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慢病毒Lentivirus载体.pdf 5页
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生物通 2008 技术点评：慢病毒载体
近几年来，慢病毒载体因其独特的优势，逐渐成为表达载体中的大热。慢病毒载体与其他表达载
体相比，最大的优势是它们能感染分裂和非分裂的细胞。这对于众多干细胞和难转染细胞的研究者而
言，可谓是一根及时的救命稻草，能解决令人头疼的转染效率低的问题。
慢病毒（lentivirus）是反转录病毒的一种，
染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、
需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，
心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种
lenti 在拉丁文中就是慢的意思。它包括 HIV、FIV
类型的细胞，又很少引发机体的免疫反应，能达
（猫免疫缺陷病毒）和其他病毒。
到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
如果你的实验需要长期基因表达或沉默，而目的
先来谈谈反转录病毒吧。反转录病毒是一类
细胞又很难转染，那慢病毒可以说是非常理想的
正链 RNA 病毒，分为顺式功能基因和反式功能
选择。野生型的 HIV 大小约为 9.8 kb，故插入片
基因。由于反转录病毒包膜上有 env
段一般在 4-5 kb 左右，这对于大部分的实验来
蛋白，能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所
说应该够用了。
识别，并能介导反转录病毒的遗传物质高效进入
宿主细胞内；并且病毒在自身表达的整合酶催化
慢病毒载体的发展经历了 3 个阶段：第一代
作用下可高效地整合进宿主细胞染色体中，这有
慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。在构建
逆转录和整合所
利于外源基因在宿主细胞的永久表达；成熟的病
时把 HIV-1 基因组中进行包装、
毒颗粒以芽生的方式进入细胞培养液上清液中，
需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列
易于和宿主细胞分离。但传统的反转录病毒载体
分离，分别构建在三个独立的质粒表达系统上，
没有组织特异性，只能感染处于分裂期的细胞，
即包装质粒(一个强启动子如 CMV 作用下，控制
而且滴度低，并可能产生具有复制能力的反转录
除 env 以外所有病毒结构基因的表达)、包膜质
病毒，因此不能作为理想的表达载体。
粒(VSV-G 基因)和载体质粒( 目的基因)，用这三
种质粒共同转染包装细胞如人胚肾 293T 细胞，
慢病毒病毒源于反转录病毒，但又有所不
在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无
同。市场上的慢病毒是由人类免疫缺陷病毒
复制能力的慢病毒颗粒。第一代慢病毒载体系统
（HIV），通过去除env、vif 、vpr 、vpu 、nef
的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生
等毒性基因改造而来。复制缺陷型 HIV 载体通
有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质
正在加载中，请稍后...附着型慢病毒载体、制备方法及应用技术
本发明专利技术公开了一种附着型慢病毒载体、制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术中附着型慢病毒载体由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，pLRZM载体为pLVX-IRES-ZsGreen1载体中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件替换为人源性MAR序列或其95％以上同源序列所得，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列如SEQ ID NO.2所示，人源性MAR序列如SEQ ID NO.3中第14～2161位碱基所示。该附着型慢病毒载体附着于宿主细胞染色体上，而非整合到宿主细胞染色体中，并且能够介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达，可用于基因治疗，具有广阔的市场前景。
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技术实现步骤摘要
本专利技术涉及一种附着型慢病毒载体，以及该附着型慢病毒载体的制备方法及应用，属于生物技术介绍随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展，基因治疗已成为治疗疾病的一种新途径，治疗的疾病也从遗传病扩展到感染性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等。目前，用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。慢病毒载体是一种特殊的逆转录病毒，与常用的逆转录病毒载体、腺病毒载体相比，不仅能感染分裂期细胞，还能感染非分裂期细胞(如神经细胞、造血干细胞、肌纤维细胞和肝细胞等)，并且具有容纳大片段外源性目的基因、不易诱发宿主免疫反应(免疫反应小、安全性好)等优点。慢病毒载体在基因治疗中具有广泛的应用前景，已成为当前基因治疗载体研究的热点。典型的慢病毒载体系统为HIV-载体系统，由包装成分和载体成分两部分组成。包装成分由HIV-1基因组除去包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。从慢病毒载体诞生至今，其安全性、滴度及转导能力等均有较大改进。第一代慢病毒载体系统以三质粒系统为代表，由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’端LTR由SV40polyA序列取代。包装成分分别...【详细说明在详细技术资料中】
技术保护点
附着型慢病毒载体，其特征在于：由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，所述pLRZM载体为pLVX-IRES-ZsGreen1载体中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件替换为人源性MAR序列或其95％以上同源序列所得。
技术保护范围摘要
1.附着型慢病毒载体，其特征在于：由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，所述pLRZM载体为pLVX-IRES-ZsGreen1载体中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件替换为人源性MAR序列或其95％以上同源序列所得。2.根据权利要求1所述的附着型慢病毒载体，其特征在于：所述土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列如SEQIDNO.2所示，人源性MAR序列如SEQIDNO.3中第14～2161位碱基所示。3.根据权利要求1所述的附着型慢病毒载体，其特征在于：所述宿主细胞为HEK293T细胞，包装系统为pHelper1.0和pHelper2.0。4.如权利要求1～3中任一项所述的附着型慢病毒载体的制备方法，其特征在于：步骤如下：1)分别采用PacI和XmaI双酶切人工合成序列A及pLVX-IRES-ZsGreen1载体，回收并连接，得到pLVX-IRES-ZsGreen2载体；2)以人外周血基因组DNA为模板，利用引物P1、P2扩增人源性MAR序列得扩增产物A；3)分别采用PacI和XmaI双酶切扩增产物A及pLVX-IRES-ZsGreen2载体，回收并连接，得到pLRZM载体；4)采用pLRZM载体、包装系统共同转染宿主细胞，培养得到含附着型慢病毒载体的细胞培养...
专利技术属性
发明(设计)人：，，，，，，
申请(专利权)人：，
专利类型：发明
国别省市：河南;41
专利技术项目评估
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慢病毒载体的发展历程及现状
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慢病毒载体相关知识问答大总结
核心提示：慢病毒包装技术专题Q:什么是慢病毒 ?A: 慢病毒载体 (Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感
慢病毒包装技术专题
Q:什么是慢病毒 ?
A: 慢病毒载体 (Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。慢病毒和细胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞内。慢病毒RNA通过逆转录酶转录为DNA。DNA整合前复合体进入细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。由于靶基因或基因干扰序列整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因的导入能够获得稳定的表达。慢病毒的显著优势在于其可以整合到非分裂细胞，而其他载体(如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂细胞的染色体(如常规的逆转录病毒)。目前我们使用的慢病毒载体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次改造在包装滴度和使用安全性等方面都非常理想。在实际的使用中我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着RNAi研究的深入，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列.
Q:慢病毒用于rna i研究
A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3&端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构(stem loop)。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 & 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。
Q:如何生产病毒?
A:载体质粒和辅助质粒转染293细胞后收获病毒上清，通过超滤和超速离心进行纯化和浓缩获得高滴度和高纯度的慢病毒颗粒。
Q:病毒是否可以重新冻融?
A:病毒可以冻融，但是反复多次的冻融会降低病毒的滴度。
Q:什么是病毒的滴度?
A:病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒数量。滴度值用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量。
Q:转导单位(TU)的含义?
A:转导单位(TU)即能够感染并整合到细胞内的病毒载体基因组,
Q:MOI的含义?
A:MOI指用来转染单个细胞的病毒数量，即含义是感染时病毒与细胞数量的比值。如果MOI为1则感染每个细胞的病毒颗粒数为1。同一种类同一批次的病毒感染不同种类的细胞，其MOI值不尽相同，需要进行梯度实验测算;另外不同的滴度检测方法也会导致MOI很大的差异。
Q:可以获得的病毒可以达到多少滴度?
A:常规生产的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之间。
Q:如何使用慢病毒感染细胞?
A:使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类，因此首先要了解细胞的来源和背景，我们将在发货时将通用操作流程发送客户。通常来讲首先要根据准确的MOI和需要感染的细胞量计算所需要的病毒量，然后将所需病毒也加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。
Q:如何确定慢病毒感染靶细胞的感染效率?
A:慢病毒感染靶细胞的感染效率可以通过Real-time PCR检测靶细胞中的慢病毒载体拷贝数来测算。另外如果构建的慢病毒载体带有标记基因(如GFP、RFP等)，则可以通过FACS检测阳性细胞的比例来评估感染效率。
Q:慢病毒感染靶细胞后，目的基因的表达是瞬时表达还是稳定表达?
A:慢病毒感染靶细胞后，目的基因或者干扰序列被整合到细胞的染色体DNA;并且随靶细胞的增殖分化，目的基因或者干扰序列也随靶基因DNA的一起复制并遗传到子代细胞中,所以是稳定表达。
Q:通常生产一个慢病毒载体的实验周期是多久?
A:我们将在收到您的订单和实验材料20个工作日左右完成病毒的生产和检测，如果客户需要委托购买或者合成目的基因(干扰序列)，会增加相应的实验周期。
Q:是否可以直接从慢病毒颗粒中提取慢病毒载体?
A:不可以。慢病毒载体用于转染包装细胞后生产病毒，包装好的病毒颗粒只含有载体中5' and 3' LTR's的RNA。
Q:使用公司提供的病毒可以感染多少细胞?
A:可以感染的细胞量取决于您需要感染的靶细胞的易感性，原代细胞或者难感染的细胞需要较高的MOI,因此需要的病毒量也比较多。我们建议您可以通过预实验确定目的细胞的MOI,即使用公司的GFP病毒设定不同的MOI(1、5、10、15等)分别感染目的细胞。
Q:如何知道靶细胞是否能够被慢病毒感染?
A:根据现有的研究表明，慢病毒感染谱很广，包括分裂和非分裂细胞。一方面可以通过查询文献得知是否可以被感染，另外也可以使用提供的GFP慢病毒载体对照颗粒进行预实验，确定细胞的易感性和MOI.
Q:在使用慢病毒时需要哪些预防措施?
A:慢病毒的操作要求在BSL2级别的生物安全柜内进行，实验操作人员需带上乳胶手套，按照标准的细胞培养操作流程进行。
Q:在实验室使用慢病毒是否安全?
A:慢病毒载体包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5&LTR换成CMV (巨细胞病毒早期启动子)、3&LTR换成SV40 polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。目前在用HIV-1载体已经进行的所有体内外实验中，未出现过有复制力的HIV，说明其安全性是有保证的。
Q:什么是自身失活慢病毒载体(SIN )?
A:SIN 载体的构建是将载体3&LTR(长末端重复序列) 中的U3区增强子和启动子序列删除。U3-LTR 是前病毒DNA 两端LTR 中U3 的模板, 在逆转录过程中, 3&L TR 中的缺失被传递到子代载体的5&L TR 中, 所形成的载体缺乏HIV-1 的增强子和启动子序列, 即使在所有病毒蛋白都存在的情况下也不能转录RNA , 产生了一个灭活的前病毒, 但其中的外源启动子仍然有活性, 能进行基因转录与表达。这种方式主要用来消除病毒LTR 中的启动子/增强子序列对病毒载体中外源启动子指导转录的干扰作用，以及消除可能的由3&L TR 启动子指导的下游基因组中原癌基因的激活与转录作用, 一定程度上提高了载体的安全性
Q:获得慢病毒颗粒后是否可以在实验室中进一步增殖?
A:不可以。科学家考虑到了其使用的生物安全性将慢病毒载体改造成为复制缺陷型病毒载体。获得的病毒颗粒的基因组不具有重组所需要的基因，并且载体具有3'LTR.自身失活的特性。
Q:慢病毒颗粒能保存多长时间?
A:在-80度条件下，慢病毒可以保存6个月左右而滴度没有显著丢失。
Q:公司生产的慢病毒的滴度是怎么定义的?
A:公司生产的慢病毒的滴度是感染293T细胞后使用FACS检测有限稀释的病毒感染细胞的阳性细胞比例来测算，或者使用Real-time PCR的方法检测获得的。
编辑：songjiajie2010
食品实验室检测技术、实验室管理知识
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慢病毒操作安全性？求助
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这个帖子发布于2年零71天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
实验室有人操作二代慢病毒，在超净台操作，忘关风机，未戴口罩，将病毒液加入目的细胞中，约1小时，会怎样？如何补救？
不知道邀请谁？试试他们
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理论上,慢病毒需要生物安全柜保护操作者.实践上,管他呢,放开了抡
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我也差不多这么做了一回。吃了片维C吃了包板蓝根抗病毒，不知道会怎样。一年过了你现在怎样？
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没那么危险，不用太担心
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没那么危险的，它们只是遵照HIV的原理，并没有HIV的那种毒性。你想想要是真有HIV那种传染人的性质和毒性，那岂不是大家全都在做生化武器嘛
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这样做了一次，无任何防护，还开风机，现在还在担心自己，下个月准备去检查一下
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我一个同事他们在学校的时候从未用过生物安全柜，都是在普通超净台里进行慢病毒实验。
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应该对操作者没什么影响，还没有因为操作慢病毒而感染HIV的吧，不过实验操作还是要保持良好的习惯。第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的′LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个（gag、pol和rev）。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。
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这种慢病毒是不是应该从属hiv的病毒属性，不会通过气溶胶经过呼吸道传播吧
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关于丁香园