。YEp还具有2μ的两个顺式调控元件：质粒分配序列和2μ调控元件。这两个元件可使在细胞分裂过程中各个子细胞获得的质粒数相近,
2μ序列可使载体不断扩增。YEp的Amp和四环素(Tc)抗性用于细菌中选择，而URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中选择。YEp24具有Amp及Tc两个抗生素抗性基因，可将外源DNA片段插在抗生素基因中，通过插入失活选择阳性克隆。尿嘧啶营养缺陷型菌株URA
不能合成尿嘧啶，在不含尿嘧啶的培养基中不能生长。将带有URA3基因的YEp转化为URA
3-酵母菌菌株后,阳性克隆可在不含尿嘧啶的培养基上生长,而非阳性克隆则不能生长。很多酵母菌的穿梭载体用于功能互补法分离和鉴定真核生物基因的研究。
㈤细菌人工染色体
&&&&在进行真核生物基因组的分析及作图中，发现上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段。细菌人工染色体(bacterial
artificial chromosome,
BAC)载体就是为了克隆更大的外源DNA片段而设计的。
&&&&BAC载体是基于细菌质粒（性因子，F因子)的一些特点构建的。如第7章所述，F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，大小约100kb，同时能在细菌接合时转移1000kb
的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的大分子在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)及质粒分配(parE、parA、parB)所必须的最少序列。这些基因均来自F因子。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点。在pBeloBAC11中，多克隆位点位于lacZ基因内，因此可采用α-互补显色法选择阳性BAC重组子，与选择pUC18阳性重组子的方法完全相同。此外,在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子序列，用于制备RNA分子，进一步分析克隆基因的表达，作为染色体步行的探针以及测定克隆片段的序列。
㈥酵母人工染色体
&&&&酵母人工染色体(Yeast artificial
chromosome，YAC)是与前述的穿梭载体不同的另一类酵母菌穿梭载体。它是人类在对酵母菌生物学、遗传学的基本特征深入研究的基础上，结合穿梭质粒YEp的一些特点构建而成。YAC也是为适应真核生物基因组分析而发展起来的。1996年酵母菌基因组全部序列已经测定,为分析YAC克隆提供了直接依据。将来自YAC克隆的序列与酵母菌基因组序列比较，即可以完全排除重组YAC载体来自酵母菌DNA的可能性。
&&&&同YEp载体一样，YAC也具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100－1000kb
的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体（human artificial
chromosome，HAC）的研究。
目前应用最多的YAC载体是PYAC4，这个载体具有以下主要结构：
&&&&①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；
&&&&②酵母菌着丝粒序列
(centromere 4，CEN4)；
&&&&③一个自主复制序列(ARS1)；
&&&&④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna
thermophilp)的末端重复序列
(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；
&&&&⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuffer，HIS3)，以便PYAC4在细菌细胞中稳定扩增；
&&&&⑥Amp抗性选择标记及细菌质粒复制原点；
&&&&⑦一个EcoR
Ⅰ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码赭色抑制tRNATYR，抑制赭色表型
(成为白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了筛选阳性克隆工作。
&&&&在利用pYAC4载体克隆时，要将pYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。
㈦Ti质粒及其衍生载体
&&&&应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物的载体系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导人植物细胞的植物表达载体。
&&&&Ti质粒是一种细菌质粒，它自然存在于一种革兰氏阴性菌――根瘤土壤杆菌（Agrobacterium
tumefaciens）细胞中。根瘤土壤杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。植物产生的这种根瘤细胞与动物的癌细胞
(tumor)相似，它们能独立地、不受控制地生长。根瘤细胞的形成是因为根瘤土壤杆菌中存在着一种诱导瘤细胞
(tumor-inducing，Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA（transfer
DNA，T-DNA），当T－DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱 (opine)，作为根瘤土壤杆菌的碳源和氮源。
Ti质粒的特点
&&&&利用缺失、突变、转座及互补等方法对Ti质粒的研究，发现Ti质粒具有以下特点:
Ti质粒具有5个主要功能区域。它们分别是T-DNA、质粒转移 (plasmid transfer)、冠瘿碱代谢 (opine catabolism)、复制原点
(oir)和毒性区域 (vir)。
&&&&(2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复
(imperfect direct repeat)序列，右端的这段序列称为右界 （right border，RB），左端的序列称为左界 (left
border，LB
)。T-DNA内的致瘤基因诱导根瘤细胞，根瘤细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（disarm）后，将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组中去。
&&&&(3)vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。
2.Ti质粒的衍生载体
&&&&根据Ti质粒的特点，现已构建成以下两套由Ti质粒衍生的载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体。
&&&&(1)双元载体（binary
vector）。这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外，还有细菌选择标记基因，在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如pBin19载体，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因
(AphI)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉纛抗性基因（nos-NptⅡ）作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及a-互补显色标记。双元载体的另一个质粒，如与pBin19匹配使用的pAL404质粒是非致病Ti质粒，该质粒没有T-DNA序列，具有Ti质粒的毒性基因，毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导人根瘤土壤杆菌后，经根瘤土壤杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。
&&&&(2)共整合载体
(integrated vector)。这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒 (如pMON200)，另一个带有毒性基因
(如pTIB6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。
&&&&还有另一类用于植物基因工程的载体，不经根瘤土壤杆菌介导而是在其他物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中。这种载体与乃衍生质粒不同，与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作细菌选择标记；具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如pAHC25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞。
四、基因的分离与鉴定
&&&&一般而言，一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、外显子、内含子及终止子。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA曾是细胞中最难分析的大分子。但DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作和分析的大分子。利用重组DNA技术，可从一个含有几万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因，分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程提供目的基因。
(一)从基因库中分离基因
&&&&基因库
(library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。
1．构建基因库
&&&&根据克隆的核酸序列的来源，基因库可分为核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。
&&&&(1)核基因库
&&&&核基因库 (genomic
library 或 genomic
bank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度
(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体 (如EMBL)
连接构成重组DNA分子，根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组DNA分子转化感受态E.coli细胞，收集所有菌落即成为质粒基因库。如果载体是噬菌体或cosmid，则将重组DNA分子体外包装成噬菌体后，感染细菌细胞，将所得到的所有重组噬菌体集中即是基因库。如果载体为BAC或YAC,将重组人工染色体导人相应的宿主细胞，收集筛选得到的所有细胞即成为基因库。
&&&&理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目较小，就可以达到这个目的。因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体。
&&&&若构建的基因库是以分离结构基因为主要目的，通常选用λEMBL，λGEM或cosmid作载体。而那些将用于基因组作图和分析的基因库，则多选择BAC或YAC为载体。检测构建的核基因库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算:
&&&&式中的N为所需克隆总数，P代表一个特定基因序列出现的概率，a为插入载体的片段的平均长度，t为基因组全序列长度。例如人类基因组DNA分子量为3.0×106kb
，以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，P为0.99构建的基因库应有8.1×105个重组噬菌体。
(2)染色体基因库
&&&&将基因组的一部分
(如一条染色体)用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带
(polytene)，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。研究发现这一段染色体不仅包括白色
(white)及缺刻 (notch)等基因，还包括一个转座因子的原始位点。
&&&&在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术(flow
cytometry)将人类染色体分开后，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组的作图和分析。这一技术是利用两种可分别与 和
碱基对结合的荧光染料标记有丝分裂中期染色体，标记的染色体在流动经过激光束时发出荧光，再经光度计据其荧光强度及分布，鉴别分拣出不同染色体。这一技术已用于构建人类基因组所有单个染色体基因库。
&&&&在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳
(pulsed field electrophoresis,
PFGE)方法，将酵母菌的16条染色体据其分子量大小分开后，用于构建单个染色体基因库，这在基因组分析中发挥了重要作用。
&&&&cDNA库是以mRNA为模板，经反转录酶
(reverse transcriptase)合成互补DNA(complementary
DNA，cDNA)构建的基因库。
&&&&绝大多数真核生物mRNA的3'端具有一段多聚A(poly A)尾端序列。利用一段多聚T(poly
T)为引物(primer)，与poly A互补配对，在反转录酶作用下，以poly
T为引物合成一条与mRNA互补的DNA（称为互补DNA），即第一条DNA链。形成RNA-DNA杂合双链。第一条互补DNA链形成时，通常在其3'末端会形成发夹结构，以发夹结构为引物合成第二链DNA，再用Sl核酸酶将发夹结构的单链部分降解，就得到了双链DNA。也可在形成RNA-DNA杂合链后，用RNA
H酶 (RNase H)在mRNA链上产生一些缺刻
(nick)，形成很多RNA分子小片段，在DNA聚合酶的作用下，以这些RNA小片段为引物引导合成第二条DNA链。而对那些没有poly
A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸
(hexamer)为引物合成第一条链，再用上述方法得到双链DNA。
&&&&得到的双链DNA分子经两端补齐后，以带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载体
(通常是λ噬菌体)连接，再用类似核基因库中介绍的方法，制备cDNA库.
&&&&cDNA库与核DNA库不同，cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。
&&&&在实际工作中，构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA库对于研究基因的表达模式和分离某一特定基因是十分有用的。如果要分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因，可用该细胞或组织的mRNA构建cDNA库，则很容易得到这个基因。例如，动物的红细胞中具有大量血红蛋白，用红细胞的mRNA构建cDNA库，从中选择球蛋白基因就十分方便。但是，从cDNA文库中克隆到的基因一般只有编码序列而没有相应的调控序列。这是cDNA文库的一大缺陷。通常将cDNA库与核基因库配合使用，这样既能得到基因的编码序列又可得到基因的调控序列。
2．筛选基因库
&&&&从基因库中筛选、分离基因，可以据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。
&&&&大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡聚核苷酸)作探针
(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。这里以筛选λ噬菌体构建的λ噬菌体核基因库为例。筛选λ噬菌体构建的库常利用菌斑杂交法
(plaque hybridization)，将经重组噬菌体
(来自构建的基因库)感染的宿主细菌细胞与少量上层培养基混合后，倒在具有底层培养基的培养皿中，培养过夜，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。一个噬菌斑内的所有噬菌体都是一个噬菌体扩增的后代，所以一个噬菌斑就是一个克隆。再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维膜或尼龙膜上变性，使噬菌体DNA成为单链，然后用标记的探针
(也变性成单链)与膜上的噬菌体DNA杂交，将杂交膜用X光片放射自显影，检测杂交信号。凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆，在X光片上有杂交信号
(黑点)。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出并培养阳性噬菌斑，制备DNA，用作进一步分析。
3．阳性克隆的分析与鉴定
&&&&从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。
&&&&(1)限制性酶图谱。
&&&&构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆(subcloning)或同已知的其他序列比较（）。
&&&&上图表示一个7kb
DNA片段的限制性酶图谱构建方法。首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及其组合酶消化DNA。在这里，将分别用HindⅢ、SalⅠ以及HindⅢ与SalⅠ组合起来消化DNA。酶切的产物经琼脂糖凝胶电泳，再经溴化乙锭染色，在紫外灯下就可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。从凝胶电泳结果可见，用HindⅢ酶切产生一条6.2kb及一条0.8kb共两条带，证明原始DNA片段的长度为7kb，在该片段中仅有一个HindⅢ位点。用SalⅠ酶切也产生两条带，分别为5.8kb和1.2kb，说明这个片段也仅具有一个SalI酶切位点。根据这两种酶酶切的结果，这个DNA片段的限制性酶切图谱有两种可能的模式，很难确定两种酶的相对位置。当用两种酶同时酶切后，得到3条带，它们的长度分别为0.4kb、0.8kb和5.8kb。根据模式Ⅱ预计的3个片段应该是0.8、5.0和1.2kb，这与双酶酶切的结果不符。如按模式Ⅰ，则经两种酶消化后的3个片段长度分别是0.4kb、0.8kb和5.8kb，这与实验结果一致，因此模式Ⅰ就是这个7kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。
&&&&采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶切片段长度的多型性
(restriction fragment length
polymorphism，RFLP)来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。此外，上述经HindⅢ或SalⅠ消化的片段，可以亚克隆到pUCI8等质粒上，迸一步用于限制性图谱分析或序列测定。
(2)核酸分子杂交。
&&&&Southern
杂交分析 (Southern blotting)
是基因工程中常用的方法。这个方法是英国人Southern于1975年发明的，以发明者的姓氏命名。它是将琼脂糖凝胶上的DNA条带转移到一种膜上
(如尼龙膜)，用于分子杂交的方法。这个方法首先是将DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束以后经过变性处理，将凝胶上的DNA转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用X光片放射自显影检测杂交信号。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，放射自显影后就会检测到杂交带信号。
&&&&在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。Southern杂交还具有其他多种用途。例如分析基因组DNA某一个基因的拷贝数，用于RFLP分析，鉴定不同物种或亚种中的相关序列，检测基因重排和重复与疾病或癌症的关系等.
&&&&另一种与Southern杂交方法相似并广泛应用的方法是Northern杂交(Northern
blotting)分析方法。这一方法采用与Southern杂交相同的原理及程序，不同的是用RNA进行琼脂糖凝胶电泳，故用与Southern对应的Northern命名。随后，人们又将用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析的方法称为Western杂交
blotting)分析。
&&&&Northern杂交用于分析克隆的基因在某一细胞或组织中的转录水平，即检测mRNA的存在。其基本程序是从待分析的细胞或组织中提取总mRNA，经过琼脂糖凝胶电泳,然后转移并进行分子杂交。杂交的探针来自克隆的基因。如果膜上有与探针互补的RNA分子，则在X光片上可见到杂交信号带。Northern杂交广泛用于研究基因在不同细胞、组织或器官的表达模式，检测mRNA分子量大小以及mRNA加工过程中可能存在的不同方式，定量分析mRNA等。
(3)核酸序列测定。
&&&&只有将克隆后的DNA
片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个DNA片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用Sanger于1977年发明的双脱氧核苷酸链终止法
(dideoxynucleotide chain termination)。这一方法利用DNA聚合酶，在引物
(同位素或荧光标记)的引导下，以一条DNA链为模板，从5，到3，延伸形成可供测定的序列。在延长反应中除脱氧核苷酸外，还掺入一定比例的双脱氧核苷酸。具体方法是，将序列反应分为A、C、G和T
4管，每管中含有变性的DNA模板、DNA聚合酶、标记的引物、4种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸
(如A管中，即是腺嘌呤A双脱氧核苷酸，依此类推)。在DNA合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的DNA链中，在不同DNA链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在3’上没有游离的羟基
(-0H)，无法再连接另一个核苷酸，导致DNA链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的DNA分子。将4个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的4个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状DNA带，从底部往上阅读，即是5'到3'端的序列
图9－8 DNA测序原理
图9－9 DNA测序电泳图谱
&&&&现在，DNA测序的工作已经不需要每一个实验室自己去做，只要将DNA样品交给专业的测序公司，两三天就可以得到结果，快速而又准确。
(4)核酸序列分析
&&&&测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。
&&&&同源性比较是常用的方法之一。同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。首先可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNA
Data库的网址上比较，很快就可知道测得的序列与所有已知序列之间的同源程度。
&&&&另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。一个开放阅读框架（open
reading frame, ORF）就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号
(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。如果筛选分离的核酸来自cDNA库，则可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。但对于来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子，还需要与其他同源序列比较外显子-内含子交界序列(exon-intron
boundary)或结合相应的cDNA克隆序列一起分析，才能确定核酸序列的身份。
&&&&对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能研究。例如，将分离的核酸序列与载体构建成重组DNA分子，利用同源重组导致基因失活或过量表达，再根据生物的表现型推测基因的作用。也可利用噬菌体显现
(phage display)技术或酵母菌双杂交系统 (two hybrid system)分析蛋白质之间的互作及其功能。
(二)聚合酶链式反应
(PCR)扩增基因
&&&&聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)是体外快速扩增DNA的方法。这个方法由美国人Kary
Mullis于1986年发明的，可在数小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝，它可取代一些经载体克隆DNA的方法。这一方法为分子生物学理论研究和重组DNA技术都带来了又一次革命。目前这种方法不仅已成为分子生物学研究常规手段，而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域中。可以说，PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑。因此，这一技术的发明人获得了1993年诺贝尔化学奖。
&&&&PCR扩增基因的方法是，首先根据待扩增基因序列合成两个引物(9-10)，它们分别与待扩增基因二条链的两端互补。在DNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNA复性，在耐热DNA聚合酶
(Taq polymerse)及4种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成DNA新链。PCR反应包括下述3个步骤：
&&&&1．变性
在94-95℃下使模板DNA的双链变性成单链。
&&&&2．复性 两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度为50-70℃。
&&&&3．延伸
在引物的引导及Taq聚合酶的作用下，于72℃下从5'到3'的方向向待扩增DNA片段的中间延伸，合成模板DNA的互补链。
&&&&这3个步骤称为一个循环，一个循环完成后，待扩增的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作为模板用于下一步的扩增。所以，PCR反应中扩增的基因是成指数级增长的。PCR反应常有25－35个循环，经过25个循环以后，理论上原来一个分子DNA可以扩增为106个拷贝。因此仅用少量的模板DNA分子，经PCR后可以得到大量扩增产物。PCR方法通常可以扩增5kb左右的DNA片段。现在利用一些改良的方法和性能更好的Taq酶可以扩增长达40kb的DNA片段。PCR扩增的DNA序列经过核酸序列测定分析后，可作为基因工程的目的基因。
&&&&根据PCR方法及原理，后来又发展衍生出很多新方法，如RAPD
(random amplified polymorphic DNA)，AFLP(amplified fragment length
polymorphism)等，广泛用于基因分子标记等研究中。
(三)人工合成基因
&&&&根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。
&&&&例如，首先化学合成多个含有80－100个核苷酸的寡聚核苷酸，每个寡聚核苷酸之间具有19－24个核苷酸的重叠序列。再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度)混合，在DNA聚合酶
(或Taq酶)作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequence
overlapped extension，SOE)扩增出完整的基因片段，或直接测序，或克隆到质粒上再测序后加以利用。
五、基因工程的应用
&&&&自上个世纪80年代以来的20多年时间里，基因工程研究发展极为迅速，现已取得一系列重大突破，基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。下面举几个例子。
(一)基因工程工业
&&&&最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人胰岛素(insulin)。这个基因工程产品在1982年就获得临床应用专利。胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的人会患糖尿病，在美国，大约有2，000，000人患有糖尿病，几乎占人口的10％，在我们中国，随着人们生活水平的提高，糖尿病患者也越来越多，最新报道已接近4％。患者必须每天注射胰岛素才能维持正常生活或者维持生命。在动物体内胰岛素是胰腺细胞先形成一种前体胰岛素
&翻译后修饰&部分)，再加工成两条不同的成熟胰岛素原分子，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，经两对二硫键连接形成成熟的胰岛素。
&&&&基因工程生产人的胰岛素()。
&&&&人工合成胰岛素原的A链和B链编码序列(A链63bp，B链90bp)后，分别与载体中的β-半乳糖苷酶编码序列连接，构成β-半乳糖苷酶―胰岛素原融合蛋白基因，受β-半乳糖苷酶启动子控制，并在两条链的起始端分别导入一个甲硫氨酸起始密码子(ATG)，以便表达产物的后加工。
&&&&将构建的重组质粒转化E.coli细胞，分别表达β-半乳糖苷酶与A链的融合蛋白和β-半乳糖苷酶与B链的融合蛋白。从细菌中纯化的融合蛋白用溴化氰处理裂解，使A链或B链与β-半乳糖苷酶分开，得到纯胰岛素原蛋白。再将纯化的A链和B链混合后，经二硫键连接成为完整的胰岛素。这种利用甲硫氨酸作为融合蛋白连接点，只能用于不含甲硫氨酸或色氨酸的目的基因。对于含有这两种氨基酸的目的基因，也可在融合蛋白连接处导入其他氨基酸，用其他蛋白酶处理，获得纯化的目的蛋白。
&&&&利用类似的方法，已在细菌中生产几十多种医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。
&&&&有些真核细胞的蛋白质需要糖基化等修饰加工以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统。因此真核细胞更适合于表达真核生物蛋白质。目前酵母菌、植物悬浮细胞、植株、动物细胞均已成功地用于表达外源蛋白质。
(二)植物基因工程
&&&&基因工程在微生物中的成功，大大促进了植物基因工程的发展。许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术，尤其是根瘤土壤杆菌转化技术不断完善。目前，利用基因工程技术已培育出许多抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品系或品种，很多已经大面积种植推广。
&&&&植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内，并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。现已发展成功多种将外源基因导人植物细胞的方法，其中应用最多的是根瘤土壤杆菌转化技术和基因枪转化技术。
1．根瘤土壤杆菌转化技术
&&&&根瘤土壤杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。这种方法早期主要用于双子叶植物转化，后来逐步成功地用于多种单子叶植物的转化。
&&&&这种转化方法是将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA分子，插入到Ti衍生质粒的RB与LB之间构成重组质粒，再转化到根瘤土壤杆菌细胞中，将得到的重组根瘤土壤杆菌去感染植物细胞，从而使质粒的部分DNA与目的基因一起整合到植物染色体上，实现遗传转化。
&&&&植物抗除草剂基因工程就是利用这种途径完成的。田间杂草给农业生产带来的损失占作物产量的10％，生产上应用的除草剂有100多种。培养抗除草剂的转基因农作物，可在使用除草剂后不被损害，达到仅杀死杂草而无害于作物的目的，从而降低生产成本、提高作物产量、增加农业生产效益和环保效益。有一类除草剂草甘膦,是通过抑制叶绿体中的EPSP合成酶而杀死杂草的。EPSP合成酶在植物及细菌中催化芳香族氨基酸生物合成的一个反应。如果EPSP合成酶遭到的破坏，会使一些关键氨基酸的合成受阻，导致植物枯萎、死亡。
&&&&利用从抗glyphosate的E.coli中分离、克隆的EPSP合成酶基因，己培育出高抗除草剂glyphosate的转基因植物。其方法是将细菌的EPSP基因按上述方法构建成重组DNA分子，插入到质粒中，当带有重组质粒的根瘤土壤杆菌感染植物细胞时，将部分载体序列及EPSP基因整合到植物染色体上。具有EPSP基因的植物愈伤组织大量表达这个基因，因而能在含有除草剂glyphosate的培养基上生长，经再生、分化，培养出抗除草剂植株。
2．基因枪转化技术
&&&&根瘤土壤杆菌主要感染双子叶植物，早期利用根瘤土壤杆菌转化单子叶植物未能成功。为了克服这些困难，美国的Sanford等人于1987年发明了基因枪转化技术，用于单子叶植物转化。基因枪介导的植物转化是通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导人受体细胞，并整合到染色体上的方法。这种转化方法简单，但需要基因枪、金属颗粒等设备条件。目前这一技术己广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要农作物。基因枪技术还可用于转化微生物、动物细胞、动植物器官、细胞器和正在生长的植物。另外，基因枪在多基因共转化中更表现出极大的优越性。
&&&&基因枪转化的载体多数是以pUC系列质粒为基础构建的。它们通常具有细菌复制原点及抗性选择标记，具有可在植物中表达的启动子、终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记
(如除草剂、新潮霉素等)。CaMV35S启动子及终止子也用于这类质粒 (如PDB)。有些质粒利用玉米ubi (ubiquitin,
遍在蛋白质)启动子及其内含子来调控目的基因表达(如pAHC25)。将目的基因插入到载体后，在细菌中克隆复制重组DNA，将重组DNA与金属颗粒(钨粉或金粉)在一定条件下结合，直接用于转化。
&&&&目前使用的基因枪有几种类型，其共同特点是用一种动力系统将金属颗粒及其包被的DNA导人受体细胞或组织进行转化。最早商品化的是以氦气作动力的基因枪PDS-1000。转化前，将重组DNA及样品置于微载体上，再将微载体附于大载体上，爆破片位于高压气体加速管下部，作为受体细胞的样品位于下面。利用氦气作动力转化，气体加速后冲破爆破片，便包裹有DNA的金属颗粒穿过阻挡板
(挡住了碎片)，进入受体细胞内，整合到染色体上。将转化后的材料经培养、选择、再生，培养成完整的植株。
(三)转基因动物
&&&&与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢一些。这主要涉及到一些技术难题，以及伦理学、宗教等问题。但自从1996年克隆羊Dolly的降生，许多动物已经被成功克隆，包括最难克隆的动物之一猪、濒危动物野牛等。
&&&&转基因动物通常是将目的基因与载体构建成重组DNA后，用微量注射法将重组DNA导人受体合子细胞核中，实现遗传转化。
&&&&例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。人类抗胰蛋白酶基因缺失导致的肺气肿，属于一种先天性遗传疾病。将人的抗胰蛋白酶α－1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到刚刚受精的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶(35g/L),这一结果说明可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。
(四)遗传传疾病诊断
&&&&利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断，而不是根据基因产物进行诊断，因而准确度高、速度快。
&&&&RFLP方法的原理。限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。如果某一位点的核苷酸序列发生突变，有可能导致原有的限制性酶切位点缺失或产生新的限制性酶切位点。若这种突变只发生在同源染色体中的一条上，另一条染色体正常，用限制性酶酶切后，据DNA片段的带型，就可以鉴别出一对同源染色体的差异。如图9-12所示，A染色体具有3个BamHI酶切位点，而B染色体只有两个BamHI酶切位点。经BamHI酶切，A染色体产生两条带，分别为7kb和3kb,B染色体只产生一条10kb的DNA片段。
&&&&用来自这个染色体区段的DNA作杂交探针，进行Sonthern杂交分析，可以鉴别出不同的DNA片段。这种经限制性酶酶切产生的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多型性
(restriction fragment length
polymorphism，RFLP)。RFLP变异表现为共显性。研究表明，RFLP是一种普遍现象，人类基因组中已鉴定了几千个RFLP位点，作为基因组图谱分析的分子标记，用于诊断遗传疾病。
&&&&镰刀性贫血病的诊断。如前面所述，β球蛋白基因一个核苷酸突变可引起镰刀形细胞贫血病
(sick-cell anemia)。有一种基因突变导致的镰刀形细胞贫血病，这个核苷酸改变
(由GAG变成GTG)也正好导致一个限制性酶切位点改变。使原来能被MstⅡ或AryI酶识别的位点
(CC/TNAGG)变成不能被这类酶酶切，结果突变使Southern杂交带型发生变化，根据这种RFLP带型即可诊断镰刀形细胞贫血病患者及其家系中各成员的遗传组成。妊娠期胎儿镰刀形细胞贫血病的诊断方法是，用CVS法获取细胞后，提取DNA用MstⅡ酶切，Southern转移。正常的β-球蛋白基因有3个MstⅡ切点
(图9-21)，酶切后得到两个小片段，在GAG变成GTG突变后，第二个MstⅡ位点不存在了，酶切只产生一个片段。将酶切的DNA转移到膜上后，用一段β－球蛋白基因片段为探针进行Southern杂交分析，根据有杂交信号的带型可以判断出基因型。如图9一21所示。如果双亲均是βS球蛋白基因突变携带者
(βAβS)，Southern分析中有3条带。在这个家系中，第一个小孩 (女)有两条小带，基因型正常纯合，表型正常；第二个小孩
(男)仅一条大带，为纯合突变型，表现型为镰刀形细胞贫血病；第三个胎儿有一条大带及两条小带，其基因型为βAβS,表型正常，但仍是镰刀形细胞贫血病基因携带者。RFLP法也用于诊断基因缺失突变。
(2)等位基因特异寡聚核苷酸法
&&&&当已知突变基因的核苷酸序列时，就可以用人工合成的寡聚核苷酸进行PCR反应，将PCR产物用作点杂交分析，鉴定基因型。这种可用于检测单个核苷酸变异的方法，称为等位基因特异寡聚核苷酸法(allele-specific
oligonucleotide,
ASO)。这里仍以镰刀形细胞贫血病为例，说明这一方法的应用。
从白细胞中提取DNA后，用特异引物进行PCR，再将PCR产物点到膜上，用β-球蛋白基因作探针杂交，据杂交信号强度直接判断基因型
(图9-22)。当用正常寡聚核苷酸进行PCR 分析时，根据杂交信号推知:纯合(βAβA)基因型产生强信号 (深色)，杂合 (βAβS)基因型产生较弱信号
(较浅),而突变的隐性纯合(βSβS
)基因的序列不能与AS0结合，没有PCR产物，故没有信号(最浅，仅背景信号)。但如果用βS突变的ASO进行PCR，杂交信号的强度正好与上述相反，即突变纯合的βSβS的信号最强，正常纯合
(βAβA)的没有信号。类似的方法还用于许多其它疾病的诊断。可以预见的是，随着人类基因组计划的完成，对正常及突变基因序列全部测定后，人类就可以直接从基因水平准确诊断遗传疾病。
㈤基因治疔
&&&&利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(gene
therapy)。从理论上讲，只要具有适合的载体及基因导入方法，将正常的等位基因及调控元件导入有缺陷的体细胞中，是有可能从根本上治疗由于遗传物质缺陷导致的疾病的。目前己有几种基因治疗方法。其中最常用的基因转移方法是利用减毒的病毒DNA(retrovirus
DNA)作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组减毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。
&&&&例如，用莫洛尼氏鼠白血病病毒(moloney
murine leukemia virus, moloney MLV )改造而成的逆转录病毒载体，己用于治疗严重综合免疫缺陷症(severe combined
immunodeficiency, SCID)。SCID是由于腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,
ADA)基因突变引起的，患者无任何免疫功能，只有在严格控制的无菌条件下才能生存。将人类正常的ADA基因插入到moloney MLV
逆转录病毒载体上，取代该病毒中的3个结构基因(gag、pol和env)，保留病毒的ψ序列(编码包装所必须的蛋白质)及两端的长末端序列(long
terminate repeat, LTR), LTR序列参与控制转录及整合到染色体上
(图9-23)。将构建的重组病毒DNA分子包装后，从患者体内抽取白细胞(T细胞)，用包装的病毒感染T细胞，将正常的ADA基因整合到T细胞染色体上，再将培养的T细胞返回到患者体内。利用这种方法治疗后，有的患者的正常T细胞可达到50%，但有的仅0.1%。2000年法国的费雪尔(Fischer)等人利用类似方法，成功地治疗两个患有SCID的幼儿(8个月和11个月)，他们将患者的骨髓干细胞抽取后，在人工培养条件下，用带有正常基因的重组减毒病毒反复感染3次，再将干细胞返回到患者体内。两周之内，就可以从患者体内检测到新细胞及正常基因，完全恢复了患者的正常免疫系统和功能。这两个小孩己能同其他同龄人一样，在正常环境下生活。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。
&&&&在未来的基因治疔中，寻找新的克隆载体将是研究的热点之一。减毒病毒载体接受外源DNA的片段较小，载体只能在宿主细胞DNA复制时才能整合到染色体中，有些病毒载体诱导宿主细胞的免疫反应，或插入到染色体后引起插入位点基因失活。另外，减毒病毒载体也可能同己存在于细胞内的野生型病毒发生重组，形成新的病毒分子。目前已发展的载体还有腺病毒(adenovirus)及与腺病毒有关的病毒载体等。
毫无疑问，随着人类基因组草图的绘制成功，以及功能基因组学的发展，基因治疗必将得到更快的发展与广泛应用，使许多现在束手无策的疾病能有治疗的良方。
(六)DNA芯片
&&&&DNA芯片 (DNA
chip)是将核酸分子杂交的原理和方法，与半导体技术结合而发展形成的一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。
&&&&DNA芯片技术是在面积不大(如2cm2)的基片表面分成不同小格，有序地点阵排列一系列固定于一定位置的、可寻址的核苷酸分子，再将待分析的核苷酸分子标记(如用荧光标记)，变性成单链后与芯片进行分子杂交，与芯片上序列相同的核苷酸将与其杂交，与芯片上序列不同的序列就会被洗掉，然后用高精度的激光扫描仪记录分子杂交的荧光信号，通过计算机软件分析、综合成可读的信息
(图9-24)。因此，DNA芯片分析同核酸分子杂交一样，得到的信息是核苷酸水平的遗传变异资料。
&&&&DNA芯片的基片有用玻璃、硅片或尼龙制备的。早期推出的DNA
芯片，每块芯片含有几千个微点。现已发展出每片上有160万点阵的芯片。这一技术已用于单核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,
SNP)遗传筛选、不同细胞和组织的RNA群体的比较。在医学中可利用DNA芯片技术检测遗传疾病，如扫描P53基因突变；因为60%的癌细胞具有P53基因突变。随着基因芯片制作工艺和检测手段以及基因组研究的飞跃发展，基因芯片技术必将得到更加广泛的应用。
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