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原位杂交技术和操作步骤详细介绍
原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
多种探针标记检测系统
基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。
荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。
通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。
原位杂交中探针的选择
DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。
就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。
Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：
原位杂交检测步骤
原位杂交涉及的步骤 ：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1.玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片， 1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2.样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液 (pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 C30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5& min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3.探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4.原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖（见下）。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性 ，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃ 10min。
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+& 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours
杂交后的洗涤
杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。常规洗涤条件为含50%甲酰胺的 2×SSC。但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。
5.免疫细胞化学反应 (报告分子标记的探针)
如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。如进行生物素标记的探针杂交和检测，在含Tween 20 和BSA的 PBS中进行封闭。
&如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含Blocking Reagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 M NaCl将有助于防止背景染色。封闭后再 进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C& 30 min孵育 (或室温2h孵育)。抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5C10 min的洗涤。
酶反应显色：使用POD和底物DAB/咪唑构成的显色系统、AP和底物BCIP/NBT构成的显色系统；酶免反应的检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好。另外，AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/Fast Red TR, 用于提高荧光检测的灵敏度。
6.显微镜检测
POD和AP的底物显色反应后使用普通的显微镜镜检，且显色可永久保留。该检测手段能满足大部分研究的灵敏度需求。对于样品厚度较高或密度较大的情况，可使用相差显微镜进行镜检。
如使用荧光标记的探针，则在杂交和洗涤步骤后直接用荧光显微镜观察。荧光探针配合荧光显微镜的检测是进行多重探针检测的良好手段，检测时建议使用抗荧光衰减封片剂，以减缓荧光淬灭。DNA复染用的PI或DAPI可直接溶于封片液进行染色(40 ng DAPI/ 100 ng PI/ml) 。
原位杂交实验文献参考：
该文献对组织切片和FFPE样品的原位杂交检测步骤进行了详尽的探索和优化，简化了实验的操作步骤，并能在复杂样品的杂交实验中原位检测到低拷贝的靶mRNA表达（20~30拷贝/细胞） 。（link to 文章2）
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园林植物育种学复习题
导读：15、进行园林植物有性杂交育种时如何选配亲本？，4）植物生长调节剂处理，20、园林植物一代杂种（F1品种）选育的一般程序为：，是植物诱变育种常用的两种手段，23、简述园林植物多倍体的诱导及，5）快速培育异花授粉植物的自交系，培育丰富多彩的园林植物，25、简述人工创造园林植物多倍体和单倍体的方法，从而培育出更多的园林植物新品种，提高引入植物的越冬能力，提高植物的越冬性，5、结合实例谈谈植物基因工
亲本选择的原则。
① 明确亲本选择的目标性状，分清主次； ② 扩大原始材料选择范围，精选亲本；
③ 选择综合性状表现优良的材料做亲本； ④ 选择目标性状遗传力强的材料做亲本；
⑤ 选用一般配合力高的材料做亲本；
⑥ 重视选用地方品种。
⑦ 优先考虑一些少见的有利性状和珍贵类型做亲本。
12、简述当前月季育种的主要目标及其实现途径。
育种目标：新花色（如蓝色、黑色、混色等）、花香、花型、株型（矮丛、藤本等）、开花习性（四季开花）、抗病虫、抗逆等。
实现途径：引种、实生选种、芽变选种、人工杂交、辐射育种、倍性育种、生物技术育种等。
13、菊花天然授粉、人工杂交授粉、室内切枝授粉产生的后代有何差别？
答：天然授粉其后代的父本不确定，性状表现的预测性也相对较差；
人工杂交授粉父母本均能确定，后代性状的表现容易预测；
室内切枝授粉只是杂交方式，其后代的特点与人工杂交授粉相同 14、简述菊花育种的主要目标以及实现这些目标的技术途径。 菊花育种的目标主要有：花期（多种花期）；花色（蓝色、黑色、复色、大花艳丽等）；花型（大花、小花、重瓣等）；株形（满足不同的用途）；抗性（抗病虫、抗逆境等）。
实现育种目标的技术途径为：引种；实生选种；人工杂交育种；芽变选种；诱变育种（辐射诱变、化学诱变、航空
诱变）；生物技术育种。
15、 进行园林植物有性杂交育种时如何选配亲本？
1）父母本性状互补； 2）选用地理上较远、不同生态型的亲本配组； 3）选用经济性状优良、遗传差异大的亲本配组； 4）选用配合力高的材料配组； 5）以具有最多优良性状的亲本为母本； 6）以开花早的材料作父本，开花晚的材料作母本；注意亲本性状的遗传规律。 7）注意品种繁殖器官的能育性和杂交的亲和性。
16、 如何解决有性杂交过程中的花期不遇问题？
解决有性杂交花期不遇的方法： 1）调节播种期； 2）植株调整：摘心、抹芽等； 3）栽培管理措施：温光处理、肥水控制； 4）植物生长调节剂处理； 5）切枝贮藏法； 6）采集花粉贮藏。
17、简述百合种间杂交的主要障碍及其克服办法。
杂交障碍： ① 杂交不亲和性； ② 杂种不育性。
克服办法： ① 杂交不亲和的克服：选择适当亲本并注意正反杂交、混合花粉和多次重复授粉、花柱短截授粉、预先无性接近法（体细胞融合）、化学药剂处理、试管受精等；
② 杂种不育的克服：幼胚离体培养、嫁接、改善营养条件、人工辅助授粉、延长培育世代等。
18、简述远缘杂交不亲和性的表现及其克服办法。
远缘杂交不亲和性的表现主要有：异种花粉在柱头上不能正常萌发；花粉萌发后，花粉管不能进入柱头；花粉管生长缓慢或太短，不能到达胚囊；花粉
管到达胚囊，但不能完成受精。
克服远缘杂交不亲和的方法：适当选择亲本，并注意正反交；采用特殊的授粉方式，如混合授粉、多次重复授粉、低剂量辐射处理花粉授粉、提前或延迟授粉；染色体加倍法、媒介法、生理接近法 ；柱头移植或花柱短截法；化学药剂的应用；改善授粉条件，如试管受精、利用保护地栽培等。
19、 简述远缘杂交不育性与难稔性的表现及其克服办法。
远缘杂交不育性的表现为：远缘杂种种子不发芽，或发芽后不能正常成活。
远缘杂交难稔性的表现为：杂种后代不能正常开花结实。
克服远缘杂交不育性的方法：杂种幼胚的离体培养；改善杂种培育条件。
克服远缘杂交难稔性的方法：杂种染色体加倍；回交法；蒙导法；改善营养条件；人工辅助授粉；延长培育世代、加强选择。
20、园林植物一代杂种（ F1 品种）选育的一般程序为：
1）确定育种目标，收集育种材料； 2）选育优良的自交系：在每材料中选择一定数量的优良单株自交，在自交后代中继续选择优良单株自交，直至选出稳定的优良自交系；
3）进行自交系间配合力的测定；
4）确定配组方式，配制一代杂种； 5）品种比较试验、区域试验与生产试验。
21、杂种优势育种中杂交种子生产的方法有哪些？
答：杂交种子生产的方法有简单制种法；利用苗期标记性状的制种法；利用化学去雄剂的制种法；利用雄性不育
系的制种法；利用自交不亲和系的制种法；利用雌性系的制种法；利用雌株系的制种法。
22、 比较辐射诱变和化学诱变育种的异同。
辐射诱变和化学诱变均能诱导遗传物质产生变异，是植物诱变育种常用的两种手段。
不同之处在于：辐射诱变采用射线进行照射诱发变异，而化学诱变采用化学药剂诱导变异；作用方式不同，辐射诱变是利用射线击中靶分子，不受材料限制，化学诱变是诱变剂溶液渗入材料，有组织的特异性；辐射诱变容易引起染色体断裂、重排等较大范围的遗传物质变异，化学诱变引起的变异通常为点突变；诱变效果不同， 辐射诱变变异不定向，变异频率低，化学诱变有一定的专一性，变异频率高于辐射诱变3-5倍，且有益突变多；辐射诱变需专门设施，投资较大，化学诱变则具有使
用方便、成本低的特点。
23、 简述园林植物多倍体的诱导及
其鉴定方法。
诱导方法：
① 物理方法：如高温处理、低温处理、机械损伤、电离辐射等；
② 化学方法：采用秋水仙素、富民农等化学药剂处理；
③ 生物方法：有性杂交、体细胞融合、组织培养等。
鉴定方法： ① 直接鉴定：染色体计数；
② 间接鉴定：形态比较、气孔鉴定、花粉鉴定、流式细胞术等。 24、与其他常规育种方法相比，单倍体育种有哪些优势？
1）可以克服杂种分离，缩短育种年限；
2）无显隐性干扰，可以提高选择的正确性和效率；
3）节省田间试验的土地与劳力；
4）克服远缘杂种不育性与分离的困难；
5）快速培育异花授粉植物的自交系；
6）可以直接利用其不育性，培育丰富多彩的园林植物。
25、 简述人工创造园林植物多倍体和单倍体的方法。
人工创造多倍体的方法：
1）物理方法：极端温度处理、机械损伤、电离及非电离辐射等；
2）化学方法：秋水仙素等化学药剂处理；
3）生物方法：有性杂交、体细胞融合、胚乳培养等。
人工创造单倍体的方法：
1）诱导孤雌生殖：远缘花粉刺激、延迟授粉、辐射、化学药剂处理等；
2）花药或花粉培养。
26、选育优良自交系有哪些方法，
有何异同？
答：方法：系谱选择法和轮回选择
系谱选择法是从优良的基本材料中选优良单株，经过多代的连续自交和严格的单株选择获得性状整齐一致，基因型纯合，遗传性稳定的纯合系统。 轮回选择法可逐渐增大优良显性基因的集中程度，严格的近亲繁殖为适度的近亲繁殖。
27、常规有性杂交育种和杂种优势育种的异同点？
常规杂交育种，杂交优势育种相同点： 都需要进行亲本选择和选配，通
过杂交、自交的手段以及后代选择的手段，把分散存在于各个亲本上的优良性状组合于同一个体上。
不同点：（1）所利用的遗传效应不同，常规杂交育种利用的只是加性效应和部分上位效应，是可以固定遗传的部分；优势杂交育种利用的是加性效应和不能固定的非加性效应。（2）育种程序不同，常规杂交育种是先进行亲本的杂交，然后使杂种后代自交纯化成为定型的品种用于生产（重要性状基本上不再分离）；而优势杂交育种则先使亲本纯化成为自交系，然后使纯化的自交系杂交获得杂种F1用于生产。（3）制种方法不同：优势育种供生产上播种的每年都用一代杂种，不能用F1留种；因而需要专设亲本繁殖区和制种田，每年生产F1种子供生产播种用，程序繁杂，成本高。常规杂交育种比较简单，每年从生产田或种子田内的植株上收获种子，供下一年播种用，方法简便，成本低。
28、分子育种的主要内容是什么？
答：主要内容为分离和制备目的基因；将目的基因与载体连接，获得DNA重组体；并把重组的DNA引入受体细胞，经培养使之发育成具有外源基因复制和表达，并能把新特性遗传给后代的完整植株。
29、根据所学遗传育种知识，怎样为当地培育出更多更好的花卉新品种。
(1)首先要确定明确的育种目标； (2)根据目标收集种质资源；(3)确定拟采用的育种方法，可选种、杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、
分子育种等多种育种方法同时进行，从而培育出更多的园林植物新品种。
30、品种退化的原因是什么？如何防止品种退化？
答：品种退化的原因：机械混杂、生物学混杂、良种自身遗传性发生变化和突变、栽培技术和环境条件不适合品种种性要求、在繁育过程中，缺乏对良种的选择、长期营养繁殖引起的生活力衰退和积累病毒。
防止品种退化:建立完整的良种繁育体系和严格的良种繁育制度；防止混杂；提供优良的栽培条件，提高栽培技术水平；去杂去劣，加强选择；用种性较纯的优质种苗定期更新生产用种苗；选择易于生活力复壮的部分做繁殖材料。 六、论述题
1、引种成功的标准是什么？试述在进行南树北移时如何保证引种成功。
答：引种成功的标准：
1) 与原产地相比，不需要特殊的保护能够露地越冬或越夏而生长发育良好；
2) 没有降低原来的经济或观赏价值；
3) 能够用原来的繁殖方式进行正常的繁殖；
4) 没有明显或致命的病虫危害。 南树北移应采取如下栽培措施：
1）适当延期播种，适当减少生长量，增加组织充实度，提高引入植物的越冬能力。
2）适当密植，提高植物的越冬性。
3）适当节制肥水，提前封顶期，使其枝条充实。
4）幼苗期进行短日照处理，缩短生长期，使其枝条组织充实，提高越冬
5）冬季进行防寒保护。 2、何谓混合选择法和单株选择法？各有什么优、缺点？
答：（1）混合选择法：按照某些观赏特性和经济性状，从一 个原始的混杂群体或品种，选出彼此类似的优良植株，然后把它们的种子或种植材料混合起来种在同一块地里，次年再与标准品种进行比较鉴定的方法。
单株选择法：把从原始群体中选出的优良单株的种子或种植材料分别收获，分别保存，分别繁殖的方法。在整个育种过程中如只进行一次以单株为对象的选择而以后就以各家系为取舍单位的称一次单株选择法。如先进行连续多次的以单株为对象的选择，然后再以各家系为取舍单位的，就称为多次单株选择法。
（2）混合选择法和单株选择法的优、缺点。
混合选择法的优点：简便易行；获得材料较多；保持较丰富的遗传多样性。
混合选择法的缺点：无法鉴别单株基因型；对劣变基因淘汰速度较慢。
单株选择法的优点：能选出可遗传变异；有效淘汰劣变基因。
单株选择法的缺点：占用较多的土地；需要较长的时间。
3、以一种一二年生花卉为例，阐述其 F1 品种的特点、育种程序以及适用的制种技术。
以矮牵牛为例，F1 品种的特点为：性状优良、一致性好；基因型杂合，后代性状严重分离。
其 F1 品种的育种程序：
1）确定育种目标，收集育种材料；
2）选育优良的自交系：在每材料中选择一定数量的优良单株自交，在自交后代中继续选择优良单株自交，直至选出稳定的优良自交系；
3）进行自交系间配合力的测定； 4）确定配组方式，配制一代杂种； 5）品种比较试验、区域试验与生产试验；
适用的制种技术：人工去雄制种、雄性不育系制种等。
4、如何利用雄性不育系来生产F1？ 答：1）利用细胞质不育系制种法：每年设置两个隔离区，即一个不育系繁殖区和一个制种区。在不育系繁殖区内栽植不育系和保持系，为制种区提供制种的母本，同时从不育系上所收种子除大量供播种下一年制种区用之外，少量供下一年不育系繁殖区之用，而从保持系上收获的种子仍为保持系，供下一年不育系繁殖区内保持系之用。在制种区内栽植不系和父本系，从不育系收获的种子为F1。
2）利用“两用系”既作不育系，又作保持系制种法：用不育株作母本，杂交能育株作父本，杂交后从不育株一收获的种子播种后，群体内能育株和不育株约成1：1分离。在隔离区内繁殖，每代只播种不育株上的种子，能稳定1：1分离。故可作两用系用。制种时要按照一定的行的比例栽植两用系和父本系，但两用系的的株距应缩小，使栽植的株数约增加一倍，在初花期拔除两用系的能育株，以后从剩下的不育株上收获的种子就是F1。
5、 结合实例谈谈植物基因工程在园林植物遗传改良中的应用前景。
1) 植物基因工程又称植物遗传工程，是指以类型工程设计的方法，按照
人们的意愿，将不同生物体的 DNA 在体外经酶切和连接，构成重组 DNA 分子，然后借助一定的方法转入受体植物细胞，使外源目的基因在受体中进行复制和表达，从而定向改变植物性状的技术方法。
2) 与有性杂交等传统的育种技术相比，植物基因工程具有定向改造植物的遗传性状（目的性明确、精确度高），打破物种间的生殖隔离障碍 ( 实现基因资源的真正共享 ) ，缩短育种周期等优点。
3) 植物基因工程在园林植物的性状改良上应用广泛，包括修饰花色、改良花型、增加花香、改变花期、延缓衰老、改善株型、创造不育、提高抗性等多个方面。
4) 随着植物转基因技术的不断完善和更多目的基因的广泛克隆，园林植物基因工程改良具有广阔的发展前景。 6、 试述杂交育种中如何进行亲本的选择和选配，以一种无性繁殖的园林植物为例，制定其有性杂交育种的技术路线和实施方案。
杂交育种时亲本的选择和选配应注意遵循一定的原则，其中亲本选择的原则为：
1）从大量种质资源中精选亲本； 2）尽量选用优良性状多的种质材料； 3）明确目标性状，突出重点，分清主次； 4）选用优良性状遗传力强、一般配合力高的材料； 5）重视选用地方品种。
亲本选配的原则为：
1）父母本性状互补； 2）选用地理上较远、不同生态型的亲本配组；
3）选用经济性状优良、遗传差异大的亲本配组； 4）选用配合力高的材料配组；
5）以优良性状多、结实率高的亲本为母本； 6）以开花早的材料作父本，开花晚的材料作母本； 7）注意亲本性状的遗传规律。
以月季为例，其有性杂交育种的技术路线及实施方案如下：
1) 杂交前的准备工作：熟悉育种材料，制定杂交计划，准备杂交工具;
2) 亲本植株的培育及选择：解决花期不遇等问题;
3) 花粉的收集、贮藏、生活力测定等;
4) 去雄、套袋;
6) 授粉后的管理;
7) 杂交种子的采收与保存;
8) 杂种后代的培育与选择。
7、结合实例谈谈植物组织培养在园林植物遗传改良中的应用前景。
植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物材料培养于人工培养基上，并给以适当的培养条件，使之形成完整植株或生产出具有一定经济价值的生物产品的一种技术。
植物组织培养在园林植物育种中具有重要的作用，具体表现在： 1）利用茎尖等培养进行园林植物的快速繁殖和工厂化育苗。 2）利用微茎尖培养获得无病毒植株。 3）结合细胞和组织培养进行突变体的诱导和筛选。 4）利用花药与花粉培养等进行单倍体育种。 5）利用胚乳培养等获得三倍体植株。 6）利用胚胎培养和体细胞杂交等克服远缘杂交障碍。 7）利用离体培养进行种质资源的长期保存和远距离运输。 8）通过组织培养提供生物技术育种的中间材料。
8、 试述优势杂交育种（优势育种）与常规杂交育种（重组育种）的主要异
同点，并以一种园林植物为例，阐述其优势育种的一般程序及种子生产技术。
优势育种与重组育种的相同点：都需要选配亲本，进行有性杂交。
主要区别在于：
1）育种程序不同：常规杂交育种先杂后纯（先杂交，然后自交分离选择）；优势杂交育种先纯后杂（先选育自交系，然后杂交得品种）。
2）种子生产要求不同：常规杂交育种简单，生产田、种子田收种；优势育种需专设亲本繁殖区和生产用种地。
以矮牵牛为例，其 F 1 品种选育的一般程序如下：
1）确定育种目标、收集育种材料； 2）选育优良的自交系：在每品种（材料）中选择一定数量的优良单株自交，在自交后代中继续选择优良单株自交，直至选出稳定的优良自交系；或者采用花药培养诱导单倍体，加倍成纯合二倍体；
3）进行自交系间配合力的测定； 4）确定配组方式，配制一代杂种；
5）品种比较试验、区域试验与生产试验；
矮牵牛 F 1 种子的生产可采用以下技术：
1）人工去雄制种； 2）化学去雄制种；
3）利用雄性不育系制种； 4）利用自交不亲和系制种。
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