【流式细胞凋亡图】如何分析annexin v的流式散点图_学习岛【流式细胞凋亡图】如何分析annexin v的流式散点图发表时间： 18:42:02做药物干预细胞增殖的实验，用Annexin V-FITC试剂盒做流式，因为自己学校没有流式细胞仪，只能拿到外校去做，最后给了几张这样的散点图，请各位高手帮帮忙，我该如何对它进行数据分析？流式细胞仪是Becton Dickinson Facscalibour吧,具体描述为:UL：上左区；一般认为是死亡细胞,3.38%UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞,10.57%LL：下左区； 正常阴性细胞,80.85%LR：下右区; 早期凋亡细胞,5.19%Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，一般BD流式细胞仪建议使用FL2,而beckman coulter公司的仪器建议使用FL3。图中FL1应为Annexin V-FITC,FL2应为PI这个试剂盒是Annexin V/PI双染,那位做流式的老师给你标错了,你可以回去找他确认.如上图所示:左上象限为死亡的细胞,图旁边的数据显示,Gated%为5.19%,左下象限为阴性细胞,也就是活着的细胞,Gated%为80.85%,右上象限为晚期凋亡细胞,Gated%为10.57%,右下象限则是早期凋亡细胞,Gated%为3.38%secondary necrotic cells应该翻译晚期坏死细胞那位老师说左边象限是PI染色，右边是Annexin V。既然是这样的话.应该这么解释:左上象限为死亡的细胞,图旁边的数据显示,Gated%为5.19%,左下象限为阴性细胞,也就是活着的细胞,Gated%为80.85%,右上象限为晚期凋亡细胞,Gated%为10.57%,右下象限则是早期凋亡细胞,Gated%为3.38%还有一个疑问:做流式的老师在图上标明右上象限是早期凋亡,右下象限是晚期凋亡;但试剂盒的说明书上说右上象限是secondary necrotic cells,右下象限是apoptotic cells也就是凋亡细胞;我查了查坛子里大部分都说右下是早期凋亡,右上是晚期凋亡或坏死,到底哪种对啊?搞晕了。另外,这个secondary necrotic cells应该翻译成什么?继发坏死细胞?晚期坏死细胞?试剂盒是Beckman Coulter公司的Annexin V-FITC。你们那个实验室做流失的老师有问题吗? 你给我提供的消息是Annexin v-FITC,既然是FITC标记的就应该是第一通道,也就是FL1, Annexin 单阳属于早期凋亡,也就是右下象限为早期凋亡, 怎么会是晚期凋亡呢?既然你用PI这个染液了,还是第二通道的(FL2),PI标记的为死亡细胞,两者双阳才是晚期凋亡,而且你的试剂盒已经注明右上象限双阳为secondary necrotic cells.这不很明白吗?还有下次做流式的时候请上机的老师给你注明FL1-Annexin v.FL2-PI.这样你的图上才会显示出来,我在实验室给学生们做流式4年了,还从来没有人说我解释的不对.老师就是应该耐心的为学生服务解答问题!相关阅读细胞凋亡的基因调控及检测方法的研究进展,9(5)458461)细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程,它直接参与机体的许多生理和病理活动,具有重要的生物学意义。细胞凋亡研究给现代医学带来巨大推动作用,许多以分子靶向治疗为手段的抗癌新药的细胞生物学细胞凋亡检测技术与方法,细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(PCDProgrammedCellDeath),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基cjun氨基末端激酶信号通路与细胞凋亡,细胞凋亡是当前生物医学热门话题之一,近年来已取得很大进展细胞凋亡是最常见的细胞生理性死亡形式,可发生于胚胎发育,组织重建,免疫调节及肿瘤退化的各个时期1。它是一种与生俱来的机制,借此可去除机体线粒体介导的细胞凋亡信号通路图,细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶,主要是水解酶(蛋白酶与核酸酶)的作用,在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡。这与坏死时细胞质膜早期破损不同。在细胞凋亡过程中,质膜脂双层丧失二侧不对称性,磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面,jnk、p38mapk信号通路与肿瘤细胞凋亡,人们发现JNK、p38MAPK信号通路的【题名】JNK、p38MAPK信号通路与肿瘤细胞凋亡【作者】黄川(综述)袁铿(审校)【机构】江西省医学科学研究所江西南昌330006【刊名】《实验与检验医Annexin V FITC 和 PI 双染检测细胞凋亡(Apoptosis)的结果如何分析(细胞凋亡,横坐标) - 免疫实验 - 生物秀
标题: Annexin V FITC 和 PI 双染检测细胞凋亡(Apoptosis)的结果如何分析(细胞凋亡,横坐标)
摘要: [Annexin V FITC 和 PI 双染检测细胞凋亡(Apoptosis)的结果如何分析(细胞凋亡,横坐标)] 我想请教一下Annexin V FITC 和 PI 双染检测细胞凋亡(Apoptosis)的结果如何分析？横坐标，纵坐标,还有各区的意义？就是如何看一张结果图？ 那位高手实例分析一下。不胜感激！ 关键词:[细胞凋亡 横坐标]……
我想请教一下Annexin V FITC 和 PI 双染检测细胞凋亡(Apoptosis)的结果如何分析？横坐标，纵坐标,还有各区的意义？就是如何看一张结果图？ 那位高手实例分析一下。不胜感激！
回复FITC阳性代表细胞凋亡(Apoptosis)发生，而PI阳性代表细胞死亡。FITC阳性，而PI阴性时细胞早期凋亡；FITC阴性，而PI阳性则是细胞坏死；双阳性则是细胞凋亡(Apoptosis)晚期；双阴性则是正常细胞。应该有个“十”字向限，可以看出百分比。FL1 为Annexin V FITC; FL3为PI回复谢谢 请斑竹加分给honvey
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【求助】Annexin V/PI双染结果诡异！求帮助~
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这个帖子发布于5年零184天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近做了Annexin V/PI双染，是药物作用于A549细胞24h，但是结果很诡异。细胞分区不明显，尤其是药物高浓度组，细胞几乎集中在左下区域，不知道是什么原因？是染料的问题还是细胞不容易染色？我用的试剂盒是”欣博盛“的，操作步骤完全按照说明书上进行。还有由于离检测地方较远，染色后1个多小时才上机检测，路上用保温盒放冰袋携带样品，这样对细胞是否影响很大？求高人指点！
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是比较怪，补偿应该没有调好。
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重新调参数和补偿，左下其实是分两个大群的。
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把你的单通道直方图也贴上来看看吧
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流式的补偿没有调好 需要单标先调好补偿 这样你的两群细胞才分的开
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allareblue 流式的补偿没有调好 需要单标先调好补偿 这样你的两群细胞才分的开如果你把补偿调好的话 应该是很好的图 随uM的增加 Annexin V减少而PI增加 至100uM是基本都是坏死的细胞了还有 你的control的凋亡有点高 你可以缩短一点作用时间 这样不同浓度之间的区别会更明显
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非常感谢各位的热心帮助！如果想调好补偿就要做一个什么都不染的、一个PI单染的还有一个Annexin V单染的对吗？这三个样品的细胞是用正常细胞还是用确定已经凋亡或坏死的细胞呢？空白组凋亡可能是什么原因引起的的呢？先谢谢啦~
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丁香nancy丁香 最近做了Annexin V/PI双染，是药物作用于A549细胞24h，但是结果很诡异。细胞分区不明显，尤其是药物高浓度组，细胞几乎集中在左下区域，不知道是什么原因？是染料的问题还是细胞不容易染色？我用的试剂盒是”欣博盛“的，操作步骤完全按照说明书上进行。还有由于离检测地方较远，染色后1个多小时才上机检测，路上用保温盒放冰袋携带样品，这样对细胞是否影响很大？求高人指点！楼主好，我最近也准备做双染细胞凋亡，准备买试剂盒，想买碧云天的可是暂时没有货，不知道你用的欣博盛的效果怎么样？
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很明显，做错了.... 不是补偿的问题吧.....做凋亡的时候，用PI跟Annexiv-V FITC的时候选的是通道1和通道3.......也就是说的你的图上纵坐标FL2是错误的吧.........再有，control管的设定在说明书上也有吧....只需要一管什么都不做处理的cell就可以了.....FL1和FL3之间不需要补偿调节我主要是参照ebosicence和碧云天家的试剂盒来说的，你用的那个牌子没听过.....应该差不多吧....
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我认为首先应当先看一下镜下，有没有细胞凋亡的情况，如果镜下的细胞都没有什么变化的话，去测凋亡也测不出来。个人认为产生的原因有一下几点：1.调试流式参数，做流式的时候，最好找专业的老师帮忙调一下。2.消化细胞的时候最好用没有EDTA的胰酶，因为AV与膜的结合需要钙离子。3.可以先加入可以确切导致凋亡的药物试一下（例如H2O2），看看检测试剂是否好用。4.如果都不行可以找同学借一下其他品牌的AV-PI试剂盒，或者让别人帮做一下。
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【求助】Annexin V和PI的双染做流式，看不懂结果，求牛人解读
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问题已解决悬赏丁当:2
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习惯上把横坐标设为Annexin V、纵坐标设为PI。UL：上左区；一般认为是死亡细胞UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞LL：下左区； 正常细胞LR：下右区; 早期凋亡细胞Annexin V-PI 双染法的原理如下，详见链接，
在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。
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谁人知1989 edited on
然后就是区分singlet与doublet的问题图片来源于：
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FSC-SSC图不一定会有明显的分区，但是要考虑的一是补偿，二是细胞处理过程中是否过于暴力或时间过久等，导致PI进入了完整的细胞。一般空白组UL&5-10%。
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习惯上把横坐标设为Annexin V、纵坐标设为PI。UL：上左区；一般认为是死亡细胞UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞LL：下左区； 正常细胞LR：下右区; 早期凋亡细胞Annexin V-PI 双染法的原理如下，详见链接，
在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。
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谁人知1989 edited on
问题解释，没太说清楚，非常抱歉，补充下：1、自己的图片说明，FL1为Annexin V，FL2为PI2、“看不懂”是想表达，我的图片和文献中的图片很不同，文献中UL区一般是没有多少细胞的。3、另外一点困惑，我做的是细胞系（HepG2细胞）的凋亡，但是在FSC-SSC图中，没有看到明显的分区，是混在一起的，所以最初圈门的时候也很困惑，不知应怎么圈 所以，我的问题是，我在哪个环节做错了什么，有可能导致这样的结果。请大家帮忙分析，谢谢！对于这个问题，我自己的几点分析，供讨论：1, FL1的电压太小2,
补偿调节问题：我的设置是，FL1-70%FL2 ，FL2-30%FL1 ；70%设置得太高3, 十字门设置得不合适4, 细胞数量过多？（做实验时，因为担心信号低，所以用了较多的细胞）附图： ▲ 图1
FSC-SSC图 ▲ 图2
Annexin V通道图
▲图4 文献中的参考图片
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kishii edited on
kishii 问题可能没太说清楚，非常抱歉，补充下：1、自己的图片说明，FL1为Annexin V，FL2为PI2、“看不懂”是想表达，我的图片和文献中的图片很不同，文献中UL区一般是没有多少细胞的。
所以，我的问题是，我在哪个环节做错了什么，有可能导致这样的结果。请大家帮忙分析，谢谢！附上文献中正常的图片，如下：X轴通道的电压太高， 貌似有些compensation需要调试
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谁人知1989 习惯上把横坐标设为Annexin V、纵坐标设为PI。UL：上左区；一般认为是死亡细胞UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞LL：下左区； 正常细胞LR：下右区; 早期凋亡细胞Annexin V-PI 双染法的原理如下，详见链接，
在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。谢谢普及这方面得原理。那请问有关在活似染色中PI或者7AAD的所结合的又是细胞的哪一个部分呢？
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楼主有没有对照啊 对照拿出来看一看！要不问题还真不好说！
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钢铁飞球侠 谢谢普及这方面得原理。那请问有关在活似染色中PI或者7AAD的所结合的又是细胞的哪一个部分呢？活似染色 是不是活性染色啊 PI 7AAD是直接结合在DNA上，活细胞染料不能通过，死细胞细胞通透性增强染料能通过。
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newuser527 活似染色 是不是活性染色啊 PI 7AAD是直接结合在DNA上，活细胞染料不能通过，死细胞细胞通透性增强染料能通过。哦，是这个的。谢谢
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1. 我的对照也是这样的，怀疑像@钢铁飞球侠说的那样，主要问题出在调试上2. 补偿的问题，我FL-1和FL-2的补偿大概调试的参数是：
FL1-70%FL2；
FL2-30%FL13. 再补充一下问题，我做的是细胞系（HepG2细胞）的凋亡，但是在FSC-SSC图中，没有看到明显的
分区，是混在一起的，所以最初圈门的时候也很困惑，不知应怎么圈
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谢谢！想请教下，如果没有明显分区的情况下，应该怎样画门呢？一般情况下，一般是将死细胞排除，画门圈住活细胞，但在做凋亡的情况下，是不是应该将所有的细胞包含在内？多谢！
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没有明显分区，设门只能根据经验了，你这情况可能重新做一遍比较合适。凋亡也不能把所有细胞圈进去，接近原点的部分一般是细胞碎片或者杂质，没有分析的意义。
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kishii 谢谢！想请教下，如果没有明显分区的情况下，应该怎样画门呢？一般情况下，一般是将死细胞排除，画门圈住活细胞，但在做凋亡的情况下，是不是应该将所有的细胞包含在内？多谢！除了排除细胞碎片和杂质，还需要选取单个细胞singlet
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谢谢！想请教下，在FSC-SSC图中，怎样区分singlet，还是doublet？
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kishii edited on
FSC-H就好了
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然后就是区分singlet与doublet的问题图片来源于：
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非常感谢！之前都没有考虑到这个问题。
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这幅图片目前的网页链接是这个：http://www.dayshare.org/richardhastings589/kumc-introduction-to-flow-cytometry供大家参考
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kishii 非常感谢！之前都没有考虑到这个问题。客气
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楼主，你好，我也是要做流式测凋亡，你买的是谁家的试剂盒，不知道国产的和进口的用哪个，
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我用的是BD的试剂盒
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