25×16计数板：；总菌数/ml?80个小方格内菌数；80?400?10000?稀释倍数；＝每小方格内菌数×4×106×稀释倍数；（五）实验报告内容；记录计数结果并计算出每毫升菌液中的酵母菌细胞数；（六）思考题；1.在滴加菌液时，为什么要先盖上盖玻片后再滴加菌；2.用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成；3.计数细菌数目时此法是否适用？；二、大肠杆菌活
25×16计数板：
总菌数/ml?80个小方格内菌数
80?400?10000?稀释倍数
＝每小方格内菌数×4×106×稀释倍数
（五）实验报告内容
记录计数结果并计算出每毫升菌液中的酵母菌细胞数。
（六）思考题
1.在滴加菌液时，为什么要先盖上盖玻片后再滴加菌液？能否先滴加菌液再盖盖玻片？
2.用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？
3.计数细菌数目时此法是否适用？
二、大肠杆菌活菌的运动观察
（一）实验目的
学习了解在暗视野中观察细菌的运动。
（二）实验原理
鞭毛（flagellum，复flagella）是生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，其数目为―至数十条，具有运动功能。鞭毛的长度一般为15～20μm，直径为0.01l～0.02μm。观察鞭毛最直接的方法是用电子显微镜，用特殊的鞭毛染色法使染料沉积在鞭毛上，加粗后的鞭毛也可用光学显微镜观察。在暗视野中，对水浸片或悬滴标本中运动着的细菌，也可根据其运动方式判断它们是否具有鞭毛。在下述两种情况下，单凭肉眼观察也可初步推断某细菌是否存在着鞭毛：①在半固体(含0.3％～0.4％琼脂)直立柱中用穿刺法接种某一细菌，经培养后，若在穿刺线周围有呈混蚀的扩散区，说明该菌具有运动能力，并可推测其长有鞭毛，反之，则无鞭毛；②根据某菌在平板培养基上的菌落外形也可推断它有无鞭毛，一般地说，如果该菌长出的菌落形状大、薄且不规则，边缘极不圆整，说明该菌运动能力很强，反之，若菌落外形圆整、边缘光滑、厚度较大，则说明它是无鞭毛的细菌。
原核微生物(包括古生菌)鞭毛的构造由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌和阴性细菌在基体的构造上稍有区别。革兰氏阴性细菌的鞭毛最为典型，现以大肠杆菌的鞭毛为例。它的基体(basal body)由四个盘状物即环(ring)组成，最外层的L环连在细胞壁最外层的外膜上，接着是连在肽聚糖内壁层的P环，第三个是靠近周质空间的S环，它与第四个环即M环连在一起称S－M环或内环，共同嵌埋在细胞质膜上。S－M环被一对Mot蛋白包围，由它驱动S―M环快速旋转。在S―M环的基部还存在一个Fli蛋白，起着键钮的作用，它可根据细胞提供的信号令鞭毛进行正转或逆转。目前已清楚地知道，鞭毛基体实为精致、超微型的马达，其能量来自细胞膜上的质子动势(proton motive potential)。据计算，
鞭毛旋转一周约消耗1000个质子。把鞭毛基体与鞭毛丝连在一起的构造称钩形鞘或鞭毛钩(hook)，直径约17 nm，其上着生―条长约15～20μm的鞭毛丝(filament)。鞭毛丝是由许多直径为4.5 nm的鞭毛蛋白(flagellin)亚基沿着中央孔道(直径为2 nm)螺旋状缠绕而成，每周为8～10个亚基，鞭毛蛋白是一种呈球状或卵圆状蛋白，相对分子质量为3万～6万，它在细胞质内合成，由鞭毛基部通过中央孔道输送到鞭毛游离的顶部进行自装配。因此，鞭毛的生长方式是在其顶部延伸而非基部延伸。图2－2即为革兰氏阴性细菌鞭毛的构造模式图。革兰氏阳性细菌的鞭毛结构较为简单。枯草芽抱杆菌鞭毛的基体仅有S和M两个环，而鞭毛丝和钩形鞘则与革兰氏阴性菌相同。
革兰氏阴性细菌鞭毛的构造
鞭毛的功能是运动，这是原核生物实现其趋性(taxis)即趋向性的最有效方式，其运动方式主要是作旋转运动。
鞭毛的着生方式有，端生、周生和侧生等三种类型。
（三）实验材料
大肠杆菌。
2.实验器材
显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种针。
（四）实验步骤
1. 取一洁净的血球计数板或载玻片；
2. 在载玻片上滴2～3滴无菌水；
取接种环，灼烧，在试管斜面上取一环大肠杆菌，在滴有无菌水的载玻片上制成菌
4. 用滴管取一小滴滴在盖玻片上，并将盖玻片扣在血球计数板的凹槽上，或直接将盖
玻片盖在菌悬液上，放在显微镜下进行观察。
（五）实验报告内容
描述大肠杆菌的运动方式。
（六）思考题
为什么在显微镜下观察细菌运动要将可变光栏调到最小（暗视野）？
三、放线菌及霉菌的水悬液观察
（一）实验目的
观察了解不同菌丝的形态以及孢子的形态、着生方式。
（二）实验原理
放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，菌丝体分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状，或分枝状等，其着生的形式也有所不同。菌丝呈各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子的形状多种多样，表面结构各异，孢子也具各种颜色。由于大量孢子的存在，使菌落表面呈现干粉状，从菌落的形态特点容易同其他类微生物区分开来。这些形态特点都是菌种鉴定和分类的重要依据。
霉菌菌丝示意图
A无隔多核菌丝；B有隔单核菌丝；C有隔多核菌丝。
霉菌(mold)是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝(hypha)构成。许多菌丝交织在一起称为菌丝体(mycelium)。菌丝在光学显微镜下呈管状，直径约为2～10μm，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。霉菌菌丝有两类(图2―3)：①无隔膜菌丝，整个菌丝为长管状单细胞，细胞质内含有多个核。其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加，如根霉、毛霉、犁头霉等。
膜菌丝，菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核。有些菌丝，从外观看虽然像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质和细胞核可以自由流通，而且每个细胞的功能也都相同，如青霉菌、曲霉菌、白地霉等绝大多数霉菌菌丝均属此类。
在固体培养基上，部分菌丝伸人培养基内吸收养料，称为营养菌丝；另一部分则向空中生长，称为气生菌丝。有的气生菌丝发育到―定阶段，分化成繁殖菌丝，即孢子丝。
（三）实验材料
灰色链霉菌，黑曲霉，毛霉。
2. 实验器材
显微镜，载玻片，盖玻片，接种针。
（四）实验步骤
实验步骤同实验一放线菌和霉菌形态观察。
培养基的配制及灭菌
培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。一般细菌、放线菌适于生长在中性或微碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。因此，在配制培养基时，须将培养基调节在一定pH的范围内。
迄今为止，培养基的种类极其繁多。按培养基的成分，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。
天然培养基是指利用动物、植物、微生物或其它天然有机成分配制而成的培养基。其优点是营养丰富、价格便易；缺点是成分不能准确确定且不稳定。实验室常用的牛肉汁或麦芽汁培养基即为天然培养基。
合成培养基是指完全利用已知种类和成分的化学试剂配制而成的培养基。优点是各成分均为已知且含量稳定，缺点是价格较贵。实验室常用的高氏一号培养基即为合成培养基。
半合成培养基是指由天然有机成分和已知化学试剂混合组成的培养基。实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基即为半合成培养基。
按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂（常加1.5％～2％的琼脂）经融化冷凝而成；半固体培养基是指在液体培养基中加入0.2％～1％左右的琼脂，经融化冷凝而成；液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。
按培养基的用途，可将培养基分为加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
加富培养基是指在培养基中加入某些特殊营养物质，促使某种持殊性能的微生物迅速生长，有利从混合菌群中分离出所需种类微生物。例如为了分离能够利用石蜡的微生物，常在培养基中加入石蜡作为碳源。
选择培养基是指在培养基中加入某些微生物生长抑制剂，抑制那些不需要的微生物的生长，以达到从混杂微生物菌群的环境中分离到所需的微生物。例如用于分离真菌的马丁培养基。
鉴别培养基是指在培养基中加入特定指示剂，它能与某一微生物的代谢产物产生显色反应，便于微生物的快速鉴定。例如用于鉴定大肠杆菌的伊红美蓝培养基。
本章着重介绍培养基的常规配制程序，培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌常用培养基的配制方法，以及几种常用选择培养基和鉴别培养基的配制方法。此外还介绍高压蒸汽灭菌法，它是微生物学实验中最常用也是最重要的灭菌方法。
一、培养基的常规配制程序
（一）目的要求
了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项。
了解培养基的配制原理。
（二）基本原理
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
（三）实验材料
待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液等。
天平或台秤、高压蒸汽灭菌锅。
3. 玻璃器皿
移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
4. 其它物品
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。
（四）实验步骤
1. 玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的
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