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【求助】请教smaI和BglII双酶切体系及温度，该如何设置，以及连接注意事项
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这个帖子发布于7年零358天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教大家，我用的是宝生物的smaI和BglII酶，这两个酶的最适酶切温度分别是30和37度，如果进行双酶切，该如何最有效进行。这两个酶切产物是一平一粘末端，和PGL3 （4.5 KB）载体用同样双酶切产物进行连接，用宝生物ligase连接时温度及体系该如何有效设置呢？
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先30后37，各1小时即可。连接温度按照TAKARA连接kit说明书上注明的16度半小时即可。另，建议用XmaI替代SmaI
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请问如果两个酶所使用的buffer不一致，比如TAKARA分别有H和M的buffer，这样可以一起进行双酶切吗？
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多谢啦！我试试看吧！jy_hz，可以查查TAKARA的双酶公用BUFFER
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【求助】启动子片断插入到了pgl3basic载体中,为什么没有检测到荧光？
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这个帖子发布于9年零38天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我把一个基因的启动子片断插入到了pgl3basic载体中，但是却没有测到荧光。阳性对照，即Pgl3 control检测到荧光。推测：1、启动子片断错误。
1000bp，已测序验证，在ATG前40bp，推测离转录起始位点还有200bp以上。2、细胞的转录效率太低。
但是Pgl3 control和TK值都在10万以上。3、细胞内的因子没有启动启动子活性。启动子和转染的细胞不是同一个物种，但是大家好像都这样做的，并没有什么问题。请各位做过这个实验的提点意见，现在正在困惑中。先行告谢。
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非常感谢，正在用实验进一步验证
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这个星期换了IB细胞做了一下，发现我构建的两个载体发出的荧光的数值在800左右，空白荧光100左右，pgl control 得出的值在10万左右。载体的浓度是基本一致的。请问各位，800左右的值相对于pcl control 只有 1/100 正常吗？
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我是根据人的转录起始位点推测我这个物种上的转录起始位置，我插入的片断应该包括转录起始位点下游150bp，上游大概1000bp左右了。但是这也是我一直怀疑的一个推测，我正在用实验证明。谢谢zhao。
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是,赞同你的看法.我这个片断现在是在ATG前面80bp,离推测的转录起始位点有150多个bp.现在就是怀疑是不是这ATG前80bp也是很重要的.已经开始克隆一个片断含有AT没有包括G,且后面加的序列肯定不能是G.
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这篇文章解释了没有，为什么要加这个外显子。这样你还需要考虑到移码的问题，还要保证你插入的ATG到萤火虫荧光素酶的ATG前面么有终止密码，这样才可以正确翻译一光素酶。
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建议找个在转录水平上调你目的基因表达的阳性药试试，看作用于你构建的载体瞬转的细胞后，细胞的荧光值是否上调，验证一下。
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收益匪浅。
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【求助】在线求助，关于pGL 3.0 basic 和pRL CMV的问题
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这个帖子发布于10年零233天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近用pGL3.0 basic测promoter活性，以pRLCMV为内参。真是一波不平又起一波。首先pGL basic活性一直居高不下，活性为pGL control的1/3左右，正常应该为0.04％左右，（和其他实验室相比我的pGL control活性相差不大，就是pGL basic活性不知道怎么回事就一直很高），这还是小事，我也就认了，奇怪的是当我用Dual luciferase reporter assay system 测firefly luciferase和Renllia luciferase活性时，当加入Stop & Glo试剂之后，发现luminometer计数随时间不停的增高，一直要到10分钟之后才能达到一个稳定的读数，有8位数左右，根据说明书应该在3秒之内就应该到达稳定读数才对的。怎么回事帮帮忙，谢谢
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我认为首先考虑Luminomiter有问题。Luc和hRluc的发光能保持1分钟左右。这一点Promega的说明书上有。而且我自己也发现，这两个萤光读数后，隔40秒再次读数，数值肯定下降。 所以你所说的萤光数值持续升高10分钟肯定不正常。 另外，作为内对照hRluc转染质粒量只有Luc的几十分之一，数值不可能那么高（如你观察到的8位数）。建议你从其他同事那里要几个可靠的样品，如肯定表达PGL3 Control的阳性样品，还有转染PGL3 basic 的阴性样品，另使用一台Luminomiter作检测，并同你的样品作比较。pGL3 Basic质粒会表现出一定的表达，这是因为PGL3 basic骨架上的一些序列正好是某些真核转录因子的同源序列，可能结合一些转录因子，而引起下游基因的转录。 而PGL4 质粒中针对这一问题，对骨架序列进行了改造，请参考Promega公司的文件（pGL4说明书或是有一篇文献讨论pGL3和PGL4之间差异的提到了上面所说的）。但pGL3 basic同control相比，表达水平的差别是数个数量级。祝好运！
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我用96孔板先测了luciferase（time curve) 大约10分钟后数值降为最低。然后测pRLCMV，(time curve) 大约1分钟后基本测不出。Promega相关资料表明renilla发光12秒钟后持续下降。我很郁闷如何在12秒内完成加样和检测。一般luminometer一个孔一个孔读下来，完成96个孔绝对不止12秒。可能用injecter可以完成短时间加样，目前还不知道怎么设置。郁闷。请问楼上。测出luciferase 和renilla后，如何做standalize？ 既然每一个孔细胞数目不同，那么所谓的renilla作为内参照是怎么处理数据的。希望得到您的帮助。to楼主，附件是Promega公司关于dual luciferase assay kit使用一些的中文说明，希望对你有帮助。
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i'm sorry i don't know how to attach a pdf file. it reminds me that something wrong. i'll try it again.
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想请问楼上几位, 检测荧光用的都是用lumiometer吗?我们这里只有化学系有一台荧光分光光度计,但是它需要用激发光和吸收光. 而promega公司说,这种生物发光不需要激发,所以用那种仪器是测不准的. 请问除了买lumiometer,还有什么其他的选择吗?检测同位素的单光子检测仪也可以的吧?有人用过吗
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萤光是萤光素酶以ATPoMg2+ 为共同底物催化萤光素的发光反应，不需要外加光源激发。荧光是荧光物质在外加光源的激发下发生能量变迁所发出的光。检测化学发光除了用luminometer外，一些比较先进的多功能酶标仪也具有检测化学发光的功能，检测同位素的液闪计数仪当然也可以的，只要稍微注意一下安全而已。我们老板有一台很高级的多功能酶标仪，可以用来检测化学发光，但本人由于在校外做实验，不可能拿着细胞急匆匆的赶回去用酶标仪检测啊，所以老板后来又买了一个 Turner 公司的TD 20/20n 的单管化学发光仪，用起来很方便。
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Turner 公司的TD 20/20n 的单管化学发光仪,这个需要多少钱啊用荧光检测仪可以调整参数用来检测萤光吗?
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请问楼上各位战友,我正在做启动子连接pGL3 basic的实验,我的pGL3 basic上学期提质粒测序是对的,用KPN1和HIND3双酶切和各自的单酶切都是一条带,制了永久菌在-80度保存.这学期用永久菌划板提质粒,质粒两条带,结果质粒比4.8KB大很多,双酶切出现了4条带,单酶切各自出现了两条带,并且每条都与未切的质粒不同,我换了其他人的酶试过,还是同样的结果,我现在分析不出原因.不知道是哪里的问题?
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楼上 的各位前辈,我目前正在做启动子克隆到PGL3-B上做细胞转染的实验.我目前的问题是:1.我的PGL3-B质粒有8000BP左右,用KPN1和HIND3双酶切出现两条带,其中一条4800BP左右,另外一条大很多,我做过多次都是同样的结果.哪位前辈有该质粒的电泳图片能不能贴上来参考一下?2.现在我还不很清楚该具体怎样做细胞转染及后续的实验，如果您们有本实验细胞转染及荧光检测的protocol，能贴上来或发给我吗？我的油箱：.谢谢各位！
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【交流】载体构建的一点心得&[精华]
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这个帖子发布于4年零307天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种；有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验，现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构建前很多人都跟我商量（做博后结果成了技术员的人生真悲哀啊）。我老板甚至开玩笑说，我们将来开个公司，我专门负责构建（这话听得我想揍他大家同意不？）想了想还是把经验写下来，一来做个记录，二来博同行一笑，能让大家少绕点弯路则更好。1.
准备工作俗话说用欲善其事，必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。这里说个笑话，我们系有个新PHD学生，是个印度女孩，很聪明很刻苦，她所在的实验室也很好，不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的，以前一个生物POSTDOC在的时候还好，这个POSTDOC一走，整个实验室对分生就只有一个粗浅的概念，这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这女孩她不懂啊（要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂），自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR，P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个MUTATION，要懂行的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测这下这段就行。她呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，一个测序反应这边是8刀,一个质粒测下来就是40刀，她光测序就要花好几百刀（你得佩服老美实验室真有钱呀）。这件事教育我们准备工作是多么重要。这里推荐大家两个工具，一个都知道，PRIMER5.0。另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫lasergene，包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超NB，如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。2.
PCR如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。关于PCR具体技术坛子内帖很多，我不多说了，这里仅在构建方面谈一谈。如何设计引物？首先，看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1质粒，注意frame，要是移码了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基（大家要用T载体就当我没说）。酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM的时候要减去这些不match的序列，或者选用touch-up策略。除了酶切位点，还要注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。GENE OVERLAP也比较有用，比方说加个FLAG片段，HIS片段，2A序列之类的，直接设计三引物OVERLAP一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候GENE OVERLAP就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧，只要不超过4KB，平端酶连接也不那么难。如何选择Taq酶？选择Taq酶也很关键，首先，高保真（High
fidelity）这是必须的，我在国内常用LA KIT，可这边***忑贵，只好用（美）国货。常用的PFU，PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的，一度曾卖到脱销，保真性应该是目前最高的，是普通Taq的50倍，对一般基因绝无问题（我同事4.5K PCR产物,居然一个突变都没有），但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR的基因（基因组为模板）就明显不行了；PFU(安捷伦)保真性没有PFX50高，但是能力很强，略贵点；phusion是NEB公司的，不贵，但是这个酶很怪异，每次用都要把annealing温度调高好几度，否则就出杂带，个人觉得NEB内切酶绝对是NO.1，但是Taq就不如Invitrogen了，如果实验室有钱，直接买invitrogen的spuermix，什么都混好了，连ddH2o都搞定，只要直接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的结果都用supermix。还是那句话，读说明书。同是高保真Taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL,有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三度，这些必须要读说明书，读且仔细读，这是拿到任何试剂都要做的第一步。如果基因太难PCR，怎么办？首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项，注意3%-6%，太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段过长的话，DMSO也不行，GC低的不推荐。我做个过一个2.8k,GC比高达92%的基因PCR，一共做了两周，从保真性最强的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都试过，什么DMSO，甘油，Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC(还带Enhancer的)，TAKARA 的LA都试过，都不行，要么不出带，要么就是乱七八糟的带一起来，头晕脑涨的我都打算抹平策略了，后来从别的实验室弄来一个clontech的2 GC rich kit，一次搞定！强烈推荐这个KIT，太牛了，在别家都缴械的时候，它一锤定音，不过价格也比别家都牛，10次反应就130刀，其实实验室大可以备一个，就是防备超高GC又长的片段。不过这个KIT非高保真，送了三个克隆测序，各在不同部位有突变，于是我就从A克隆切一段接到B克隆上，又从C克隆切一段接B克隆上。注意的问题是GC比太高测序也很困难，正常GC能测1K左右，到了High GC就能测个五六百，这时要多准备些引物。PCR产物的纯化如果带很单一，又强，直接PCR产物纯化就可以，如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的KIT，promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。关于T载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过，这边比较流行直接用PCR产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了最开始设计，要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。3.
酶切我的原则一向是：尽量避免PCR，能酶切的多酶切，实在没办法才去PCR。这里强烈推荐NEB的内切酶，还记得在有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4，很好用，在国内我都用TAKARA的酶，基本上还可以。注意要读说明书，选用什么buffer，多少度，用不用加BSA，这些都要仔细读。酶切的起始量，PCR产物没甚么可说的，全都切上，如果是从质粒上切片段，要根据你片段大小，片段适中，比如说7kb质粒，有2KB是目的片段，这时切个3-4ug就足够了，如果只有0.2KB,那最好多切点，6ug-7ug　内切酶也没问题。4.
连接最常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反复冻融ATP失活得很快，这时有两种办法，一种是象我们chair实验室，每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略，拿到buffer就分装，10uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。连接最重要的注意事项，1，载体总量，2.载体和插入片段比例，3.载体和插入片段质量。我在回收之后都要测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从50-100ng就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用10-15uL，我试过25uL没有问题，40uL就不行了。载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10，我试过一端平一端粘连接，4kb片段，4KB载体，连接成功率相当高，10个克隆里8个都是阳性的，但是7KB片段，5KB载体的平端连接就连试两周都失败，最后换策略分两段先后克隆进去的，这也給了我很深教训，隔了一阵又做类似的实验，这回我干脆连试都没试，继续分成两段分别连进去的。3片段连接同理，如果片段不太大，比方说小于3K，3片段连接成功几率很高，但是如果你片段太大，就不行了，我试过4K载体，4K片段A，2K片段B连接，失败四五次，最后还是绕路走了。5.
转化这个简单遵循基本的准则就行，话说实验室原来从sigma买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高，尤其在使用XL-10细菌的时比DH5a效率要高，需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个volunteer，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了KANA的LB，直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也不知道啥名字，就那种玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。6.
鉴定普通实验做酶切鉴定，阳性率非常高，大多数情况下四个中起码有三个是正确的，很多时候都是百分百正确，这里推荐一种叫fast digest的酶，切个十几分钟跑胶就行了。如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题，比方说有段时间我做个非常新潮的实验，初始步骤的虽然是蓝白筛选，但是白斑也大部分都不对，没办法鉴定就用菌液PCR，最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的（没办法，该实验特点），这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究，很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多，为甚么？因为你PCR引物选的都在载体上，注意，引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR方法鉴定是极其准确的，我做过数百次菌液PCR，只要PCR条件正确，PCR和酶切结果绝对百分之百对得上。PCR鉴定做起来也很简单，拿个2mL tube，装0.5mL 加入相应抗生素的LB，摇个三小时左后取1uL做模板就行了，楼下有个实验室的POSTDOC特喜欢做直接的菌落PCR，我没试过，效果怎样不好说。还要多说一句，要注意质粒是低拷贝还是高拷贝，普通的质粒一般4mL摇过夜，1.5mL就能提到500ng/uL　总体积40uL的质粒（根据试剂盒不同，最高提过800ng/uL，也试过200ng/ul，都正常）。如果是低拷贝质粒，象PET系列和pshuttle系列，都是低拷贝，能拿到100ng/uL就已经很好了，这时候需要4ML菌当2ML提，但是最要命的还是Adeasy 质粒（用来做腺病毒的），这个质粒超过30KB，普通KIT回收效率低到忍无可忍，一定要用特定的试剂盒才行，还是那句话，这些都要读说明书。7.
测序我们拿到测序结果时候，不仅要核对具体的序列，而且要看测序图，这很重要，因为有时候光看结果对，实际上图显示的不对，或者虽然结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子，还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的（这些问题我都碰到过），如果不仔细检查到了后期悔之无及。还要注意反向测序引物，尤其用到SV40，因为我用PEGFP这套质粒用习惯了，等换成大概是TET-ON那套系统，SV40正好是反过来的，我也没留神，结果测回来的是载体……又吃了一次教训。最后的最后，回顾来美这段时间，每周工作超过七十个小时，八十个小时也是家常便饭，人虽然还没累垮但也和崩溃相距不远，PAPER只发了两篇还不是什么特牛的杂志，被老板教训倒是隔几周就一次，时至今日居然还有心情整理这类材料，奇怪，奇怪。今天星期六，早上八点半到，预备加班到六点半。下班同事来，惊讶的问我如此玩命为甚么。FOR
WHAT? FOR FUN.PS：无聊之作，仅博一笑而已。〕
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一款自己上手的软件必不可少，lasergen我看很多人用，老外这好像是标配，实验室电脑上都有，购买便宜？不过我习惯用snapgene，最新版的除常规的酶切克隆，TA,GC，还有gateway，infusion，gibson，overlap妈的能用的都有了。最吊的是载体序列添加进去，竟然能自己给出注释，哪里启动子，哪里是MCS，kozak当然不再话下，引物加酶切，加tag都是只需要点鼠标的问题。只是保护碱基没有智能化，需手动加，差评。可视化不错，再也不用在纸上画切完连上长什么样的了，有无移码小case，模拟连接的时候图形界面，序列，让你随时调整。算是打了个广告吧，但确实是我用过最好用的。软件有点贵，对我来说是特别贵，不过没关系，这个国度你懂的，万能的T*B。不过我自己DIY了，不然怎么能上最新版呢?。
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不错，一看就是实验的老鸟，谢谢分享
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FOR WHAT?FOR FUN.呵呵，就是，实验最大的乐趣在于做不出来痛苦很久，一旦找到问题原因兴奋很久。痛并快乐着吧。
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学习了，感谢楼主！
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酶切确实比PCR更简便，但不知道稳定性怎样
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多谢楼主分享!好贴,必须顶!!&For What? For Fun!&严重同意
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You are so nice to share your experience. Hope to learn from you. I am constructing lenti-virus system plasmid.
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400个？ 你的博士就专门构建质粒？
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dengy 400个？ 你的博士就专门构建质粒？我做很多实验.FRET,FCS,TIRF,IF,(估计已经有人看出我整天跟显微镜打交道了),和制作各种VIRUS(AD.AAV,fastbac), Gel filtration,和各种function实验.不过我们实验室分生为主,对大部分实验来说质粒构建是第一步,比方说某个project,我要在N端加CFP/YFP/mcherry/His/Flag,还要做另一批C端加上这些标签的,很多质粒在N端C端同时加(有的不幸形成了aggregate有的不幸毫无变化),还要作不同位置的mutation,和C端或者N端truncation,当基本的localization和蛋白是几聚体被确定后,接下来就要做virus那一系列plasmid,做的最多是AD,pshuttle 或者pshuttle-cmv,接下来就是电转,Adeasy筛选那一套,如果超过6KB就要换作昆虫那一套.这只是一个project,而我同时作四个project,之前的一个project已经done了,文章一篇已经发表,另一篇在写.那一个project就7 个domain, 各带CFP/GFP/YFP/mcherry/RFP/His/Flag(要做各种各样的FRET,测spectrum),shuttle-cmv一套,full length 的cfp/yfp/his/flag,N端与C端分别pshuttle-cmv, double-color,为了ZFN制作的相应DONOR(这个真是很难,我断断续续作了两个月),C端truncation的CFP/YFP.就拿这几天来说,昨天酶切,连接,transformation,今早八点摇菌,中间做其他实验,现在回来提质粒(六个小时足够了),chloroform抽提,一次24个,从开始到酶切鉴定拍照,正确克隆冻菌,三个小时enough,这批是6个不同fastbac病毒,也就是说如果成功两天就搞定6个plasmid,我来这个实验室快两年了,四百真是保守估计.我没有任何夸张,说实话构建一点都不难,只要每一步都优化到最佳条件,基本是第一天PCR酶切连接转化,第二天半夜质粒到手,正确的纯化,转染. 第三天看荧光,第四天拿WB结果,然后是大量扩增检测FUNCTION而已.这真不是什么值得炫耀的事,加班加点,paper又写不进去,简历也没法写,最重要的很多时候和预期不符合,相当于白做工,给后人铺路.这也是我苦恼的地方.前一段时间也跟老板谈了,我要集中做功能实验,不能做这个,老板许诺等新来的tech到了我好好教她,以后就可以只动动嘴了.PS:我早已PHD毕业,午饭(三点吃的)时间写下这段,就是记录而已.
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非常感谢楼主分享，我以后准备做载体构建，有不懂的地方再请教。
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分享真好，有更多这样的大师就更好了。学习了，
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楼主您好，我最近也在构建质粒，我的目的基因全长2683bp，我是订了引物从组织中提总RNA，然后做RT得到目的基因，可是我做RT-PCR做了很久都没有P出目的基因，退火温度摸索了很多，我想请教您一下，到底是哪里出现问题了，如果P全长不好P，那么是不是可以分段P呢？
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楼主您好！我构建了一个PGL3载体，用来研究目的基因的启动子活性，这个载体没有抗性基因表达，没法筛选得到稳定转染的细胞株进行下游实验，请问您有什么好的建议？可否选择一个合适的新霉素表达载体进行共转染还是在PGL3上加上一个neo呢？具体该怎么操作呢？我是新手，恳请大师指点！email:
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楼主，你好。看了你的帖子，收益很大。我最近也在做载体构建，使用sigma的DH5a转化效率并不高。可否发一份你制备感受态细胞及转化的protocol给我，感激不尽！邮箱.再次谢过！
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我最近也在开始弄这个，以后还得多请教呢，谢谢楼主！
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楼主辛苦了，写得很详细。谢谢。投你一票！
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感谢楼主分享！！！
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楼主，您好，我最近也在做载体构建，是一个新手，都有好几个月了，一直都没有前进，有点沮丧。我是用的pEGFP\-N1，设计的引物选择了Bgl2和BamH1这两个酶，有时候酶切之后也能看到条带，之后用Top10感受态细胞做转化，在含有卡那霉素的LB固体培养基中，结果长出好多小菌落，做过菌落PCR，也做过菌液PCR，几乎没有阳性的，好不容易有一个，拿去测序回来有一个碱基发生突变了，真不知道怎么办呢，一直也没有找到原因，希望能给些建议，如果有些成熟的方法什么的是否可以借鉴一下呢，邮箱是
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suiyuweihen 楼主，您好，我最近也在做载体构建，是一个新手，都有好几个月了，一直都没有前进，有点沮丧。我是用的pEGFP\-N1，设计的引物选择了Bgl2和BamH1这两个酶，有时候酶切之后也能看到条带，之后用Top10感受态细胞做转化，在含有卡那霉素的LB固体培养基中，结果长出好多小菌落，做过菌落PCR，也做过菌液PCR，几乎没有阳性的，好不容易有一个，拿去测序回来有一个碱基发生突变了，真不知道怎么办呢，一直也没有找到原因，希望能给些建议，如果有些成熟的方法什么的是否可以借鉴一下呢，邮箱是很正常。Bgl2和BamH1是同尾酶，相当于自连，如果不用CIP消化百分之九十九都会自连，但是如果用CIP消化，你插入片段越大，这种连接越难，要么不长，要么就是消化不干净自连，如有可能，最好更换一个有其他cutting site的引物。我以前曾做过类似的实验，是在11K的载体上插入4.5K片段，试了三次都失败，最后换了其他策略。
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shirley951951 edited on
我的目的片段只有600多bp，挺小的，没有用过CIP，不知道小片段的连接是否适用CIP呢？对于引物问题也一直考虑再设计，希望可以有其他的解决办法，希望楼主多给些建议，谢谢了
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楼主，我筛了几个酶出来，其中必须用到BamH1， 另外三个酶是Bgl2，Nhe1和Xho1，上次用了Bgl2，原来是同尾酶，由于是新手不了解，所以实验一直没有结果，那么对于另外两个Nhe1和Xho1，我该选择哪个和BamH1一起进行双酶切呢，希望楼主指点一下，谢谢喽，真的是很着急啊
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suiyuweihen 楼主，我筛了几个酶出来，其中必须用到BamH1， 另外三个酶是Bgl2，Nhe1和Xho1，上次用了Bgl2，原来是同尾酶，由于是新手不了解，所以实验一直没有结果，那么对于另外两个Nhe1和Xho1，我该选择哪个和BamH1一起进行双酶切呢，希望楼主指点一下，谢谢喽，真的是很着急啊It dosn't matter.
more expensive than Xho1. So I would choose Xho1 if I were you.
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非常感谢你，希望之后一切顺利吧
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感谢楼主分享。请教楼主一个问题。我最近在做表达载体的构建，目的片段600bp，载体pHT01，有8000bp，双酶切：AatⅡ 和XbaⅠ，老是连不上去。一个多月了，很是郁闷。 还有前两貌似连上了天长了两个菌落，菌落PCR（引物一个是目的片段特异性引物，一个是载体上引物）阳性，可是质粒提出来大小才3Kbp。请楼主指点迷津。
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楼主，你好!我上次重新设计引物，酶切后做连接转化，结果有一些菌落长出来，做了菌液PCR也是正确的，可是进一步做了酶切鉴定，为什么和菌液PCR完全不一样呢，酶切鉴定的结果不对，希望楼主能帮助解答下
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楼主，你好！很抱歉打扰你。有个问题想请教你，就是我在使用软件设计反义链引物时， 选择的是salI 这个酶，为什么输入我设计的引物除了salI 酶切位点，还有几个位点出现在这条引物上呢，这是什么情况，那么这个内切酶还可以使用吗？我的正义链酶切位点是bglII ，希望您能帮助解答一下，谢谢了，怎么也构建不出来质粒，愁啊！
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mark。帮助非常大，谢谢楼主。
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我做了菌液PCR，PCR条件也是正确的，怎么这个PCR和酶切结果都不一样呢，我用的pEGFP质粒有没有什么特别的呢
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