细节曝光，Oxford Nanopore真机还原，听听圈内人听听她怎么说 很现实

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-10-20 09:16 标签： 注意细节 英语怎么说
细节曝光！Oxford Nanopore真机还原，听听圈内人怎么说
细节曝光！Oxford Nanopore真机还原，听听圈内人怎么说
Oxford Nanopore| 生信者言|Oxford Nanopore这几天在国内测序圈火翻了天。不管是逆天的读长，小巧的身材，平民化的测序仪价格，实时测序、随时终止的灵活性，都赚足了眼球。就这个话题，我们跟十几位测序圈内的朋友们聊了聊，很多人都听说过Oxford Nanopore，大家最为熟知的产品类型是它的明星产品MinION，聊天中出现的高频词汇是“U盘式”、“超长读长”、“错误率”。对于ONT的前景，唱好唱衰的都有，但大家都对这一仪器的真貌、操作和数据应用情况都无限好奇。于是，我们在ONT官网、ONT官方推特、London Calling官网和使用者们的分享中网罗了一些资料，尽可能的还原出来ONT仪器们的真实样子，让大家一睹为快；并附上在圈内工作的朋友们的一些看法，分享给大家，以供参详。大家都听说过的MinION到底长什么样子？MinION上得了外太空，测得了埃博拉病毒，长相小巧又讨喜，是ONT乃至整个测序界的明星产品了。目前MinION的最新版本是Mk 1B，更新于2016年5月，flow cell最新版本是R9，内含2048 wells。MinION是目前唯一的便携式DNA和RNA测序仪，注意这里有两个概念，一是便携式，MinION只有100g重，相当于1个大一点的U盘或者小一点的移动电源；二是DNA和RNA测序，和所有NGS测序仪、甚至三代Pacbio不同的是，MinION和其他的ONT仪器们，可以直接对RNA进行测序，无需预先转化为cDNA。此外，一旦启动测序，实时的数据会不断产生，而不用像传统的NGS测序中一个run结束后才能收获数据，一旦数据量足够可随时终止测序进程，简直不要太爽！未拆封的MinION外包装，跟大家卖肾换的iPhone外包装差不多大小。“看起来像是小时候用的铅笔盒”，“后面白色的是废液缸吧，盒子长度也就两个废液缸吧”，“盒子就这么小，仪器得小成什么样……” 然后，我们在众人的期待中翻出来了开箱后的真机图片。开箱！仪器内盒的设计还是很逼格满满的。仪器目测手感很棒，比一般的U盘大一点（有小伙伴表示，这样的银色金属U盘，家里有一打。“能一边喝咖啡一边做实验，简直是生物狗们做梦都想不到的美事啊！”ONT虽然slogan称随时随地测序，目前样本制备到文库构建还是独立于测序仪之外滴。跟大家熟悉的其他测序仪一样，根据不同的需求可以选用不同的建库试剂盒。除此之外，在2015年ONT推出了一个完全整合的自动化文库制备系统--Voltrax。要知道，对于很多分子实验经验欠缺的小伙伴们，这可谓是重磅福利了。Voltrax不足手掌大小，5~10min即可完成建库。目前Voltrax还只能支持核酸进样，尚不支持直接的生物样本上样。打开外盖，文库进样，准备上机了！“我看到了神马，狂拽酷炫吊炸天的红蓝荧光棒？？”上机操作的实拍视频！制备好的文库拿出来，加文库上机，合上盖子，在电脑上启动测序程序，整体过程简单到不可思议。连到电脑上，开始测序。48h即可产出10~20 Gb数据，前面文库制备10min左右，如果核酸提取按半天算，两天半即可完成测序全过程。MinION测序仪运行过程的视频如下。测序时，每个碱基依次通过纳米孔，并实时检测引起的电流改变，不同的碱基产生的电信号频率和波形会发生改变（甲基化后的碱基和正常的碱基产生的电信号也有区别，这个我们下期介绍）。这些数据经过MinKNOW和Albacore等来进行碱基识别和输出，目前的仪器上，原始序列数据可以选择只输出fast5或同时输出fast5和fastq两种序列格式。（fast5怎么转化，参见《【深度】NGS数据格式演化简史》）。后续的生信分析，ONT成立了Metrichor公司，提供集成分析解决方案--EPI2ME，EPI2ME平台能快速、流程化的帮助用户完成数据分析的过程，以保证信息的实时性。测序公司们更为青睐的--GridION X5GridIon X5系统是一款桌面式测序仪，通量介于大家熟悉的MinIon和高通量的PromethIon之间。GridIon X5系统一次最多可运行五个MinIon flow cells，可以根据实际数据量的需求一次运行1~5个flow cells。目前的最大通量是，每运行48小时可产出高达100 GB的测序数据。从通量和灵活程度看，GridIon X5显然更适合于公司或通量高的core facility投放。GridION长宽差不多是一个13~15寸的笔记本大小，重量大约10 kg，一个女生就可轻松抱起。照例先放一个开箱图：打开安装好的真机，长下面这个样子:再来张GridION的近照，可以看到内置的5个流动槽。小伙伴们表示，&这总算是有个实验仪器的样子了。小人国里的大块头--PromethIONPromethION是一个具有模块化设计的更大的台式测序仪，其在全功率时的运行能力约为MinION的300倍，通量在Tb级。包括48个flow cells，这些flow cells可以单独运行，也可以一起运行。这款高通量测序仪的好处是十分灵活，几乎适用于各种测序场合。如果有海量的数据量自然不在话下，如果有小的数据量需求，也可以灵活调整，无需漫长的等待凑样过程。虽然仍不能和其他测序仪相较而论，PromethION确实是ONT所有仪器里面最“大块头”的了。真机长这样：智能手机上的移动测序仪--SmidgION如果说MinION给我们带来的是全新的便携式测序体验，SmidgIon则提出了更新的概念--移动测序仪。SmidgIon比MinION更小，可以通过充电接口和耳机接口与智能手机或其他移动设备连接，非常适用于紧急情况的实时处理和现场分析。一起来体验下SmidgIon真机图：SmidgION插到iPhone上运行，unbelievable！“于是测序真的回归为人人都用的了的检测技术”。从官方推送情况来看，在现有的四款测序仪中，目前ONT下了大笔墨推MinION和GridIon，前者主要推他家slogan中的“by any person and in any environment”，面向大众，后者则主要还是抢占测序公司、大科研单位等core facility这些，官方对仪器、试剂、乃至后续base calling和下游分析的软件都更新的很快，仅2017年（截至今日），就有1,440篇文献refer to Oxford Nanopore，可见在科研界，ONT影响力还是不错的。近期我们将推出“ NANOPORE最新研究进展系列”，聊聊ONT在环境微生物、基因组de novo、变异检测、转录组、表观遗传、临床应用上的最新进展和技术情况，ONT的生信分析软件和流程等，敬请期待~下面，我们摘录了几位圈内朋友的看法...@Levin 海外市场经理很关注，之前专门做过他们的调研，有消息称ONT的用户已覆盖全球七十多个国家，整体上来说，发展态势不错。也陆续解决了很多业内人一直关注的问题，比如连续碱基的读取问题，ONT base calling的软件官方出品的是MinKNOW和Albacore，最近Albacore出了新版本，内置算法也更新了，也就意味着连续碱基的误差降低了很多。看London calling和twitter、官网的信息，错误率确实是在降低，具体可能根据用的试剂和样品不同还是有区别的。事实上，海外还是有很多用MinION的个人用户，对于他们而言，其实他们更关注Voltrax这种从前面就开始自动化了的东东，开玩笑，做实验很难的好么！有在用的朋友抱怨，如果能直接进样品才好呢，哈哈。@黑卷尾 研发工程师从原理上说，Nanopore的读长和通量都是无敌的，对于研究变异的实验室，长读长有很大的吸引力；但是测序质量还有待验证，一个很大的缺陷是对于多个连续碱基的测定不够准确，在进行人类基因组这样复杂的样本测序时，可能导致bias，即某些位置会怎么都测不到，不知解决到什么程度；另外，碱基质量打分和与比对率都比较容易得到好看的数字，但并不能完全说明问题。三代测序应用前景的兑现还需要一段时间，一个很重要的原因是基因组学的整套工具链还是为illumina量身打造的，导致现在制定行业标准时也无形中向二代倾斜。此外，测序准确率是实际应用中的一个硬标准，对于Pacbio来说，其本身的错误率较高，但可以通过加深覆盖度来做errorcorrection。对于Nanopore来说，如果读长已经到了Mb级别，真的还需要每个read都保证那么准确吗？目前没有人能给出确定答案。@欣欣 技术支持我之前做过海外市场的技术支持，对ONT有一些了解，技术很颠覆，他们有个口号“analysis of any livingthing, by any person and in any environment.”，海外客户接受度还是蛮高的，欧洲、美洲、日本，应用都很多，去年底刚融了一大笔钱，传闻很快也要在中国开展业务了，看好。@华行 生信分析工程师知道。前两天看到未来组发布了数据，产出和质量比之前文献中报道的好些，但是根据官网和London Calling来看应该不止如此。就拿读长来说，官网写的都是几百k了，最长的据说有到990k。单个flow cell产出也低于预期。原始数据还没有要来看，期待有更多数据，毕竟大家对超长读长还是寄予厚望的哈。@晓冬 销售经理概念很好，但要说目前的市场，我不看好，或者说，我觉得没那么快。说到底，销量是衡量和检验一个测序仪好坏的最直接标准。Illumina宣称90%以上的测序数据都由Illumina仪器产生，但因为Oxford Nanopore 目前尚未上市，财报未公开，每个型号测序仪的具体销量数字尚未可知。且不说对于测序公司MinION那点通量够干嘛？就算真的仪器、技术过硬，我在科研上是否能应用？主流上对他的接受度？与以前的数据结果能否整合起来看？这里面还挺多问题的，得慢慢解决吧。@刚 产品经理没见过真机。知道有一个能和手机连接的测序仪SmidgION，这个要是推出来，基因测序的应用场景有很大的想象空间吧？对于ONT，你了解哪些？有什么想法？欢迎关注生信者言，和我们一起交流/End.文中图片和视频来自Oxford Nanopore官方Twitter
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