经颅磁刺激（TMS）产生瞬时干扰到大脑中的靶区域的正常神经活动通过创建这个短暂的神经干扰和测量行为或生理的变化，我们可鉯得出目标区域和实验测量结果之间的因果关系（综述见帕斯夸尔塞拉利昂等和泰勒等人 ^1,2）。这样的实验效果可以是例如，在认知任務或在电生理（EEG）活动的变化的性能事实上，近年来的研究人员已经开始使用TMS与脑电图结合直接关系皮质区与事件相关电位（ERP）或振荡活动模式（ 如 ^2-7）在这种方法论文章中，我们将描述相结合的TMS和脑电图特定的和有用的框架：在一个ERP实验fMRI的引导TMS首先，我们将详细介绍洳何TMS适用于FM预定义区域RI同时记录脑电数据。然后我们将描述一个实验设计，允许提取可靠的ERP系统这样的实验的目标是与因果功能磁囲振成像的利息ERP成分透露链路的大脑区域。最后我们将给予有关脸部和身体的选择性与ERP的脸和身体被发现与选择功能磁共振成像领域研究的一个具体例子。

什么是联用功能磁共振成像激活脑电信号的好处脑电图和功能磁共振成像是常用的工具来测量皮层反应，视觉输入例如，类选择性在视觉通路被评定为不同的视觉对象的类别如脸部，身体部位并书面文字，无论是通过ERP系统的手段从脑电数据^8,9和功能磁共振成像^10-12提取然而，这两个共同的研究工具测得的信号是根本不同的性质，脑电图怀揣着伟大的时间有关的神经电活动信息精喥，但是非常低的空间分辨率并可以反映许多单独的底层源的混合物。功能磁共振成像提供了神经元活动的间接测量依赖于刺激呈现和/戓任务执行中出现的慢血流动力学改变但提出这一活动具有更高的空间分辨率。从而确立了两项措施之间的相关性可以有很大的兴趣泹在有限的，它并不意味着头皮记录的电生理反应和功能磁共振成像揭示了区域之间的因果关系即使同时测量（ 例如 ^13-15），脑电图和功能萣义皮质区的活动之间的双向因果关系无法确定 TMS是一个可以帮助实现建立这样一个因果关系的工具。

一个同时脑电图-TMS研究在方法论上是具有挑战性的这主要是由于引入脑电图信号b高压神器y中的磁刺激（ 见图1，综述见Ilmoniemi 等^16）。这神器由一个短的瞬态脉冲生活相关的干扰往往紧接着就是可能会持续几百毫秒的脉冲传递图2A后，超然的兴趣最ERP成分较慢的二级（或剩余）神器这个次级伪影可以包括机械源，如甴磁脉冲感应到布线和这些电流在皮肤的缓慢衰减的电流和生理来源，例如在头皮和听觉或体感诱发电位由操作引起的肌肉活动线圈^17-20雖然干扰的机械源可能产生较大振幅的文物比生理的，这些不同的工件不能分离其中的任何信号中的存在，可以混淆的结果一个可能使禄讯是重复的脉冲TMS前脑电图记录（“离线TMS”）的应用，而不是同时进行脑电图-TMS上皮层活动这样一个协议的抑制作用持续几分钟（而长達一个半小时）的刺激后，和脑电图可以在此有效时间窗内进行测量并与基线相比，预TMS脑电图数据。重复刺激然而，是通过定义缺乏网上TMS可以提供??，其中脉冲可以在精确的时间相对要给予审判开始在毫秒级的分辨率高时间分辨率重复刺激的效果也可以通过跨樾更广阔的领域皮层连接比期望的传播，因此显著降低空间分辨率为好

为了充分利用双方的空间和时间分辨率的TMS可以提供??，同时脑電图-TMS组合可以应用然而，这需要用于去除伪影的方法通过对脑电信号的磁刺激产生的为TMS假象去除很少下线的数学解决方案已被提出^16,21,22，雖然没有方法达成一致也没有一个方法可能是最适合所有的实验设计。 A“剪切”的系统包括一个采样保持电路，也被开发过程中的TMS脉沖传递20到暂时停止脑电信号采集这种技术不仅需要专门的硬件，但可能无法完全去除残余的TMS神器在本文中，我们将介绍由Thut和他的同事¹⁹特别适合于ERP系统的研究开发的EEG-TMS方法的适应。这种技术可以让ERP系统的可靠提取同时消除所造成的一切TMS脉冲图2中的残余噪声成分。我们将進一步提供迈向成功的EEG-TMS实验装置一般指引

在TMS研究的另一个挑战寻址的In这个方法的论文是找到所需皮质区的准确定位的最佳线圈的位置和角度。我们将描述使用立体定位导航系统的给coregister被检者的头部与预采集功能MRI图像虽然导航系统可用于定位解剖定义的大脑结构，因为许多功能和效果的实验活化的精确位置不能从单独的解剖标记推断的功能磁共振成像引导的定位是特别有用的。对于感兴趣区域（ROI）这样的功能区域一个区域的定义是为每个单独的参与者。

为了说明上述所有的我们将提供我们以前进行的，其中脑电图是同时与TMS通过功能磁囲振成像激活⁷引导记录进行研究的例子在这项研究中，一个双解离面选择性和体内选择性的事件相关电位之间作出：虽然面部和身体的ERP豌豆?围绕同一延迟和电极位置，在横向枕叶靶向单独定义面选择性和体内选择性区域使我们能够离解的神经网络的每个ERP响应相关最后，我们会尽量给更广泛的意见以在TMS优化应用脑电记录。

该实验是在两个单独的会话进行在第一届会议的功能磁共振成像实验（ 如功能性定位器）进行，以确定对个别科目进行所需的TMS的目标区域 fMRI的结果，然后送入一个立体定位导航系统针对一个准确的TMS第二届会议举行後的fMRI数据，在此期间脑电图的同时TMS记录的分析。这里所描述的方案经特拉维夫夫Sourasky医学中心的伦理委员会

1，fMRI的Session和功能磁共振成像数据分析

1. 利用平面回波成像（EPI）的测序运行功能磁共振成像任务e来确定激活与TMS为目标所需的焦点对于相邻的区域，如在OFA和EBA在下面的例子之间的哽好的解离高分辨率扫描推荐。为3mm ³或更小的体素用MRI头部线圈的8个信道以上获得足够用于划定相邻的区域。
2. 运行T1加权结构扫描以获得鉮经解剖学数据。确保参与者的脸上完全包含在视此扫描领域由于图像上的外部标记（鼻如尖）将用于以后coregister对象的头部，其扫描
3. 数据收集后，使用MarsBar工具箱SPM的基础上实验条件之间的对比来定义感兴趣期望的大脑区域。使用反差面临>对象来定义枕部面孔区（OFA）和机构>来萣义Extrastirate体面积（EBA）的对象。为了进一步确保第在两个皮质目标在功能上是不同的用“相结合”（在MarsBar）从每个投资回报率掩盖任何体素应对其他实验条件（从EBA排除面体素，以及身体的体素从OFA）
4. 为了上传到导航系统的结构扫描的文件，以及相关的功能的对比文件复制到便携式驱动器。

2准备一个范式脑电图-TMS实验，使提取的ERP

描述在下面的部分是对的方式允许提取可靠的和可复制的有效保护率在¹⁹ TMS的应用脑电图收集数据的方法。这种技术的优点是它可以轻松地处理二次，持久TMS工件，并具有足够的鲁棒甚至允许在位于正下方的TMS?电极恢复数据的油，那里的神器是最高电压和持续时间最长的。

1. 运行在单独的块中的不同TMS条件（不同的目标脑区以及一个无TMS条件）。
2. 内的每个块给出與所有的刺激条件（ 例如面孔对象，场景等）随机的事件相关设计的参与者。
3. 对于ERP系统的更好的质量和TMS噪声模板（如下）请确保让烸个条件至少有50次试验。
1. 在TMS脉冲/脉冲的定时设置为图像发病后所需的等待时间这是通过写入一个并行端口，从该电缆进入到TMS刺激器完成嘚此功能可在大多数的软件进行心理实验，如Psychtoolbox的MATLAB 24或E-首相（3个版本2或）（见材料表 ）抖动的相互刺激间隔（ISI），以减少刺激（脉冲）可預测性（例如在每个ISI加0至500毫秒之间的一个随机值）。
2. 准备一个额外的空白屏幕条件：
   1. 准备期间TMS将在相同的强度得到应用，但屏幕上没囿刺激呈现的试验这些空白屏幕TMS试验，会被计算TMS神器模板在没有视觉刺激
   2. 设置空白试验的重复次数是相同的块内的实验条件中任一项嘚重复数。
   3. 对于TMS剩余工件的形状的精确表示随机在整个块，而不是介绍他们都在开头或结尾的空白试验

3，建立了脑电图和神经导航系統并进行了实验

的单独定义的ROI定位准确TMS为可能与使用立体定位导航的gation系统，由红外摄像头安装在参与者的头部，和一个专门的软件红外传感器

1. 基于TMS的安全标准屏幕的参与者。从参与主体具有自我癫痫史或家族史排除科目与其他神经系统疾病，或有频繁的偏头痛以忣精神药物科目。虽然通常不筛选受试者怀疑为植物神经紊乱如血管迷走神经syncopes（大多表现为一种倾向，容易晕）也可被排除在外至少2尛时前实验指导参加者，以避免酒精饮料开始前晚上含咖啡因的饮料。为了进一步说明和安全的讨论见罗西等人
2. 准备吨他神经导航系統：
   1. 之前的会话启动，饲料结构的扫描文件到导航系统的软件
   2. 在结构图像叠加功能磁共振成像结果（在对比）。
   3. 使用神经导航软件标記在图像上期望的目标，以及外部的解剖标志这将有助于对配准：在鼻尖，鼻桥通常被称为鼻根的最深部分并且每个的耳屏耳。
3. 安装茬参与者的头部脑电图帽和连接电极：
   1. 尽量保持电极阻抗不超过5KΩ高。
   2. 为了避免电极的TMS相关的供热用尽可能少的凝胶越好。为了达到良恏的阻抗与凝胶的少量进行彻底的皮肤准备或者，要求学员来到实验前要洗自己的头发
   3. 确保电极线不交叉EA通道和其它被定向远离线圈嘚位置。避免在导线环路
   4. 使用高采样率的噪声伪影的更好的代表性。这是推荐使用1 kHz或以上如用此方法最先前的研究已经做^7,26-28。
   5. 将参考电極和接地电极从线圈尽可能远在这个例子中，在枕叶皮质区用鼻子参考和Fz的地面⁷被瞄准了对于其他的例子见^{3,4,27,29,30。}注意数据可以被重新引用脱机到一个新的参考根据需要，如常见的平均值
      
4. Coregister被检者的头与扫描，如下所示：
   1. 安装在参与者的头部的红外探测器
   2. Coregister头位置使用预萣义的标记（尖端导航系统鼻子等。参见图3）这是应重复块之间的配准，以确保准确的线圈??放置在所有阶段
1. 让主体与坐在离屏幕適当的距离，下巴搁在腮托
2. 确保参加者在舒适的椅子上，因为他们被要求从运动过程中实验组（用于精确的噪声测量模板很重要），鉯避免
3. 从导航系统图3选择TMS目标。
4. 使用指针工具（见材料表 ）让导航系统引导用户的最佳线圈的位置，并将其与电极帽的小贴纸标记鉯保持指针垂直于所述头部是很重要的。重复此阶段每块之前请注意，这是不推荐的块中使用的在线导航（导航线圈本身而持有它），因为任何一个线圈的运动应避免在TMS神器模板的最佳测量人们发现，预先定义与标记的TMS的位置是实现稳定的刺激的最佳方式
5. 引导线圈嘚精确中心到该标记时，同时保持由一个夹持器请确保它是相切的头部。
5. 设置在TMS强度为所需的值管理一个测试脉冲为参加者的批准。
6. 無TMS的条件：如果一个专门的伪TMS线圈不可用在TMS线圈放在旁边的对象的头部，并倾斜90°。运行该块像往常一样包括空白试验。
   读者也可参阅咹灯和Zatorre ³²的朱庇特的视频文件导航系统的进一步论证

4，分析的脑电数据和计算ERP

1. 除去眼前的脉冲ARTIF行为如下所示：
   1. 如果剪切设备不可用（见仩文），在脑电数据处理的第一步是将切出眼前的TMS脉冲神器本身的数据注意，该步骤可以如果不想要的过滤器被跳过。但是如果应鼡的过滤器，神器的锐边形状将在数据造成扭曲脉冲发病后窄的时间窗口为10至15毫秒就足够了，但可以肯定的是数据的目视检查以验证這一点。
   2. 连接脉冲去除后创建的两个切口两种主要的方法实现这一点已经提出在以前的报告：1简单地加入脉冲切除后剩余的两端连接在┅起（见Fuggetta 等^[26]和图1）;。 2由它们产生⁷之间等距值内插两切端之间的一条线。用于这种插值的方程如下：对于每个丢失的数据点y处的样品的x計算Y = Y ₀ +（（Y _{1-Y 0）*（XX 0））/（X 1-X 0），}其中x ₀和y0 _顷的切段之前的最后一个数据点的坐标并且x ₁和Y ₁为切段之后的第一个数据点的坐标。这两种技术确保过滤器能够在数据被应用而不会产生因急剧的电压的步骤波纹，如在图1中 参考工作由赖欣巴哈和同事²⁷为更复杂的^三阶多项式插值。
1. 对于每個实验模块包括一个无TMS控制状态（如果存在），通过时间锁定他们进行审判开始计算一个平均的ERP系统以空白画面试验（好像图像已提茭）。
2. 减去这个平均值从模板的所有其他刺激条件下每次试验如果有多个块被执行对于相同的刺激部位，分别做这对于每个块作为模板将是各块之间略有不同。
2. 所有其他的预处理和加工步骤进行如在任何其他ERP实验

并发脑电图-TMS调查是用来揭示了ERP响应面，并记录在枕颞部頭皮机构是否分离当视觉刺激呈现，一个突出的N1成分被记录在后外侧电极位置特别是，N1成分通常是较大的脸上身上，而不是其他的刺激类别^8,33通过评估刺激对面部和与fMRI的它们各自的面部和身体N1组件定义体选择性脑区的影响，我们试图揭示面部和身体N1回应是否反映（至尐部分地）不重叠的来源或者说同样的网络活动与定量不同的激活水平。

我们采用了双脉冲刺激在60毫秒和100毫秒的图像后发病（例如，參见投手等人 ^34,35）在脸上选择性和体内选择性区域在横向occip ITAL皮质-枕叶面孔区（OFA）和纹外体面积（EBA）（ 图4A，见上面的相关功能磁共振成像的定義第1.3节的对比）这两个区域被刺激在不同的区块，同时观察受试者的面孔和无头尸体的图像结果表明，刺激的OFA提升N1振幅的面孔而不是身体而刺激到EBA提升N1到身体，却不能到面 图2B描绘了脸N1之前和TMS残留神器减法之后， 图4B示TMS的N1成分作为刺激面积的函数的具体效果

这些结果表明并发脑电记录时如何fMRI的引导TMS可用于评估两个（或更多）的神经网络是否被解离，以及建立一个功能定义的大脑区域和电生理信号之间嘚因果关系

原始数据和处理数据，在横向枕电极

原始脑电数据包括两项试验中，40毫秒（红色箭头）分隔每个包含两个TMS脉冲

放大到脉冲切除后的数据两个脉冲在每个试验从数据通过切削周围的双脉冲的一个窗口（2毫秒的第一脉冲之前到16毫秒的第二脉冲之后）除去。切割邊缘然后由内插（红色箭头）的连接方式如4.1.2所述

内插的段允许滤波，而无需创建边缘伪影在该图中，40赫兹的低通滤波的ERP（红色）作图其非滤波版本（灰色

作为替代插补被维持脉冲除去后的自由端可连接在一起（例如，参见Fugetta

并在文本点4.1.2）这里，两种方法进行比较并顯示高度相似的波形（蓝色和红色迹线大多重叠），之后在40赫兹的低通滤波红色轨迹：线性插值的方法;蓝色轨迹：无插值（连接边缘拆開仅供密谋宗旨，不断时间轴的一致性）

图2：TMS文物和减法技术 （一）左- ERP的时间锁定到面部的图像的呈现，与双脉冲TMS在60毫秒和100毫秒图像后發病每一行代表一个电极。请注意对于某些电极直接TMS工件之后是一个较长的残留伪影。正确的-大概线圈的位置是由两个红色圆圈象征和一些电极被标记为方向，（B）神器-减法的过程眼前的脉冲神器被删除（隐藏），剩余噪声的模板是基于“只有TMS”试验中测出并从铨试验中减去。改编自Sadeh

图3立体定向导航系统。上图：地标设置为corregistration为了corregister头的结构的扫描与在实验过程中的实际头位置，解剖标志被标记嘚图像上如箭头所示。然后在对被检者的头部相同的地标空间位置提供给系统与由相机底部检测出一个专门的跟踪器的帮助下：脑功能区可以精确定位。激活重叠的解剖图像上并希望区域标记并保存。会议期间实验者可以加载一个预先定义的区域来定位TMS。

双脉冲TMS施加要么向右OFA或向右EBA在60毫秒和100毫秒的一个面或一个无头体图像的后发病。面对-N1和体N1反应之间的分离作出

这两个目标区域中有代表性的题目

咗-面部和身体网络之间的双重分离 TMS到OFA增强N1的响应面，而不是机构相对于TMS的EBA。相反的图案示为无头体的刺激右键 - N1峰值振幅的面孔和身體，下面的OFA的刺激EBA刺激，无TMS刺激误差棒表示SEM。这个数字是改编自Sadeh许可

具有独特的能力暂时中断在选定的皮质区正常神经元的活动，茬精确的时间点并具有相对良好的空间精度，TMS允许因果关系与行为或神经生理学测量链路一个刺激大脑区域在本文中，我们描述了一種在并发应用TMS脑电图测量目标定义功能皮层区，并应用分析使ERP系统响应的可靠的测量。我们举了一个例子来自于它的TMS被用于与EEG和fMRI的组匼来询问是否给予fMRI的定义的大脑区域（ 即 OFA和EBA）是因果关系与ERP回应他们的首选刺激（ 即面孔和身体）相关的文献

描述的减法技术，这是验證¹⁹和一些研究^7,26,27应用有几个值得注意的优点：它允许消除的残差人长期TMS神器占地最显著的ERP成分的时间窗口;它同样消除了伪影分量从肌肉，機械（电气干扰到电极）和非期望的皮层（ 例如听觉）的起源;并且它是坚固和可靠的，即使在电极的正下方或其附近的线圈躺注意，線路噪声也可以显着在这些电极中，除了增强的振幅的TMS脉冲的工件由于线圈可能接触或趴在靠近电极或导线。这里展示的技术能够有效保护率在这些电极部位的提取以及。这是最重要的因为很多时候感兴趣的诱发反应起源于或接近刺激皮质区。此外从整个头皮恢複的信号是必要的，其中源重建算法所需的箱子

研究工具的组合SUCH为TMS，EEG和fMRI的每一个提出的神经活动的不同方面和攻击从不同的角度类似嘚问题，是一种很有前途前进的人类认知和脑功能的研究它可以预料，TMS将越来越多地用于与脑电图结合因果联营认知或行为功能的电活動并进一步探讨目前正在开发领域，如同步脑震荡和连通性，在高时空分辨率

三维（3D）肿瘤球状体是“球对称肿瘤细胞类似于组织的聚集体没有人工基质细胞附着^”1-3。肿瘤的细胞学和形態学球状体更好地模拟了体内的肿瘤组织的组织与微环境比单层的二维（2D）细胞 3D球体瘤已成为一种实用的体外模型用于抗癌治疗药物高通量筛查或研究的候选药物的疗效在动物体内或临床试验前^4。在临床上任何抗癌药物治疗的疗效是基于减少的肿瘤生长进行评估。类似哋球体体积可作为疗效的体外抗癌药物研究的一种度量。球体体积（V = 0.5 *长*宽^2）乃根据主要和次要轴向长度决定（通常称为长度和宽度）该浗状体的^6,7大多数研究者必须手动绘制每个球体的长度和宽度，往往采用由显微镜公司提供的并与成像仪器一起销售的软件。这种技术荿为问题时高通量药物屏幕执行和超过数百个图像的产生。最近的一些研究报道了使用开源的图像分析软件工具箱如CellProfiler ^8-10和ImageJ的¹¹开发简陋分割程序/宏涉及光量校正和简单的阈值。这些程序通常需要进行重新调整用于根据所述照明条件和图像对比度变化不同的图像的批次;因此，这些软件包不能满足高通量的图像分析的鲁棒性要求弗里德里希和合作者（2009）使用专有软件来测量球体的体积半AUTOM胶东东部^5。在Monazzam和他的哃事的纸张¹⁰中描述的方法是一种半自动化的方法来测量球体的大小只有一个小的数字图像因此，存在一个明显需要强大的灵活的，自動化的并准备使用的图像分析工具，为3D肿瘤球体

在这项研究中，我们描述SpheroidSizer - 一个基于MATLAB的和开源软件应用程序自动准确地测量肿瘤球体嘚大小。 SpheroidSizer被设计来处理的3D球体图像的许多不同批次在同一会话中利用主动轮廓算法^{12-14，SpheroidSizer}可以容忍图像的对比度变化有力忽略背景照明逐漸变化，并认识球体的形象它也可以容忍许多平常的文物， 如碎片源于标本。该工作流被设计为使得用户能够执行质量控器升过程中戓经过计算的分析结果，手动重写可以很容易地在现场进行利用并行计算工具箱，分析速度可以进一步通过协调多个计算内核上的計算同时在用户的计算机上工作的升压。此外SpheroidSizer结果输出有两种不同的形式，以方便接口与下游分析工具

1，三维球体瘤形成药物治疗囷图像采集是在我们以前的文章¹⁵进行描述。

1. 安装许可MATLAB软件到用于图像分析的计算机还需要在MATLAB下工具箱将会安装 - 信号处理工具箱，图像处悝工具箱和并行计算工具箱*（*所需的并行计算模式）。
   注：许多大学购买和维护组许可证的这样的软件是免费下载和使用的附属科学镓。
1. 将zip文件保存在本地文件系统
2. 保存文件到指定的目录/文件夹，随后将被简称为T他“安装目录”
   注：SpheroidSizer已经在Windows 7操作系统被广泛的测试。咜预计将有最低限度的调整（未测试）工作的替代操作系统

1. 确定成像系统（图像的绝对规模在每像素（微米/像素）微米）的图像缩放/分辨率。
   注：如果每个像素的摄像头芯片上的尺寸是已知的在图像规模可以被计算为目标放 ??大倍数×像素大小 （微米/像素）。这个值鈳以从配备有显微镜作为嵌入的元数据或从成像系统供应商的帮助成像软件来获得这个值将被要求在步骤4.6。
2. 转换任何专有的图像文件格式为接受的文件格式 - TIFFJPEG等常见图像文件格式。
3. 命名的图像文件并安排directoriES（ 图5A）。
   注意：该软件依赖于目录结构和文件名的正确布局的结果格式化成片格式：
   1. 名称以下列格式的图像文件：[板块名称] _ [行] [列] [扩展]或[板块名称] [空格] [行] [列] [扩展] [行]遵循字母顺序[专栏]如下的数字顺序。
      注：鈳自由查看的自动批量重命名软件可以发现，以帮助用户在这一步
   2. 安排基于该实验以下面的方式在目录/文件夹：每个实验都应该有一個目录。在每个实验的目录应该有子目录，每个时间点在每个时间点的子目录，应该有来自所有板块全部图像
      注：为了使分析结果進行优化排序，格式化的结果我们建议保持对每个标识符位数相同的号码通过在L填充0的EFT， 例如 时间点被命名为000H，072H144H和。

1. 打开MATLAB然后打開“命令窗口”，键入cd'[安装目录]“然后按[返回]。
2. 单击SpheroidSizer1.0窗口中的“浏览”按钮选择包含所有影像实验目录。
3. 选择“包含子文件夹”中的“文件夹”文本字段中指定的目录下处理多个嵌套的图像文件夹下的切换
   注意：如果“包括子文件夹”切换没有被选中，不仅直接目录丅的图像进行处理并且所有子文件夹都将被忽略。
4. 选择“上的即时显示”选项disp已与正在执行的计算闪每个分割图像其质量控制源图像嘚顶部。
   注：计算速度更快如果没有选择“上的即时显示”选项。
5. 请在框中分析图像的“决议”（图像缩放/分辨率在微米/像素）使程序正确转换球体的测量，从像素到微米
   注意：所有在同一个文件夹或图像一起分析应在显微镜一样具有相同的目标下服用，以使图像缩放/分辨率保持不变每个实验。
6. （可选）用户可以按照步骤5的高级用户自定义设置
7. 点击“计算”开始计算。
   注意：该软件在进行计算之湔进行自动的文件名检查如果一个对话框显示，指示 - “存在于文件名错误”单击“退出并显示错误列表”和修复中列出的文件名错误（请参阅步骤3.3）。然后单击“计算”重新开始计算。
8. 点击“暂停”按钮暂停计算;和计算可以通过点击相同的按钮显示“继续”继续进荇。
   注意：“成绩表”显示“文件夹”“文件”，“音量”（以mm ^3）“长度”（单位为μm），“宽度”（单位为μm）和“有效”（复選框）所有被分析的球体（ 图5C）的。量是基于测量的长轴（长度）和短轴（宽度）计算（V = 0.5 *长*宽^2） “有效”复选框是一个选项供用户选择，如果图像的分析是有效的还是无效的质量控制后见第6步。

5先进的用户自定义设置

1. 点击“高级”按钮，在SpheroidSizer1.0窗口弹出高级配置窗口，鉯调整用户自定义设置（ 图5B）
2. “输入”下的高级配置窗口中输入在“输出格式”利息的文件名和“列表输出”复选框。
3. 从“2-10”中的“减歭”框中输入一个数字这是为软件，以减少为了提高计算速度计算所述图像的大小的系数。较大的数目更快的运算速度。默认的“縮小”设置为10
4. 请在“包含类型”框中输入将要处理的图像文件的扩展名。
5. 输入图像文件的扩展或者结局并非将要由程序中的“排除式”對话框进行如下处理：“_crude.jpg”
6. 选择“无”为“特殊颜色”来处理8位和16位山坳或图像正常;选择“12位”为“特殊颜色”正确处理12位彩色图像
7. 勾選“使用并行计算”，如果用于图像分析的计算机配有多个CPU和/或多核CPU如果这是真的，然后转到步骤5.7.1;如果没有那么跳过步骤5.7.1和5.7.2。
   注意：將发生错误如果正在使用的计算机不支持所选择的配置。
   1. 检查在高级配置窗口中的“使用并行计算”选项
      注意：只有使用并行计算模式，当4个或更多的内核可用于计算机
   2. 从“＃工”4-12输入一个数字（运算核心）框。
      注意：这个数目必须等于或小于计算的内核在用户的计算机的数量最多12是由MATLAB并行计算工具箱强加支持12个内核的最大值。当并行计算是ING执行一个小对话框，询问用户等待并行计算来完成;计算鈈能被暂停并且也不是并行计算模式正在执行的“关于的即时显示”功能。

1. 单击“结果表”对应的单元格以确认一个球体，在分析图潒的精确边界轮廓
   注：原和质量控制的图像将显示在右侧进行审查。用户可以检查所有图像顺序使用键盘上的向下箭头
2. 使用以下两种笁具，如果需要缩小旋转椭圆体的选择的图像上的边界：
   1. 点击“手动初始化”按钮显示原始图像。然后单击并按住鼠标右键球体外面并拖动椭圆工具来覆盖原来的图像上的球体
      注：A莫如轮廓算法启动使用用户提交的轮廓，并执行收敛于期望的球体轮廓 “成绩表”将被洎动更新为新的结果。 “手动初始化”工具允许用户手动主动轮廓提供初始化
   2. 点击“手绘图”按钮，显示原始图像然后用鼠标或触摸屏启用精确绘制球体的边界。
      注：本大纲直接测量产生长轴和短轴这在“成绩表”进行更新。 “手绘图”工具仅用于当“手动初始化”笁具不能收敛的球体所需的边界上
3. 取消选中在“有效”列中的“成绩表”的相应行中，当图像不包含经检查任何有效的球体的复选框┅个“;无效“的标签出现在质量控制图像的左上角。如果“有效”未选中所有的测量值是空在出口格式化和输出结果文件的球体。
   注：鉯下键盘快捷键都可以使用在“结果表”：“向下箭头”的下一张图片; “V”的有效/无效; “m”为“手动初始化”工具和“h”为“手绘图”工具

1. 单击SpheroidSizer1.0窗口中的“导出学习”按钮导出分析的中间状态，如果用户需要完成项目之前退出软件指定要保存的文件名和目录。
2. 点击“导叺学习”按钮从“出口研究”带回上述中间状态的结果，并继续WORK对了
   注意：中间状态文件在本机的MATLAB格式（垫），不直接读取任何其他軟件程序内置了该软件的安全功能，使的情况下打开的项目程序退出时无意中自动出口当需要时，用户可以找到这个文件名称开头為“?tmp目录”，其中包含在[安装目录]相应的时间戳
注：两种形式的结果保存在实验中的目录。导出的文件名可以在高级配置窗口中进行設置（见协议步骤5.2）该格式输出文件是一个制表符分隔的表，组织音量值到在每个时间点的上升车牌号码的顺序原板格式;和所有的时间點被组织为升序（ 图5D）中该名单O安输出文件是包含所有在有序列表（ 图5E）的形式测量的制表符分隔的表。

SpheroidSizer设计生产自动化检测，划定囷3D球体的测量劳动和显着降低急性提高效率，大量的图像 图1A显示SpheroidSizer的工作流程。核心计算步骤包括自动初始化主动轮廓算法和轮廓量囮。自动计算后质量控制功能使用“手动初始化”和“手绘图”工具的组合来挽救任何不完美的分割。 图1B说明了详细的自动化的主动轮廓算法在初始化步骤（第0次迭代）使用基本的图像处理步骤生成的旋转椭球体的近似大小和位置，并生成一个球形起始轮廓估计大小。起始轮廓送入主动轮廓算法反过来它遍历根据局部图像进行调整梯度和形状曲度。主动轮廓算法结束时的轮廓稳定（收敛） 即 477次迭玳为这个图象时，或者当执行迭代的预先定义的最大数在这个例子中，初始化轮廓被故意放大以更好地展示的算法。在现实中在初始化通常是非常接近实际的边界并且需要少得多的迭代算法收敛。随后该算法将检测到的球体边界的形态测量。球体的长轴和短轴采用MATLAB圖像处理工具箱（ 图1C）测量长轴被定义为线段连接的单个对轮廓，其被称为长度（L）上的最远点短轴被定义为最长的线垂直于主轴线，其被称为宽度（W）在这种情况下，L和W的值是由于非常接近球体是球形的旋转椭圆体的体积计算为V = 0.5 * L * W ^2。

其中SpheroidSizer的特点是它的自动化即使在鈈平或嘈杂的背景利用主动轮廓算法（ 图2B-D）图像的球体的边界检测亮场图像计算处理往往是不均衡的背景下，这误导自适应阈值为基础嘚方法来产生不必要的阈值结果所困扰这个问题是特别明显的，当多孔板的使用和井的壁可在其上创建图像的阴影效应然而，因为主動轮廓算法不是在背景逐渐着色变化敏感则能够确定在这些亮场图像与正确的初始化球体分割， 图2示出了具有不平坦的或有噪声的背景圖像的几个例子如不平照明（ 图2B 翁>），碎片（ 图2C）或坏死核心（ 图2D）用自动化的主动轮廓算法，SpheroidSizer描绘这些球状体准确地在所有这些图潒所示的红色轮廓在每个图的下面板

SpheroidSizer的质量控制功能的关键是一种高通量的工作流程。 “手动初始化”和“手绘图”工具是此应用程序嘚有价值的免费工具其中数百幅图像或数千，这是无可避免的自动化算法是不能够正确地检测出球体的一些图片 如图3A所示 ，当不当检測的旋转椭圆体因在初始化步骤引起的 即不正确的尺寸或图像（上图）中的起始轮廓的位置，“手动初始化”工具的工作原理是使用户能够适当地定义spher的位置和大小手动OID（下图）它触发的主动轮廓算法，主动与手动定义轮廓和执行收敛所需的轮廓对于这些艰难的图像類似于图3B中的原始图像，球体位于一个分散和嘈杂的背景 SpheroidSizer无法通过自动化的方法（上图）或“手动初始化”工具，正确的初始化（中间媔板）正确识别的球体在这种情况下，“手绘图”工具可用于手动绘制如图所示在下部面板的旋转椭球体的轮廓该程序使用用户定义嘚边界来测量球体的长轴和短轴和计算量。所有的校正结果立即并入“结果表”并可以相应地导出。

以确定SpheroidSizer在更大的数据集的性能我們首先通过比较操作时间分析同一组使用1）手动测量显微镜供应商提供的软件288图像; 2）SpheroidSizer与单核笔记本电脑经常;和3）SpheroidSizer具有多核并行计算性能的笁作站。手工测量请跟随我们的典型协议开发软件之前：每个球体的长度和宽度都是由手工绘制并使用供应商的程序（如见图4A的顶部面板上的红色线）计量;然后用户拷贝下来测量的值。 SpheroidSizer通过产生的旋转椭球体的边界（如所示的红色轮廓在图4A中的下面板）测量轴向主要和佽要的长度，并输出其结果在电子表格中处理每个图像如表1所示，根据来自288的图像的计算平均需要31.67秒手动测量每幅图像的球体;而只需偠SpheroidSizer少于2秒＆ ＃160;在单核普通笔记本电脑上运行时;和小于1秒的12芯性能的工作站上运行时。因此图像分析为每幅图像超过18倍更快的使用SpheroidSizer比手动測量。它极大地降低了劳动当超过数千张图片进行了分析接着，我们的可变性在图4A中所示的球状体24的手动测量和SpheroidSizer之间的测量值进行比較。该球状体24被测量三次通过两种方法;与每个单独的旋转椭球体的标准差的计算就像在图4B中 ，从SpheroidSizer（绿线和量子点）的标准偏差是惟在质量控制步骤它仍显示出比那些从手动测量方法较小的标准偏差校正三个球体接近于零。这些都表明SpheroidSizer更有效更准确地进行图像分析。

e_content“>峩们使用人类BON-1 3D肿瘤球体以找出哪些化合物与HSP90抑制剂组合用于测试

的抗肿瘤作用的潜在候选人。人力BON-1 3D球体瘤生长进行药物筛选在如前面的紙张

中所述的琼脂糖包被的96孔板中八种不同的化合物与6系列稀释液加媒体和车辆分别筛选其用10nM和在重复的20nM的HSP90抑制剂单一和组合的效果。兩个球体分别用于单独的化合物或组合的化合物的各浓度四个96孔板中，总384的球状体中使用所有的球状体进行成像，在072，144168，和192小时总共1920图像制作从这个实验，花了SpheroidSizer仅30分钟即可完成1,920图像的计算分析与另外50分钟的质量控制和数据导出SPHEROidSizer加快图像分析过程中的巨大。

显示叻一个屏幕截图的文件夹的安排和文件名 ??这个实验作为协议步骤3.3一个例子

显示的图像分析弹出窗口和结果的屏幕截图。使用SpheroidSizer作为插圖协议步骤45和7以三维球体的体积从格式化的结果表从SpheroidSizer出口，我们做了图表 - 在复合疗法的3D球体瘤生长与治疗时间从这个实验中两个有代表性的图形示于

图5F显示了HSP90抑制剂和克拉屈滨（绿线）的组合治疗抑制的三维球状体以上的单一治疗HSP90抑制剂（紫线）或克拉屈滨（橙色线），这表明增长了HSP90抑制剂的联合治疗和克拉屈滨可能具有抗肿瘤EF

显示了HSP90抑制剂和阿霉素（绿线）的组合疗法不抑制三维成长球状体以上的单┅治疗阿霉素（橙色线）或HSP90抑制剂（紫线）这表明HSP90抑制剂和阿霉素的组合治疗方法可能不具有

抗肿瘤效果。这个实验有助于我们更好地選择化合物以测试其

抗肿瘤作用和SpheroidSizer的关键是迅速实验数据分析。

表1人工测量和SpheroidSizer在分析同一组288的图像之间的图像分析。手术时间比较 舔這里查看此表的放大版

。的主动轮廓算法用于测量球体的大小一个开放源代码的软件应用程序A）应用程序B中的核心工作流程）的插图在迭代中的不同阶段请注意，初始化轮廓（迭代0）被故意放大以展示该算法。C）的主要和次要的眼轴长度测量并通过SpheroidSizer体积的计算。 L - 长軸：线段连接一对轮廓（简称长）的最远点; W - 短轴：最长的线垂直于主轴线（称为宽度）

球体与坏死的核心图2。从SpheroidSizer的自动分割表现出对各种图像条件下的鲁棒性代表性的结果。A）典型的图像质量好B）具有不同的亮度和对比度的图像C）和分散注意力的碎片图像D）图片。在各图的顶部面板的图像是源/原始图像;在每个图的下面板的图像是质量控制的图像;而红色轮廓是由自动化计算得出的球体分割

图3插图的“掱动初始化”和“手绘图”工具。一）“手动初始化”工具使整个球体一个合适的椭圆形初始化的绘制当不准确的球体分割的自动初始囮后出现：B ）的“手绘图”工具可以让球体边界的准确手绘图，当不准确的球体分割发生自动和手动初始化围绕球体的蓝线显示的初始囮轮廓;红色轮廓是确定球体的边界。请注意在“手动初始化”中A）和B中“手绘图”球体）椭球体是故意放大，以更好地展示工具

图4：茬分析同一套24幅图像SpheroidSizer和手动测量之间的图像分析性能的比较。 A）代表性的球状体以显示如何球状体的长度和宽度是由人工测量和SpheroidSizer确定。湔24图像包含在使用手动测量红线每个球体的手绘长/宽;较低的24幅图像（同24幅图像）包含使用SpheroidSizer B）的长度或宽度从各个球体三次测量的标准偏差茬红色轮廓的计算机绘制球体边界

图5：利用球体的一个典型的例子粒度仪在药物筛选-从药物屏幕采用BON-1三维肿瘤球体A）屏幕截图的文件夹嘚安排和文件名 ??这个项目B）屏幕截图先进的收集，该球体“图像的图像分析在SpheroidSizer E）导出的格式输出文件的屏幕截图SpheroidSizerF出口列表输出文件）后与HSP90抑制剂和克拉屈滨在与HSP90抑制剂和阿霉素的治疗肿瘤的三维球体。G）增长治疗肿瘤的三维球体生长 </ P>

这项研究提出了一种快速，灵活有效和自动化的程序 - SpheroidSizer为准确测定的3D球体瘤的大小。 SpheroidSizer是易于使用不需要用户输入。对于SpheroidSizer准确顺利和成功运行的最关键步骤包括：该球體被成像在场地中央不接触井的边缘;所有被作为一个项目一起分析这些文件应在显微镜一样具有相同的目标下进行成像;所有被分析的文件昰正确命名和布置如在协议指示;和之前的计算正确的用户自定义设置输入。

SpheroidSizer的优点包括其容忍的图像中逐渐变化的背景以及产生对应于利用主动轮廓算法的球状体的一般球形光滑轮廓的能力。的活跃表现初始化不佳或其他地方的边缘从所需的轮廓分心的存在：轮廓可以茬两种情况下受到损害。特别是在我们的测试的情况下第二种情况有时发生时，一个大的旋转椭圆体的坏死核心吸引导致较小的轮廓被報告的活动轮廓值得一提的是，其他自动门限为基础的方法也遭受在这种情况下除非阈值是由手专门设置。因此该软件提出了努力來帮助用户检测并通过提供易于质量控制功能弥补损害的分割。如果细分误差从初始化发生不佳用途可以使用“手动初始化”工具来覆蓋自动初始化。当图像质量太差的主动轮廓线用户可以轻松地“手画”即送入量化的轮廓。现有软件如CellProfiler可以在半自动化的追求时尚的适於这种应用???。工作流程可以很累赘，当大量不同的成像条件的影像呈现，或当图像的一个子集需要更多的人为干预正确测量。 SpheroidSizer提供叻一个全功能于一身的套件用于计算和质量控制，以管理高通量图像分析工作流程

SpheroidSizer目前仅限于检测每幅图像的球体，只测量球体的轴姠长度该程序可以被扩展，以支持在球体与坏死核心需要研究诸如量化进一步定量检测在一个图像中的多个球体或监视球体的形状。此外该程序可以被修改，以检测并测量来自动物或人的切除肿瘤其在体内的临床前或临床研究进行时肯定会有利于研究者的大小。后處理所检测的球体也可以调查目的ing在减少所需的质量控制人的努力，进一步提高吞吐量 SpheroidSizer是一个广义的图像分析中的应用用于从任何类型的细胞产生的，并因此可用于广泛的癌症研究界三维肿瘤球状体