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台子 山黑镇那里有养猪场吗？想看看养猪场的模式。新兴镇有气温有好多度是什么原因竹子长得特别快？安吉
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出门在外也不愁中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究--《中国农业科学院》2008年博士论文
中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究
【摘要】：
猪流感(Swine influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的一种急性高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病,具有重要的兽医和人类公共卫生学意义。
为了有效地配合SIV流行病学调查,本研究首先根据SIV的M、HA、NA基因设计了6对引物,分别用于SIV的诊断及H1、H3、H9、N1和N2亚型SIV的快速鉴定。所建立的SIV型和亚型RT-PCR检测方法有很好的特异性,可以检测到102~103EID50的SIV,并在初步的临床样品检测中得到了应用。
为了了解我国SI的流行情况,2005年～2007年,我们先后在黑龙江、河南、山东、浙江、安徽、江西、北京、广东、广西9个省份的不同猪场,进行了600份样品的采集,分离到22株SIV,其中H1N1亚型1株、H3N2亚型4株、H9N2亚型4株。为了检测这9株SIV对哺乳动物的致病性以及在哺乳动物群体内的水平传播能力,我们进行了小鼠致病性试验,试验结果表明:这9株SIV对小鼠的致病力较弱,不引起明显的临床症状,不具备在小鼠之间水平传播的能力,但在感染后的第4天和第8天可以在小鼠的肺组织中分离到病毒。
古典H1N1亚型SIV和禽源H1N1亚型SIV广泛流行于世界范围内的猪群中。关于人源H1N1亚型SIV,世界范围内报道较少。2006年我们在广东省的一猪场分离到1株人源H1N1亚型SIV,并首次在中国进行相关报道。结合华中农业大学最近公布的2株人源H1N1亚型SIV的全基因序列,我们对这3株病毒进行了相关的遗传演化分析。3株SIV的8个基因片段核苷酸同源性分析结果表明,A/swine/Guangdong/96/06与2000年左右的人流感病毒有较高的同源性,8个基因片段核苷酸同源率在98.8~99.6%之间;A/swine/Tianjin/01/04和A/swine/Henan/01/06与1986年左右的人流感病毒有较高的同源性,8个基因片段核苷酸同源率在98.2~100%之间。3株SIV的遗传演化分析结果及HA、NA氨基酸分析结果也均表明,这3株SIV都属于人源谱系的SIV,基本保留了人流感病毒的特性,分别起源于2000年左右的人流感病毒和1986年左右的人流感病毒。这些流感病毒的存在,特别是古老的人流感病毒在猪体内的存在,对我国流感病毒的生态分布和遗传演化研究具有非常重要的意义。
猪具有同时感染禽流感病毒和人流感病毒的能力,被认为是新的流感病毒产生的中间宿主和基因混合器。本研究进行了年44株H3N2亚型SIV的遗传演化分析,第一次全面总结和报道了完全人源的、二源重组的和三源重组的H3N2亚型SIV在我国猪群的相互存在。早在1970第一株完全人源的H3N2亚型SIV(Hong Kong/68-like)从台湾省的猪群中分离到,此后Victoria/75-like,Syndney/97-like,New York/99-like和Moscow/99-like的SIV陆续从我国的猪群中分离到;在1980年左右,2株三源重组的H3N2亚型SIV在我国出现,并已经被学者们报道;最近,二源重组的H3N2亚型SIV(HA和NA基因来自人流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因来自禽流感病毒)和三源重组的H3N2亚型SIV(HA和NA基因来自人流感病毒,NP基因来自古典的H1N1亚型SIV,PB2、PB1、PA、M和NS基因来自禽流感病毒)在我国猪群中被分离到。这些SIV的存在,特别是重组的SIV的存在,充分地证实了猪确实能作为流感病毒产生的“混合器”,具有重要的人类公共卫生意义,进一步强调了加强我国SIV监控的重要性。
H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽,而且也可以感染猪和人。2007年3月,正值猪呼吸与繁殖综合征(PRRS)发病期间,我们在广西省多个猪场共采集50份左右临床样品,同时进行了PRRSV和SIV的RT-PCR检测,其中有4份样品PRRSV和SIV的检测结果都为阳性,并分离出相应的4株PRRSV和SIV,相应的SIV代表毒株命名为A/swine/Guangxi/7/07(H9N2)。序列分析表明,A/swine/Guangxi/7/07的8个基因片段与A/Pigeon/Nanchang/2-0641/00和A/Wild Duck/Nanchang/2-0480/00有较高的同源性,可能起源于A/Duck/Hong Kong/Y280/97-like H9N2亚型禽流感病毒。为了进一步了解我国禽源H9N2亚型SIV的遗传演化规律,我们从GenBank中调取了另外24株H9N2亚型SIV进行了相关的研究。遗传演化分析表明,这25株禽源H9N2亚型SIV可以划分10个基因型,其中B型的5株病毒起源于A/Duck/Hong Kong/Y280/97,C型的5株病毒起源于A/chicken/Shanghai/F/98,其余的15株存在复杂的重组现象。本研究使我们对我国禽源H9N2亚型SIV的分子进化有了全新的理解,为我国动物流感疫情监测及预防控制提供理论依据。
为全面了解SI在我国的流行情况,我们在进行SIV分离鉴定的同时,也开展了SI的血清学调查。年,我们先后在9个省份的不同猪场,进行了717份血清样品的采集。通过血凝抑制试验,我们进行人源H1、人源H3、禽源H5、禽源H9亚型SIV抗体的检测,阳性率分别为0~20.8%、29.6~97.1%、1.1~13.2%、6.5~31.6%,其中以人源H3亚型阳性率最高,说明人源H3亚型SIV可能在我国猪群中相当普遍;人源H1亚型SIV的抗体呈现较低的阳性率,表明人源H1亚型SIV可能零星感染中国的猪群;另外,我们也检测到了猪群中禽源H5和H9亚型流感病毒的抗体。H3亚型SIV是我国猪群流感病毒流行的主要亚型之一,为方便以后H3亚型SIV抗体的检测,我们表达了H3N2亚型SIV的HA1蛋白,建立了基于HA1蛋白的间接ELISA方法,并初步用于临床血清样品抗体的检测。
近几年,H5N1亚型禽流感病毒已跨越了“猪-禽”的种间屏障,在我国猪群中存在。为了进一步研究禽源H5N1亚型SIV的致病机制及病毒的结构与功能,本研究选取一株背景清晰的SIV分离株(A/swine/Fujian/NP/01)进行反向遗传平台的构建。目前,我们已经获得了序列准确的8质粒,下游的病毒拯救工作还在继续进行当中。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2008【分类号】：S858.28【目录】：
Abstract8-18
第一章 绪论18-35
1.1 二十世纪三次流感大流行的回顾18-20
1.1.1 西班牙流感18-19
1.1.2 亚洲流感19
1.1.3 香港流感19-20
1.1.4 其它流感20
1.2 猪流感概况20-24
1.2.1 病原及早期历史20
1.2.2 猪流感的兽医公共卫生学意义20-22
1.2.3 猪流感的人类公共卫生学意义22-24
1.3 猪流感病毒的分子生物学特性24-31
1.3.1 猪流感病毒形态结构24
1.3.2 猪流感病毒基因组的结构及其编码蛋白的功能24-27
1.3.3 猪流感病毒的复制27-28
1.3.4 猪流感病毒种间传播的分子机制28-29
1.3.5 猪流感病毒的变异29-31
1.4 猪流感病毒的流行病学研究进展31-34
1.4.1 古典H1N1 亚型SIV31-32
1.4.2 人源SIV32-33
1.4.3 禽源SIV33
1.4.4 其它重组SIV33-34
1.5 本研究的目的和意义34-35
第二章 猪流感病毒型和亚型 RT-PCR 检测方法的建立35-41
2.1 材料与方法35-37
2.1.1 病毒35-36
2.1.2 试剂36
2.1.3 引物的设计及合成36
2.1.4 病毒的增殖36
2.1.5 病毒RNA 的提取及cDNA 的合成36-37
2.1.6 PCR 扩增37
2.1.7 特异性试验37
2.1.8 敏感性试验37
2.1.9 临床样品的检测37
2.2 结果37-39
2.2.1 特异性试验结果37-39
2.2.2 敏感性试验结果39
2.2.3 临床样品的检测39
2.3 讨论39-41
第三章 猪流感病毒的分离鉴定及其生物学特性的研究41-49
3.1 材料与方法41-45
3.1.1 试剂41-42
3.1.2 细胞42
3.1.3 实验动物42
3.1.4 病料的采集和处理42
3.1.5 病毒的分离42-43
3.1.6 病毒的纯化43
3.1.7 病毒亚型的鉴定43-44
3.1.8 病毒感染力的滴定44-45
3.1.9 小鼠致病性试验45
3.2 结果45-47
3.2.1 病毒分离及亚型鉴定结果45-46
3.2.2 病毒感染力的滴定46
3.2.3 小鼠致病性实验46-47
3.3 讨论47-49
第四章 人源 H1N1 亚型猪流感病毒的遗传演化分析49-69
4.1 材料与方法50-51
4.1.1 毒株及其来源50
4.1.2 试剂50
4.1.3 引物50
4.1.4 RNA 的提取与反转录50
4.1.5 PCR 与目的片段的扩增50-51
4.1.6 目的片段的克隆51
4.1.7 序列测定51
4.1.8 序列拼接与分析51
4.2 结果51-68
4.2.1 序列测定结果51
4.2.2 Blast 分析结果51-52
4.2.3 HA 基因分析52-56
4.2.4 NA 基因分析56-59
4.2.5 PB2 基因分析59-61
4.2.6 PB1 基因分析61-62
4.2.7 PA 基因分析62-64
4.2.8 NP 基因分析64-65
4.2.9 M 基因分析65-67
4.2.10 NS 基因分析67-68
4.3 讨论68-69
年中国 H3N2 亚型猪流感病毒分子进化的研究69-87
5.1 材料与方法70-72
5.1.1 试剂70
5.1.2 毒株70
5.1.3 毒株的地理分布70
5.1.4 序列分析70-72
5.2 结果72-86
5.2.1 测序结果72
5.2.2 Blast 分析结果72-74
5.2.3 HA 基因核苷酸遗传演化分析74
5.2.4 HA 基因氨基酸序列分析74-78
5.2.5 NA 基因的核苷酸遗传演化分析78-79
5.2.6 PB2 基因核苷酸遗传演化分析79-80
5.2.7 PB1 基因核苷酸遗传演化分析80-81
5.2.8 PA 基因核苷酸遗传演化分析81-82
5.2.9 NP 基因核苷酸遗传演化分析82-83
5.2.10 M 基因核苷酸的遗传演化分析83-84
5.2.11 NS 基因核苷酸的遗传演化分析84-85
年中国H3N2 亚型SIV 基因型划分结果85-86
5.3 讨论86-87
第六章 禽源 H9N2 亚型猪流感病毒分子进化的研究87-103
6.1 材料与方法88-89
6.1.1 试剂88
6.1.2 临床样品88
6.1.3 毒株的地理分布88
6.1.4 序列分析88-89
6.2 结果89-102
6.2.1 病毒的分离与鉴定89-90
6.2.2 Blast 分析结果90
6.2.3 HA 基因分析90-93
6.2.4 NA 基因分析93-95
6.2.5 PB2 基因系统进化分析95-96
6.2.6 PB1 基因系统进化分析96-97
6.2.7 PA 基因系统进化分析97-98
6.2.8 NP 基因系统进化分析98-99
6.2.9 M 基因系统进化分析99-100
6.2.10 NS 基因系统进化分析100-101
6.2.11 25 株禽源H9N2 亚型SIV 基因型划分结果101-102
6.3 讨论102-103
第七章 猪流感血清学调查的初步研究103-110
7.1 材料与方法104-106
7.1.1 血清样品的采集104
7.1.2 血清样品的预处理104
7.1.3 血清的检测104
7.1.4 H3N2 亚型SIV 重组HA1 蛋白间接ELISA 方法的建立及初步应用104-106
7.2 结果106-108
7.2.1 血清抗体检测结果106
7.2.2 H3N2 亚型SIV 重组HA1 蛋白间接ELISA 方法的建立及初步应用106-108
7.3 讨论108-110
第八章 禽源 H5N1 亚型猪流感病毒反向遗传平台的构建110-117
8.1 材料与方法110-114
8.1.1 试剂110-111
8.1.2 毒株111
8.1.3 载体111-112
8.1.4 引物112
8.1.5 RNA 提取与反转录112-113
8.1.6 八质粒系统的构建113-114
8.2 结果114-116
8.2.1 酶切鉴定 8 质粒系统114-115
8.2.2 PCR 鉴定 8 质粒系统115-116
8.3 讨论116-117
第九章 全文结论117-118
参考文献118-130
附录130-147
致谢147-148
作者简历148-149
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龙游县f，，山黑镇那里有养猪场吗？想看看养猪场的模式。新兴镇有气温有好多度是什么原因竹子长得特别快？
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小时。。有滑兵场。有的，我一年前去过那个时候收的是30元&#47，但现在不知道了。，就在东区市场就有的！黄坝新图书馆桥有。！。经验之谈，但价格应该不贵
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