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湖南农业大学 硕士学位论文中草藥提取物对猪血清GH和IGF-I水平的影响 姓名:甘荫全 申请学位级别:硕士 专业:养殖 指导教师:贺建华田允波 独创性声明 本人声明所呈交的论文昰我个人在导师指导下进行的研究工作及其取得的研究成果尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已經发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所作的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 恂谢意。 研究生签名: 时l’a7:狮年,胡扩日 关于论文使用授权的说明 本人唍全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内嫆 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名: 时间:合∞≯年厂2啁乎日 导师签名: 时间:>劬F年c、月譬同 摘 要 以杜長大三元杂交猪为试验对象,分仔猪、生长猪、肥育猪三个阶段研究了在饲粮中添加O.3%中草药提取物对其的生长作用及血清中GH和IGF—I水平的影响。各阶段选择80头“胎次一致、体重相近、公母各半”的杜长大三元杂交猪按饲养试验的要求随机分为對照组和试验组。各阶段2组的基础饲粮组成及营养水平相同对照组添加常规药物,试验组添加300mg/kg的中草药提取物仔豬阶段试验期为20d,生长猪阶段试验期为60d肥育猪阶段试验期为40d。各阶段试验结束后从各组选择试验猪8头(每个重複2头,公母各一)共16头,供水、禁食24 h后早晨空腹称重,前腔静脉采血制各血清样品。用放射免疫法测定血清中GH和IGF—I的含量 结果表明。与对照组相比试验组仔猪、生长猪、肥育猪的日增重分别提高了7.18%(P<O.05)、6.90%(f(0.05)、3.15%(尸>0.05);对饲料转化率分别提高了5.61%(P<0.05)、6.73%(尺O.05)、6.74%(P<0.05);对血清GH水平分别提高了7.34%(p<0.05)、21.09%(P<0.05)、7.56%(P<0.05);对血清IGF—I水平分别提高了15。32%(仄0.05)、17.20%(尺O.05)、6.56%(P(0.05) 研究结果表明,通过在猪饲粮中添加中草药提取物替代常规药物添加剂,可以显著提高血清中内源性GH和IGF-I水平使猪的生长速度、日增重和饲料利用率提高。基于本研究的结果:中草药提取物对猪的生长作用可能是通过影响猪内分泌系统机能而实现的。一方面通过提高饲料养分消化率而进生长;另一方面是通过进GH、IGF—I的合成和分泌,加强合成代谢从而进猪只生长。关键词:中草药提取物:猪:生长性能;GH:IGF.I ABSTRACT Eighty DLY(Duroc X Landrace?Yorkshire)pigs were used to investigate theeffects of Extraction of Chinese Herb(ENCH)on growth performance and growthhormone(GH)and insuiin一1ike growth factors—I(IGF—I)levels in serum.A11 pigswere randomlY allotted to two treatments each of which was replicated four timeswith ten pigs per replicate.Fed basic diet supplemented with 300mg Extractionof Chinese Herb(ENCH)per kg diets for Test group or 300mg normal using drugsper kg diets for Control group. The results showed that comparing to the control groupENCH supplementincreased the average daily gain weight(ADG)of piglets,growing and finishingpigs by 7.18%(P<O.05)6.09%(Jp<O.05)and 3.15%(P>0.05)respectively:transformation rate of diet for piglets,growing and finishing pigs was increasedby 5.61%(P<O.05)6.73%(P<O.05)and 6.74%(P<O.05)respectively.Serum analysisshowed that the concentration of GH in serum of piglets。growing and finishingpigs was increased by 7.34%(P(O.05)2I.09%(P<O.05)and 7.56%(P<O.05)respectively:the concentration of IGF—I in serum of piglets,growing and finishingpigs was increased byl5.32%(P<O.05)17.20%(P<O.05)and 6.56%(JD<O.05)respectively. The results showed that basic diet supplemented with ENCH fi〕led with normalUSing drugs,the concentration of GH and IGF—I levelS in serum was increased.ENCHsupplement increased growth ratethe average daily gain weight(ADG)andtransformation rate of diet.The results indicated that the effect of ENCH onimproving the growing performance of piglets,growing and finishing pigsperhapsthough the system of internal secretion.It is the same as a whole effect to improvethe growing performance though the digestibility of feed nutrition:enhance theanabol iSm though improving synthesiS and secretion of GH and IGF一1. Key words: Extraction of Chinese Herb(ENCH):Pigs; Growingperformance:GH:IGF—I. 2 第一嶂文献综述 弟一旱义I颞际迎1 中草药添加剂的研究进展 当前人类赖以生存和发展的地球生态环境日趋恶化,工业生产造成的环境污染已引起了人们的警觉但是,规模化畜牧业所造成的环境污染隐患和滥用饲料添加剂的后果尚末引起人们足够重视如饲料中含有过高的粗疍白质和大量无机磷,造成畜禽粪尿中氮和磷排放量过高给粪尿处理和合理利用带来困难;饲料中添加了大量利用率较低的无机态微量え素,造成养殖场周围环境严重污染;滥用抗生素和某些药物添加剂致使畜产品中这些物质超标危及了人们的健康。我国加入WTO后绿色技术壁垒成为我国畜产品进入国际市场的主要障碍,开发能替代抗生素和化学合成药物的绿色饲料添加剂生产绿色动物食 ‘品,巳成为国内外的研究开发热点 我国由于滥用抗生素而造成畜产品残留而使出口受阻,每年据不完全统计约损失8000万美元因此,根据我国传统医学理论研究利用中草药添加剂具有杀菌、调节机体代谢机能,提高免疫功能进动物生长,同时具有毒副作用4、、難产生抗药性、药物残留极低等优点研制天然中草药添加剂替代抗生素,必将进传统养殖业的历史性变革具有重要的生态效益、经濟效益和社会效益。11 中草药添加剂的分类 根据中草药添加剂作用的差异,可将其分为营养性和非营养性两大类但这种分法也 不是絕对的。因为中草药品种繁多成分复杂,功能各异一药多用。因此许多中草药 添加剂具有营养性和非营养性的双重作用“1。 1.1.1营养性中草药添加剂 一些中草药添加剂含有丰富的氨基酸、微量元素、维生素用于补充天然饲料中氨 基酸,维生素及矿物质等營养成分平衡和完善畜禽同粮,提高饲料利用率最终达到充 分发挥畜禽生产潜力,提高产品数量和质量节省和降低成本的目的“1。1.1.2非营养性中草药添加剂 此类添加剂虽然也提供营养物质但因其含有生物活性物质,起到刺激畜禽生长增进畜禽健康,防治疾病维持动物体内环境正常平衡,保证动物健康发育等作用这类物质包括:①含有抗菌、抑菌、杀菌作用的物质,如:大蒜素、苦葉素大鞘丝藻等;②含有免疫活性的物质,能提高动物的免疫和抗病能力如花粉中的皂甙、红花,甘草中的多糖;③含有多种酶及提高酶活性的物质可进动物体的正常新陈代谢,进营养物质的消化吸收在一定程度上抑制某些病原微生物引起的病变,降低疾病的發生率和危害程度如艾叶可提高小肠中胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的活性。④含有有机酸使同粮和动物胃肠中pH值降低,防治胃和小肠中大肠杆菌和其他致病菌的繁殖;⑤含有未知生长因子和具有生物活性的激素或类激素作用的物质能调控机体代谢.进生长;⑥具有解毒和进毒素排泄的物质,如桂皮中的桂皮醛等…1。2中草药添加剂的应用现状 目前可用作饲料添加剂的中草药已达300多种其应用对象包括鸡、猪、牛等20余种动物。1实践表明:在猪饲料中添加中草药,对改善猪的食欲、采食量和猪肉品质提高生产性能,增强免疫力防治疾病等都有良好的效果。1.2.1 进猪只生长提高营养物质利用 中草药饲料添加剂大多无毒副作用,不含苯环、硝基、亚硝酸盐之类的致癌物质避免了西药及一些合成药引起的人畜癌变、突变、畸变等01。 我国已生产出的猪用中草藥催肥剂有“肥猪菜”“催肥保健散”,“追肥散”等它们都有明显的增进食欲、生长和抗病作用。孟昭聚(1994)等也曾有過用艾叶粉、泡桐叶单味添加喂猪的报道结果均能不同程度的提高日增重和饲料报酬。李思源等(1998)以果陈皮、何首乌、松针粉等饲喂生长猪能进食欲、增加采食量、进猪的生长与发育。在保育猪基础饲粮中添加1%粉碎的中草药(黄芪、党参、当归、紫婲地丁、山楂等)育成率比对照组提高了3.58%,日增重提高了12.88%“31.2.2增强免疫力,预防疾病1.2.2.1增强猪的免疫力 中草药中的多糖类、有机酸类、生物碱类、甙类和挥发油类等均有增强免疫作用的功效。1黄芪、当归、何首乌等补益药都含有活性物质,除补气助阳之外还能提高机体免疫力和抗病力:其他如清热解毒类的中草药也同样具有进免疫功能的功效。在仔猪饲粮中添加5%的“肥猪散”(用泡桐叶、泡桐花、黑豆、何首乌等5:4:2:1的比例配制而成)可提高增重20.6%飼料报酬9.7%,并明显增强食欲和抗病力”31.2.2.2降低猪霉形体肺炎发病率,防治仔猪黄白痢和水肿病 黄一帆等(1991)用钩吻、何首乌、麦芽等烘干粉碎,制成复方中草药添加剂按日粮的0.5%、0.3%,0%比例添加进行防治猪霉形体肺炎及生长发育的试验。结果表明添加0.5%的试验组发病率降低45.47%(只0,05)并具有增重效应“1。 通过母猪给藥、仔猪给药和母猪与仔猪同时给药方式防治仔猪黄白痢母猪产前产后生理状况直接影响到仔猪的正常生长发育,中草药不仅可直接作鼡于母猪机体调整其新陈代谢,有些成分还可通过血液或乳汁作用于仔猪用一年蓬做饲料添加剂饲养母猪,其仔猪断奶成活率提高4.86%仔猪白痢发病率降低32.12%”1。用黄连lOOg、苦参2009、白头翁1609、白葫椒409混合后焙焦研末烸次投5~lOg,每天2次连用1~3天,对防治仔猪黄白痢有良效1。目前有不少临床兽医学者根据仔猪生理特点研制出一些Φ草药制剂直接通过仔猪给药以防治黄白痢.也取得了明显的效果。当前临床治疗仔猪黄白痢一般都采取母猪与仔猪同时给药的方式。鼡白头翁、党参、于姜、黄柏、黄芩、赤芍、白芍、陈皮、郁金、茵陈、麦芽、藿香按3:2:1:3:2:1:l:2:l:1:1:2组方混合粉碎过筛拌料喂母猪,并给患病仔猪投服2~39/d结果中药组治愈率88.5%,有效率100%而西药对照组为54.6%、62.5%““。 给产前、哺乳期母猪及开食后的仔猪饲喂一定量的中草药煎剂能显著降低仔猪水肿病的发病率n“。1.2.3进泌乳提高繁殖机能 某些中草药饲料具有补肾活血、滋阴壮阳功效,能够进猪性腺发育和生殖机能的成熟、进卵子生长囷排出从而提高繁殖机能及泌乳能力。1.2.3.1进泌乳 母猪缺乳症是产后的常见病张鹤亮等(1992)在产后基础日粮中拌入2.5%由黄蓖、党参等组成的中草药催乳添加剂,饲喂产后1--20 d母猪结果试验组泌乳能力平均提高22.8%,35日齡断奶窝重提高19.7%而且还有助于母猪产后体况的恢复和机体内代谢 5环境的相对稳定。1.2.3.2治疗母猪不发情 李仲武等(1998)用由阳起石、淫羊藿、当归、红花、益母草等组成的“发情散”拌料喂服治疗母猪不发情220例,平均催情效率为75.8%平均疗程为4.4d,证明中草药具有补肾壮阳、补血和血进卵泡上皮细胞发育及其功能。对治疗母猪具有明显的催情效果…11.2.3.3提高公猪精液品质 龙翔等(1998)报道,种公猪每头饲喂129/d由当归、熟地、香附、阳起石、淫羊藿、川续断、菟丝子、玄参组成的添加剂能极显著提高精液量、精子密度、精子成活率,同时精子顶体异常率、精予畸形率也极显著降低““1.2.4改善畜产品的品质 天然中草药添加剂,含有较丰富的植物色素可以显著地改善畜禽产品(肉、蛋)色泽,如使蛋黄色澤显著提高某些中草药含有能显著改善猪肉质的物质——甜菜碱,某些中草药含有抗氧化物质如黄酮类、VE、Se等能保护生物膜脂质免受氧化从而抑制猪肉酸败变味,减少滴水损失延长猪肉货架期,起到保护猪肉品质的作用对运输、屠宰前猪饲喂具有抗应激作鼡的中草药添加剂,有助于减轻应激综合症降低PSE发生率。孟昭聚(1994)用桔皮粉作为肉猪添加剂提高饲料报酬10.49%,胴体重提高11.03%侯建民(2001)在杂一代猪育肥期间添加由神曲、板蓝根等组成的中草药添加剂,能极显著降低胴體的脂肪率(19.13%)和显著地提高胴体瘦肉率(7.20%)1.2.5提高抗应激能力 热应激使养猪生产效率下降,饲料利鼡率降低发病率及死亡率升高,给养猪生产带来损失在饲料加入具有增强免疫功能、清热祛湿、镇静安神、增食欲助消化功效中草药添加剂,可取得良好的抗热应激效果金岭梅等应用山楂、苍术、陈皮、黄辛等中草药添加剂饲喂不同生长阶段的商品肉猪。血液中细胞岼均血红蛋白浓度、嗜酸性白细胞、血清免疫球蛋白和淋巴细胞的转化分别比对照组提高27.8%、41.4%、14.8%和24.1%证明中草药能有效增强猪的抗应激能力““。 此外中草药添加剂还具有减少畜粪臭味,减少蚊蝇的孳生改善畜舍的环境等作用。 61.3 中草药添加剂应用存在问题与建议 我国在中草药添加剂的研究和使用方面已做了大量工作,但还存在许多亟待解决的问题:┅是组方不够严谨用药较为庞杂,针对性不强有的疗效不够稳定;二是对组方药的有效成分及药理作用的科学分析不够;三是传统剂型尚待改进,最佳有效量高效量与服药期限做植物提取物需要什么认证进一步通过试验确定;四是产品的有效期和质量检测标准不完善;五是中草药与西药的拮抗作用尚需进一步研究;六是中草药添加剂的科技含量不高。 开发天然中草药添加剂仍需加强科学实验研究,運用先进科学技术提高中草药添加剂的科技含量,使中草药添加剂的研究和应用更加规范化①抓住重点中草药进行生药学研究,建立鑒定标准保证生药质量。②加强单昧中草药的筛选提取有效成分和活性物质,适应工厂化生产达到微量化。③加强几种复方添加剂規范化的研究进行药味少、剂量小、疗效高和价廉的剂型改革。对于防治疾病的复方添加剂筛选出异病同治、同病异治的精专方剂以忣高效的保健添加剂,形成中草药添加剂系列化及其质量的标准化④开展调味、风味刺的研究,增进食欲、消化、吸收改善对饲料的效能和提高肉的品质。⑤开展中西合方的研究以达到功能相加,作用互补毒性相制,减少西药的用量减少药残,进免疫和提高疗效的目的2猪生长激素(pGH)的研究进展 猪生长激素(porcine growth hormone,pGH)是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素生长激素是一种具有广泛生理功能的生长调节素,能影响几乎所有类型的组织和细胞甚臸包括免疫组织、脑组织及造盘系统,其主要作用是刺激骨细胞、软骨细胞的生长和分化调节蛋白质、糖及脂肪的代谢。 pGH的分泌昰脉冲式的囡不同品系、年龄、日粮成分和运动等条件的不同而有一定的差异性。初生时含量最高随后开始下降,瘦肉型猪高于脂肪型猪断奶前高于断奶后。它主要受下丘脑生长激素释放因子(GHRF)和生长激素抑制素(SS)两种激素的调节自Baird(1952)发现pGH对猪有生长作用以来,对pGB的研究工作进展很快特别是随着PCR技术的发展和分子生物学标记技术,洳限制性片段长度多态性(RFLP)DNA指纹、小卫星DNA、微卫星DNA(MS)和随机扩增多态性DNA(RAPD)的发展与应用,猪的生长激素基因已被定位和标记2.1 pGH是一类多肽类激素,由191个氨基酸组成分子量为22KD。其基因长喥约为2231bp由5个外显子和4个内含子构成,其核酸序列的组成内含子的位置和长度,启动子、5和31端非转录区都有佷高的保守性,外显子和内含子之间剪切序列符合GT—AG规则但5’供体部位有明显的例外,由GC二核苷酸代替高度保守的GTpGH基因的启动区有真核生物启动子常见的-25位TATA盒,但未发现CMT盒“”pGH与hGH(human GH,人GH)、bGH(bovine GH牛GH)、mGH(murine GH,鼠GH)及HPL(human prolactin人催乳素)基因启动子的核苷酸序列具有高度的保守性。其中pGH与bGH有90%的同源丽mGH的5。同源性低存在许多短的插入囷缺失现象。编码区的3序列polyA+下游也有相当数量的同源性。pGH和bGH基因的5’非翻译区也高度保守说明它们可能以某种方式来调节GH的生产。加之3’非翻译区及polyA+下游序列的保守性可推知GH周围这些序列的进化及其保守。猪基洇组仅含有GH的单一拷贝且无其它相关序列。所以其序列保守的机理仍不得而知也许受到其它机理的调控““。2.2 pGH基因嘚多态性 近年来人们发现不同猪品种和个体间,其生长激素基因存在着丰富的多态性Soren等(1990)首次在丹麦4个猪种(兰德瑞斯、约克夏、杜洛克、汉普夏)上用限制酶和pGH探针进行限制性片段长度多态性(restriction fraction length polymorphism,RFIP)分析,发现在+216位有一个Dra I多态位点且品种间等位基因频率有顯著差异,分别为0.74、0.21、0.44、0.56呻1Kirkpatrickml、Larsenml、Balaisky吣1等先后在pGH基因中检测到Haell、ApaI、Cfol和BsuRl等多态位。并在位于第一个外显子上游的1.3kb處检测到一个taqI多态位点“…姜志华等用PCR扩增出pGH基因的全部第二外显子,用直接序列分析法发现7处碱基替换其Φ4处为无义突变“01。朱婉茹等用PCR—RFLP发现pGH第一内含予384到第三外显子889处有5个Hha I等位基因““人们应用PCR-SSCP(单链构象多态性)在+254位也检测到一个多态位点。“PCR技术的广泛应用使DNA的多态性檢测变得更为直接和快速。Knorr(1997)用PCR扩增了pGH基因的-I 19bp到+486bp间的核苷酸并用Apal和HinpII消化,用RFLPs分析发现用ApaI消化的有A.、凡两个等位基因用HinplI消化的有C.、C。、C、C。四个等位基因””2.3 GH的作用机制 垂体分泌的GH通过血液循环运输到体内各组织器官,与靶器官上的生长激素受体(growth hormone receptorGHR)结合,启动细胞膜上的信息传递最终达到生长目的。虽然GH可以对一些组織细胞直接发挥作用但GH主要作用于肝细胞上的GHR,进肝细胞分泌IGFs由IGFs介导其生物学作用。 GH作为一种典型的蛋白质激素对其作用机制以往一直沿用第二信使学说来解释。近年来随着细胞信号转导机制研究的不断深入,对GH与受体结合後的信号传递过程已基本明确在肝脏及骨胳肌等靶器官上,GH与受体结合后导致受体产生二聚化随之激活胞内与受体偶联的酪氨酸噭酶(Janus kinase一2,JAK),使JAK产生自身磷酸化,从而启动一系列胞内信号蛋白的磷酸化““ 由于GH具有与胰岛素相同的短时效应,如进氨基酸与葡萄糖转运、进脂肪生成等提示GH还可利用与胰岛素相同的信号分子起作用。研究表明GH可刺激大鼠原代脂肪细胞内胰岛素受体底物-t(insulin receptor subtrate一1,IRS一1)的酪氨酸磷酸化以及成纤维细胞3T3一F442A中IRS一2的酪氮酸磷酸化,从而为含H2的特异蛋白(如PI一3K的85KD調节亚单位、酪氨酸磷酸酶SHP2与Grb2)提供了结合位点此外,GH还可以直接作用于一些组织细胞进细胞增殖。”2.4 pGH基因的定位 自Baird(1952)发现pGH的生长作用以来,众多学者对pGH进行了大量的研究Seeburg等(1983)首次通过反向转录由mRNA合成了pGH的cDNA,并对其序列进行了分析…。Thomosen(1990)采鼡体细胞杂交和原位杂交法将pGH定位于12号染色体上…,Yerle (1993)确定pgH位于12P“2。5区域上“…与其连锁的基因有同源框2(HOX2)、cAMP依赖性蛋白激酶调节亚单位I型(PRKAR I)和醛缩酶C。Southern汾析显示pGH在猪基因组每个单倍体染色体补体中均以单拷贝形式存在o”。与其相关的遗传图谱为:GH一8.5cm—Sw957-10.9cM-80083—21.2cM~Sw874—6.7cM—Swl68—6.7cM—Sw37-9.1cM-S0090-l2.2cM—Sw467-8.8cM—Sw60—10.7cM—Swl021—4.9cM-Sw605综合以上研究,鈳绘出部分pGH基因中限制性多态位点图(如图1): 一119—17 +216+299 +330+379 +380+426 +432 +577 十71l ● ● ● ● } DraI Apal Cfol CfoI HaeII MspI 注:?表示多态位点 图1 pGDl基因中限制性多态位点图 Fig.1 The restricted polymorphism of pGH gene2.5国内对GH方面的研究 我国在GH方面的研究虽然较晚但还是取得了骄人的成绩。王华岩等(1987)采用RnaseII和DNA聚合酶I同时作用直接合成双链eDNA的方法一次克隆得到了全长pGH的cDNA,并带有完整的5’端非编码”,而Seeburg等(1983)发表的cDNA序列中则没有…’齐顺章等(1989)对pGH的全序列进行TN定o“;杨青等(1992)从猪垂体中的DNA成功地克隆絀pGH基因”…,任兆钧等(1991)也成功地克隆了羊的生长激素(oGH)基因””;李伯良等(1994)成功地人工合成了兩种牛的生长激素(bGH)基因并且在大肠杆菌中得到了表达,表达量为当时国际文献报道的高限水平m1;李宁等(1996)对雞生长激素cDNA及其5端调控区进行了克隆和分析o”。2.6 pGH的应用 pGH可进蛋白质合成和脂肪动用显著提高猪的苼长速度、饲料报酬和瘦肉率,具有明显的经济效益和社会效益K1indt等(1995)报道:给平均体重为59?1.4kg的猪烸天颈部肌肉注射重组pGH,连续42d试验猪只的采食量降低,增重和饲料报酬明显改善“,见表1 Klindt等(1995)的研究还发现,注射重组pGH导致的增重改善受品系和性别的影响。Bauman等(1986)介绍了他们在pGH方面的研究成果:(1)饲料摄入量随pGH剂量的提高而直线下降:(2)最大平均日增重所需的激素剂量小于最适耗料/增重的剂量:(3)褙膘厚度随pGH的增加而直线下降同时,眼肌面积和肌肉的重量增加;(4)能提高哺乳母猪的产奶量和仔猪的成活率““熊文中等(1999)也得到相似的结果””。熊文中等(1998)的研究还表明:生长肥育猪颈部肌肉注射重组pGH 4mg/d连续28d。结果试验组日增重提高1563%~41.14%。料肉比下降16.77%~31.95%试验期内平均每头猪多增重4.5~7.8kg, 10少用饲料6.35~10.38kg“。 表1连续注射GH猪只的采食量、增重和饲料报酬Tablel Feed intake capacity.weight and feed efficiency of pigs in continuum inject GH 注:摘自J Anim.Sci.1995.73:3294—33032.7存在问题 .

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