青霉素工厂设计_甜梦文库
青霉素工厂设计
湖南科技大学本科生毕业设计第一章 前 言青霉素是一类抗生素的总称。自从被发现以来，就被人们广泛应用于医疗行 业。是用应得最多的一类抗生素，从此很多医学难题迎刃而解。也使人们致力于 青霉素及其相关技术的研究。 青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。它的研制成功大大 增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。它的出现开创了 用抗生素治疗疾病的新纪元。 1942 年美国就有制药企业对青霉素进行大量生产，当时青霉素主要用于治 疗伤口发炎，它拯救了无数人的生命。而后随着人们认识的加深和科学技术的进 步，青霉素工厂如雨后春笋般在全球崛起。 1953 年 5 月，中国第一批国产青霉素诞生，揭开了中国生产抗生素的历史。 目前，中国已成为全球抗生素产量最大的国家，年产 14.7 万吨，在许多原料药 生产方面已在全球拥有绝对优势。 本设计是设计一个年产一万吨的青霉素工厂。 介绍了青霉素的发展史和生产 工艺。对青霉素的生产的各个过程进行了详细的计算和介绍。最后对青霉素的发 展进行展望。- 1 -湖南科技大学本科生毕业设计第二 章 绪 论2.1 青霉素概述[1]青霉素(Benzylpenicillin / Penicillin)又被称为青霉素 G、 peillin G、 盘尼西林、 配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素 的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁 并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素， 是第一种能够治疗人类疾病的 抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。 1929 年亚历山大?弗莱明发现了青霉素，它是应用于临床的第一个抗生素。 青霉素多年来一致被国内外临床证实具有抗菌作用强、疗效高、毒性低等优点。 很多人因为这个发现而存活。目前仍广泛地用于临床，特别是由于半合成青霉素 的飞跃发展，使青霉素类药品在临床上的应用也日趋增多。青霉素是一族抗生素 的总称，它们是由不同的菌种式不同的培养条件所得的同一类化学物质，其共同 化学结构为：图 2.1青霉素结构式由(Ⅰ)式可见， 青霉素分子是由侧链酰基与母核如(Ⅱ)式所示两大部分组成。 母核为 6-氨基青霉烷酸(6-amine penicillianic acid，6-APA)，它是由四氢噻唑环和 β-内酰胺环稠合而成，也可看做是半胱氨酸(Ⅱ)式中虚线的左上方所示和缬氨酸 (Ⅱ)式中虚线的右下方所示结合而成的二肽。青霉素分子中含有三个手性的碳原 子，故具有旋光性。不同的侧链 R 构成不同类型的青霉素。若 R 为S基，即为 S基青霉素或称为青霉素 G。目前，已知的天然青霉素 G 疗效最好。如不特别 注明，通常所谓的青霉素即指S青霉素。在医疗上应用的有青霉素 G 钠盐、钾 盐、普鲁卡因盐和S基乙二胺盐等。 2.1.1 青霉素的分类 根据青霉素的制取分二类： ⑴ 根据青霉素的制取分二类：由发酵液制取和半合成制取。 发酵液制取：青霉素(青霉素 G)、青霉素 V。 半合成制取：抗葡萄球菌青霉素、氨苄西林类、抗假单胞菌青霉素。 根据青霉素的特点分六类： ⑵ 根据青霉素的特点分六类：青霉素 G 类：如青霉素 G 钾、青霉素 G 钠、 长效西林等。 青霉素 V 类：(别名：苯氧甲基青霉素、6-苯氧乙酰胺基青霉烷酸) 如青霉 素 V 钾等(包括有多种剂型)。- 2 -湖南科技大学本科生毕业设计耐酶青霉素：如苯唑青霉素(新青Ⅱ号)、氯唑青霉素等。 广谱青霉素：如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等。 抗绿脓杆菌的广谱青霉素：如羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、呋苄青霉素等。 氮咪青霉素：如美西林及其酯匹美西林等，其特点为较耐酶，对某些阴性杆 菌(如大肠、克雷伯氏和沙门氏菌)有效，但对绿脓杆菌效差。 2.1.2 青霉素的理化性质 ⑴ 吸湿性 青霉素的吸湿性与其内在质量有关。纯度越高，吸湿性越小，也 就易于存放。因此制成晶体就比无定形粉末吸湿性小，而各种盐类结晶的吸湿性 又有所不同，且吸湿性随着湿度的增加而增大。在某个湿度，湿度在增大时，吸 湿性明显上升，这点湿度称“临界湿度”。青霉素钠盐的临界湿度为 72.6%，而 钾盐为 80%。钠盐的吸湿性较强，其次为铵盐，钾盐较小。由此可见，钠盐比钾 盐更不容易保存，因此分包装车间的湿度和成品的包装条件要求更高， 以免产 品变质。 能与碱金属或碱土金属及有机氨类结合 ⑵ 溶解度 青霉素本身是种游离酸， 成盐类。青霉素游离酸易溶于醇类、酮类、丙醇、和酯类，但在水溶液中解度很 小；青霉素钾盐、钠盐，则易溶于水和甲醇，微溶于乙醇、丙醇、丙酮、乙醚、 氯仿，在醋酸丁酯中难溶或不溶。如果有机溶剂中含有少量水分时，则青霉素 G 碱金属盐在溶剂中的溶解度就大大增加。如钠盐在丙酮中溶解度随丙酮含水由 0~2.0，则其溶解度由 6.0mg/100ml 升至 100mg/100ml。 ⑶ 稳定性 一般来说，青霉素是一种不稳定的化合物，这主要是指青霉素 的水溶液而言，成为晶体状态的青霉素还是比较稳定的。晶体状态下钠盐、钾盐 均为白色结晶粉末；无臭或微有特异性臭味。纯度、吸湿性、温度、湿度和溶液 的酸碱性等对其稳定性都有很大影响。 青霉素游离酸的无定形粉末在非常干燥的情况下能保存几个小时，在 0℃可 保存 24 小时。但其吸湿性较强，即使含微量水分就便之很快失效。而青霉素盐 晶体吸湿性小，因此制备一定晶形青霉素盐则可提高其稳定性。 固体状态的青霉素钠盐类其稳定性质随质量的提高而增加， 由于醋酸钾有强 烈的吸湿性，所以成品中需将残留的醋酸钾除尽，否则会吸潮变质影响有效期。 青霉素在水溶液里很快地分解或异构化， 因此青霉素应尽量缩短在水中的存 放时间，特别由于温度、酸性、碱性的影响。一般青霉素水溶液在 15℃以下和 pH5~7 范围内较稳定，最稳定的 pH 值为 6 左右。一些缓冲液，如磷酸盐和柠檬 酸盐对青霉素有稳定作用。 ⑷ 酸碱性 青霉素的分子结构中有一个酸性基团(羧基)，用电位滴定法证 明青霉素分子中没有碱性基团，这对讨论它的结构起着重要的作用。S青霉素在 水中的解离度常数 pK 值为 2.7，即 Ka=2.0×10-3，所以酸化 pH=2 萃取时，就能- 3 -湖南科技大学本科生毕业设计把青霉素解离成游离酸，从水相中转移到有机溶剂中。而青霉素在 pH=7 时易容 于水。在不同的 pH 条件下用不同的溶剂反复进行萃取，从而达到提纯和浓缩的 目的。 2.1.3 青霉素的特点 临床应用广泛的重要抗生 ⑴ 青霉素的性质特点 青霉素是一种高效、低毒、 素。青霉素针剂和口服青霉素已能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、 白喉、炭疽等病。它的研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了 抗生素家族的诞生。 其性状为白色结晶或结晶性粉末，无臭或带微臭味，微苦，易溶于水，微溶 于乙醇，不溶于苯、乙醚、非挥发油和液体石蜡。 青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称，由于β-内酰胺类作用 于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起 严重的过敏反应外， 在一般用量下， 其毒性不甚明显， 但它不能耐受耐药菌株(如 耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有 效。青霉素 G 有钾盐、钠盐之分，钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要 仔细计算钾离子量，以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。 青霉素类抗生素的毒性很小，是化疗指数最大的抗生素。但其青霉素 类抗生素常 见的过敏 反应在各 种药物中 居首位，发生 率最高可 达 5％～ 10 ％ ，为皮肤反应 ，表现皮疹、血管性水肿，最严重者为过敏性休克，多 在注射后数分钟内发生，症状为呼吸困难、发绀、血压下降、昏迷、肢体 强直，最后惊厥，抢救不及时可造成死亡。各种给药途径或应用各种制剂 都能引起过敏性休克，但以注射用药的发生率最高。过敏反应的发生与药 物剂量大小无关。对本品高度过敏者，虽极微量亦能引起休克。注入体内 可致 癫痫 样发作。大剂量长时间注射对中枢神经系统有毒性 (如引起抽搐、 昏迷等)，停药或降低剂量可以恢复。 肌注或皮下注射后吸 ⑵ 青霉素的药理作用 内服易被胃酸和消化酶破坏。 收较快，15～30min 达血药峰浓度。青霉素在体内半衰期较短，主要以原形从尿 中排出。 青霉素药理作用是干扰细菌细胞壁的合成。 青霉素的结构与细胞壁的成分粘 肽结构中的 D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成， 造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 对革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌、螺旋体、梭状芽孢杆菌、放线菌以及部分 拟杆菌有抗菌作用。 青霉素对溶血性链球菌等链球菌属， 肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌 具有良好抗菌作用。对肠球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、- 4 -湖南科技大学本科生毕业设计白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、李斯特菌、钩端螺 旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。 本品对流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌亦具一定 抗菌活性，其他革兰阴性需氧或兼性厌氧菌对本品敏感性差.本品对梭状芽孢杆 菌属、消化链球菌、厌氧菌以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用，对脆弱拟杆 菌的抗菌作用差。 青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻 碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。对革兰阳性菌有效，由于革兰阴性菌缺乏五肽交 连桥而青霉素对其作用不大。 发生率 ⑶ 青霉素副作用 ①青霉素类的毒性很低，但较易发生变态反应， 约为 5%～10%。多见的为皮疹、哮喘、药物热、严重的可致过敏性休克而引起 死亡。 ②大剂量应用青霉素抗感染时，可出现神经精神症状，如反射亢进、知觉障 碍、抽搐、昏睡等，停药或减少剂量可恢复。 ③使用青霉素前必须作皮肤过敏试验。如果发生过敏性休克，应立即皮下或 肌内注射 0.1%肾上腺素 0.5ml～1ml，同时给氧并使用抗组胺药物及肾上腺皮质 激素等。 (注：由于青霉素过敏性反应实为杂质引起的，所以目前有部分进口高 纯度青霉素无需皮试，可直接使用) ④肌注钾盐时局部疼痛较明显，用苯甲醇溶液作为稀释剂溶解，则可消除 疼痛。 ⑷ 青霉素配伍应用中的相互作用 相互作用和不良反应是不可忽视的。 ①青霉素不可与同类抗生素联用 由于它们的抗菌谱和抗菌机制大部分 相似，联用效果并不相加。相反，合并用药加重肾损害，还可以引起呼吸困难 或呼吸停止。它们之间有交叉抗药性，不主张两种β-内酰胺类抗生素联合应 用。 ②青霉素不可与磺胺和四环素联合用药 青霉素属繁殖期“杀菌剂”， 阻碍 细菌 细胞 壁的 合成 ，四 环素 属 “抑菌剂 ” ，影 响菌 体蛋 白质 的合 成， 二者联合作用属拮抗作用，一般情况下不应联合用药。临床资料表明单用 青霉素抗菌效力为 90%，单用磺胺类药 效力为 81%，两者联合用药抗菌效 力为 75%，若非特殊情况不可联合使用。 ③青霉素不可与氨基糖苷类混合输液 两者混合同于输液器给病人输液， 因 青霉素的β-内酰胺可使庆大霉素产生灭活作用， 其机制为两者之间发生化学相互 作用，故严禁混合应用，应采用青霉素静脉滴注，庆大霉素肌肉注射。 近年来，临床中出现滥用药物的问 题，造成一些不良反应，尤其是青霉素与其他药物的配伍应用，所产生的- 5 -湖南科技大学本科生毕业设计综上所述，青霉素联用不当，由于药物的相互作用，而导致药物不良反应 是不可低估的。青霉素是治疗各种感染性疾病的最常用抗生素，严格掌握用药的 适应证，合理联用，措施得力，减少不必要的不良反应。 2.1.4 青霉素的历史发展 20 世纪 40 年代以前，人类一直未能掌握一种能高效治疗细菌性感染且副作 用小的药物。当时若某人患了肺结核，那么就意味着此人不久就会离开人世。为 了改变这种局面，科研人员进行了长期探索，然而在这方面所取得的突破性进展 却源自一个意外发现。 亚历山大?弗莱明由于一次幸运的过失而发现了青霉素。 在 1928 年夏弗莱明外出度假时，把实验室里在培养皿中正生长着细菌这件事给 忘了。3 周后当他回实验室时，注意到 一个与空气意外接触过的金黄色葡萄球 菌培养皿中长出了一团青绿色霉菌。在用显微镜观察这只培养皿时弗莱明发现， 霉菌周围的葡萄球菌菌落已被溶解。这意味着霉菌的某种分泌物能抑制葡萄球 菌。此后的鉴定表明，上述霉菌为点青霉菌，因此弗莱明将其分泌的抑菌物质称 为青霉素。然而遗憾的是弗莱明一直未能找到提取高纯度青霉素的方法，于是他 将点青霉菌菌株一代代地培养，并于 1939 年将菌种提供给准备系统研究青霉素 的澳大利亚病理学家弗洛里(Howard Walter Florey)和生物化学家钱恩。 通过一段时间的紧张实验，弗洛里、钱恩终于用冷冻干燥法提取了青霉素晶 体。之后，弗洛里在一种甜瓜上发现了可供大量提取青霉素的霉菌，并用玉米粉 调制出了相应的培养液。弗洛里和钱恩在 1940 年用青霉素重新做了实验。他们 给 8 只小鼠注射了致死剂量的链球菌，然后给其中的 4 只用青霉素治疗。几个小 时内，只有那 4 只用青霉素治疗过的小鼠还健康活着。“这真像一个奇迹！”弗 洛里说道。此后一系列临床实验证实了青霉素对链球菌、白喉杆菌等多种细菌感 染的疗效。青霉素之所以能既杀死病菌，又不损害人体细胞，原因在于青霉素所 含的青霉烷能使病菌细胞壁的合成发生障碍，导致病菌溶解死亡，而人和动物的 细胞则没有细胞壁。但是青霉素会使个别人发生过敏反应，所以在应用前必须做 皮试。在这些研究成果的推动下，美国制药企业于 1942 年开始对青霉素进行大 批量生产。到了 1943 年，制药公司已经发现了批量生产青霉素的方法。当时英 国和美国正在和纳粹德国交战。 这种新的药物对控制伤口感染非常有效。 1944 到 年，药物的供应已经足够治疗第二次世界大战期间所有参战的盟军士兵。 1945 年，弗莱明、弗洛里和钱恩因“发现青霉素及其临床效用”而共同荣 获了诺贝尔生理学或医学奖。 青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。它的研制成功大大 增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。它的出现开创了 用抗生素治疗疾病的新纪元。通过数十年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已能 分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。继青霉素之后，- 6 -湖南科技大学本科生毕业设计链霉素、氯霉素、土霉素、四环素等抗生素不断产生，增强了人类治疗传染性疾 病的能力。但与此同时，部分病菌的抗药性也在逐渐增强。为了解决这一问题， 科研人员目前正在开发药效更强的抗生素，探索如何阻止病菌获得抵抗基因，并 以植物为原料开发抗菌类药物。 1953 年 5 月，中国第一批国产青霉素诞生，揭开了中国生产抗生素的历史。 截至 2001 年年底，我国的青霉素年产量已占世界青霉素年总产量的 60%，居世 界首位。目前，中国已成为全球抗生素产量最大的国家，年产 14.7 万吨，在许 多原料药生产方面已在全球拥有绝对优势。[2] 2.1.5 我国青霉素工业发展空间 国内青霉素市场经过几场大战的洗礼， 硝烟散尽， 已渐现市场的规范和成熟。 随着国家宏观政策的调整和市场秩序的整顿，曾经低迷的销售状况有所好转。在 青霉素产品中，华药、石药、鲁抗和哈药四家的青霉素 C 钠原料药所占份额已 从 1999 年国内市场的 89％上升至 2000 年初的 93.8％，青霉素 G 纳粉针已由 85 ％上升到 91.2％。在 2000 年全国医药企业上缴利润、产值等指标排行榜中，这 几家生产企业均名列前位。在国际市场上，我国已经成为世界上十大医药生产和 原料药出口国之一，其中青霉素原料药占国际市场三成以上的份额。 据 1999 年底有关统计资料，在我国 29 家青霉素原料药生产企业中，生产青 霉素类原料药 12 种，年总产量达 6500 多吨。 到 2001 年上半年，我国青霉素工业盐产量已经达到了 6200 多吨，比去年同 期增长了 1500 多吨，预计全年产量将达到 13500 吨。2000 年我国青霉素工业盐 出口量为 3240 吨，2001 年上半年出口量为 1700 多吨，预计全年出口 3600 吨左 右。 随着我国青霉素工业的发展，以及临床用药水平的提高，半合成青霉素类产 品也得到了快速发展。如羟氨苄青霉素，近 20 年来，在世界产量逐年增加的同 时，国内该品种的产量和市场销售量呈直线上升，2000 年我国产量达到 2000 吨 左右， 1999 年增加 69％； 比 2001 年上半年产量为 1470 吨， 比去年同期增长 42.7 ％，预计全年可达 2500 吨，为半合成青霉素中最大产量的一个品种，将在以后 的半合成青霉素产品构成中起主导作用， 产销量将继续保持上升态势已是业内人 士的共识。哌拉西林是这两年发展较快的半合成青霉素类注射粉针剂，其原料药 产量 2001 年上半年已达 80 吨，比去年增长了 61.2％。而其它一些新的半合成青 霉素及其复方制剂也不断开发上市，舒他西林、舒巴坦钠／头孢哌酮、替卡西林 ／克拉维酸钾，以及安美汀、阿莫西林／克拉维酸钾、安克、安奇等国内外品牌 大有后来居上之势，并有可能成为羟氯苯青霉素单方制剂的更新换代产品。- 7 -湖南科技大学本科生毕业设计2.1.6 生产原理 青霉素是产黄青霉株以淀粉和玉米浆为原料利用三级发酵在一定的培养条 件下发酵产生的。生产上一般将孢子悬液接入种子罐经二级扩大培养后，移入发 酵罐进行发酵， 所制得的含有一定浓度青霉素的发酵液经适当预处理， 再经提炼、 精制、成品分包装等工序最终制得合乎药典的成品。 2.1.7 青霉素产生菌的培养 ⑴ 菌体的生长发育 段； ①分生孢子的 I 期； ②菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，有类脂肪小颗粒产生为 II 期； ③原生质嗜碱性仍很强，形成脂肪粒，积累贮藏物为 III 期； ④原生质嗜碱性很弱，脂肪粒减少，形成中、小空泡为 IV 期； ⑤脂肪粒消失，形成大空泡为 V 期； ⑥细胞内看不到颗粒，并有个别自溶细胞出为 VI 期 其中 I~IV 期称为菌丝生长期，菌丝的浓度增加很多，但产生的青霉素较少， 处于该时期的菌丝体适用于作发酵种子。 IV～V 期是青霉素分泌期，此时菌丝体 生长缓慢，并大量生产青霉素。VI 期是菌丝体自溶期。 ⑵ 菌种的培养 利用菌体进行发酵生产青霉素的关键是要筛选高产菌种， 另外要通过不断地分离纯化来保证高产菌种的纯度，避免生产波动。高产菌种的 选育和培养还要采用严格的无菌操作，防止污染杂菌。供日常生产的高产纯种还 必须用良好的方法妥善保藏，以维持其优良性能，保证生产稳定。种子培养阶段 以产生丰富的孢子(斜面和米孢子培养)或大量健壮丝体(种子罐培养)为主要目 的。因此在培养基中应加入丰富易代谢的碳源(如葡萄糖或蔗糖)、氮源(如玉米 浆)、 缓冲 pH 值的碳酸钙以及生长所必需的无机盐， 并保持最适生长温度 25~26℃ 和充分的通气搅拌，使菌体倍增达到对数生长期，此期要严格控制培养条件及原 材料质量的稳定性。 2.1.8 青霉素的生物合成 产黄青霉菌在发酵过程中首先合成其前体，即α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬 氨酸，再在三肽合成酶的催化下，L-α氨基己二酸(α-AAA)与 L-半胱氨酸形成二 肽， 然后再与 L-缬氨酸形成三肽化合物， 称α-氨基己二酰-半胱氨酸(构型为 LLD)， 其中缬氨酸的构型必须是 L 型才能被菌体用于合成三肽。在三肽的形成过程中， L-缬氨酸转为 D 型。 产黄青霉在液体深层培养中菌丝可发育为两种形态，即球状菌和线状菌。在整个发酵培养过程中，产黄青霉的生长发育可分为 6 个阶- 8 -湖南科技大学本科生毕业设计三肽化合物在环化本科的作用下闭球形成异青霉素 N，异青霉素 N 中的αAAA 侧链可以在酰基转移本科作用下转换成其他侧链，形成青霉素类抗生素。 如果在发酵液中加入苯乙酸，其各代谢通道畅通就可大量生产青霉素。因此，代 谢网络中各种酶活性越高，越利于生产，对各酶活性的调节是控制代谢通量的关 键。产黄青霉生产青霉素受下列方式调控。 ⑴ 受碳源调控 分解产物的阻遏； ⑵ 受氮源调控 NH4+浓度过高，阻遏三肽合成酶、环化酶等； ⑶ 受终产物调控 青霉素过量能反馈调节自身生物合成； ⑷ 受分支途径调控 产黄青霉在合成青霉素途径中，分支途径中 L-赖氨酸 反馈抑制共同途径中第一个酶―高柠檬合成酶。 2.1.9 发酵 ⑴ 发酵的基本原理 青霉素发酵是给予最佳条件培养菌种，使菌种在生长 发育过程中大量产生和分泌抗生素的过程。发酵过程的成败与种子的质量、设备 构型、动力大小、空气量供应、培养基配方、合理补料、培养条件等因素有关。 发酵过程控制就是控制菌种的生化代谢过程，必须对各项工艺条件加以严格管 理，才能做到稳定发酵。青霉素发酵属于好氧发酵过程，在发酵过程中，需不断 通入无菌空气并搅拌，以维持一定的罐压和溶氧。整个发酵阶段分为生长和产物 合成两个阶段。前一个阶段是菌丝快速生长，进入生产阶段的必要条件是降低菌 丝生长速度，这可通过限制糖的供给来实现。发酵过程中应严格控制发酵温度、 发酵液中残糖量、pH 值、排气中的 CO2 量和氧气量等。一般残糖量可通过控制 氮源的补加量来控制；pH 值可通过控制补加的葡萄糖、酸量或碱量来调节；通 过控制搅拌转速、通气量来调节供氧量及液相中的氧含量；至于发酵温度一般可 通过调整冷却介质来加以调节。 此外，还要加入消泡剂(如豆油、玉米油或环氧乙烯聚醚类)以控制泡沫。在 发酵期间这检测生产是否染菌，每隔一定时间应取样进行分析、镜检及无菌试 验，检测生产状况，分析或控制相关参数，如菌丝形态和深度、残糖量、氨基 氮、抗生素含量、溶解氧、pH 值、通气量、搅拌转速等。 一般用 ⑵ 发酵过程经济指标 ①发酵单位 即抗生素在发酵液中的浓度， U/ml 或?g/ml 表示。 为抗菌活性单位， U 又称效价。 青霉素效价单位； 为能在 50ml 肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量。 发酵单 位在一般情况下用于表示发酵水平的高低。显然，当发酵周期相同和放罐发酵液 体积不变时，发酵单位高的过程时间效率和发酵罐容积效率较高，从而降低产品 中的固定成本含量，而且高单位的发酵液一般有利于减轻提炼工序的操作负荷， 减少提炼过程中原材料的消耗以及废水排放量，并因此降低提炼成本。- 9 -青霉素生物合成途径中的一些酶(如酰基转移酶)受葡萄糖湖南科技大学本科生毕业设计然而，当发酵单位的提高是通过延长发酵周期获得时，则对成本核算影响要 具体分析。如果延长发酵周期后，产量成本上升，则延长发酵周期不可取，反之 在经济上合算的。发酵单位的提高还可能是由于蒸发量增加使放罐发酵液体减 少，或由于菌体浓度增长造成发酵滤液体积减少，从而形成表面上发酵单位提高 而放罐总亿单位不变甚至下降的局面，那么，这样获得的高发酵单位自然是不可 取的。 ②发酵总亿单位 发酵单位与发酵体积的乘积称为发酵总亿单位，以亿单位 (108U)或 10 亿单位(109U 或 BU)表示。发酵总亿单位代表发酵产量。因此，在相 同的发酵周期下，发酵总亿单位越高，在单位产量上投入的固定成本就越小，经 济效益也越高。 但是， 当发酵过程产生的菌体量偏大， 因而占据较多发酵液体时， 则由于所获得的滤液体积小，以上所发酵总亿单位便不能正确地反映批发酵产 量，为此，引入“发滤液总亿单位”，即发酵单位与发酵滤液体积的乘积，它代 表真正的批发酵产量。 ③发酵指数 效益越高。 在抗生素批发酵过程中， 发酵指数是不断变化的， 一般在发酵前期迅速上升。 中期时抗生素合成高峰期后达到最大值，以后逐渐下降。当发酵指数处于高峰的 时候，虽然固定成本效益也处于高峰，但由于可变成本效益也相应下降，且可变 成本效益的增加超过固定成本的效益的下降，因而总的效益上升，直到两种成本 效益升降达到平衡。以后可变成本效益的高低，一般不能仅以发酵指数作为判断 依据。 ④年(月)发酵产率 月 发酵产率 效益的高低。 ⑤基质转化率 基质表示。 碳源控制：青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、 ⑶ 发酵的过程控制 ①碳源控制 葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最好 碳源，葡萄糖也是比较好的碳源，但必须控制其加入的浓度，因为葡萄糖易被菌 体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而影响青霉素的合成，所以可以 采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖。 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素 G 的侧链前体。菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到产物分子中或作为养料- 10 -发酵指数是每小时、每立方为发酵罐容积发酵产生的抗生素量。一般以 108U/(m3?h)表示，能反映固定成本效益，即发酵指数越高，固定成本发酵工厂每年(月)每立方米发酵罐容积产生的抗生素量称为年(月)发酵产率。和发酵指相比，年(月)发酵产率更确切地反映了固定成本 发酵过程消耗的主要基质(一般为碳源、能源或其他成本较高的基质)转化为抗生素的得率，称为基质转化率，以 g 抗生素/g 基质或 BU/kg湖南科技大学本科生毕业设计和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径被菌体利用，主要 取决于培养条件以及所用菌种的特性。 通过比较苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰 胺和苯乙酸的毒性取决于培养基的 pH 和前体的浓度。碱性时，苯乙酰胺有毒； 酸性时，苯乙酸毒性较大；中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于 0.1%时，青霉素的生物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在 0.1%为宜。 在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速率随培养基 pH 上升而增加。年幼的 菌丝不氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。随着菌龄的增大，氧化能力逐 渐增加。培养基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对 前体的氧化量少。 为了尽量减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的 方法，以保持前体的供应速率略大于生物合成的需要。 控制：在青霉素发酵过程中，pH 是通过下列手段控制的：如 pH 过 ②pH 控制 高，则添加糖、硫酸或无机氮源；若 pH 过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或 尿素，也可提高通气量。另外，也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液 pH 维持在 6.8～7.2，以提高青霉素产量。 ③温度控制：青霉菌生长的适宜温度为 30℃，而分泌青霉素的适宜温度是 温度控制： 20℃左右，因此生产上采用变温控制的方法，使之适合不同阶段的需要。一般一 级种子的培养温度控制在 27±1℃左右； 二级种子的培养温度控制在 25±1℃左右； 发酵前期和中期的温度控制在 26℃左右；发酵后期的温度控制在 24℃左右。 ④补料控制：发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及 pH 外，补加氮源也可 补料控制： 提高发酵单位。经试验证实：若在发酵 60～70h 开始分次补加硫酸铵，则在 90h 后菌丝含氮量几乎不下降，维持在 6%～7%，，且 60%～70%的菌丝处于年幼阶 段，菌丝呼吸强度维持在二氧化碳量近 30?l/(mg 菌丝?h)，抗生素产率为最高水 平的 30%～40%；而不加硫酸铵的对照罐，在发酵中期菌丝含氮量为 7%，以后 逐级下降。 至发酵结束时为 4%。 发酵结束时呼吸强度降至二氧化碳量为 16?l/(mg 菌丝?h)，且抗生素产量下降至零，总产量仅为试验罐的 1/2。因此，为了延长发 酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。 ⑤铁离子的影响： 铁离子的影响：三价铁离子对青霉素生物合成有显著影响，一般若发酵液 中铁离子含量超过 30～40?g/ml，则发酵单位增长缓慢。因此铁罐在使用前必须 进行处理， 可在罐壁涂上环氧树脂等保护层， 使铁离子含量控制在 30?g/ml 以下。 ⑷ 防止染菌的要点 染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优 质高产。 影响染菌的因素很多， 而且带随机性质， 但只要认真对待， 过细地工作， 染菌是可以防止的。请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。- 11 -湖南科技大学本科生毕业设计防 ⑸ 空气系统的要求 防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度， 止空气夹带油和水及空气过滤器失效。 提高空压机进口空气的洁净度， 可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩 前过滤着手。防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空 气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统 ⑹ 蒸汽系统的要求 重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度 波动，保证生产时所用的蒸汽压力在 30～35 千帕以上。 ①连续灭菌设备：连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与 物料混合均匀，并易于控制温度。 ②发酵罐：发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角” 。 凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。 ③无菌室：用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。 2.1.10 发酵液的预处理和过滤 抗生素产生菌在细胞内合成的抗生素，有的分泌到发酵液中，有的保留在菌 丝全内，对于后者，应当设法使菌丝体细胞破裂，让抗生素释放到发酵液中再进 一步提取，青霉素发酵属于前者。青霉素发酵液成分很复杂，其中含有菌体蛋白 质等固体成分；含有培养基的残余成分及无机盐的液体部分，除产物外，还会有 微量的副产物及色素类杂质。因此，要从发酵液中将青霉素提取出来，才能制备 合乎药典规定的抗生素成品。在提取时，先将发酵液过滤和预处理，目的在于分 离菌丝、除去杂质。生产上采用二次过滤工艺， 一次过滤主要除去菌体，二次 过滤除去蛋白质。 发酵液中的杂质如高价无机离子(Fe2+、Ca2+、Mg2+)和蛋白质在离子交换的 过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提炼时， 蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。对高价离子的去除，可采用 草酸或磷酸。 如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发 酵滤液的质量。如加磷酸(或磷酸盐)，既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。 Na5P3O10 + Mg2+====MgNa3P3O10+ 2Na+ 加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。 此外，两者还有协同作用。他们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。 2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 K2Zn[Fe(CN)6]2 + 2Na+ 为了有效的去除发酵液中的蛋白质，需加入絮凝剂。絮凝剂是一种能溶于水 的高分子化合物。含有很多离子化基团(如―NH2，―COOH，―OH)。 除去蛋白质， 尤其是包含在发酵液中的一部分可溶性蛋白质必须预先加以处 理使沉淀后随同菌丝一起除去。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒- 12 -湖南科技大学本科生毕业设计子的稳定性和其所带电荷有关。 除蛋白质的方法是等电点、 加明矾或好絮凝剂法。 等电点法是用酸(碱)调节发酵液的 pH 值，使其达到蛋白质的等电点，使蛋白质 沉淀。因为蛋白质的羟基的电离度比氨基大，故其酸性性质通常强于碱性，很多 蛋白质的等电点都在酸性的范围内。单靠调节 pH 至等电点的办法不能将大部分 蛋白质除去。在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子(如三氯乙酸盐、水扬酸盐、 钨酸盐、香味酸盐、过氯酸盐、溴代十五烷吡啶等)形成沉淀。在碱性溶液中， 能与一些阳离子(如 Ag+、Cu2+ 、Zn2+ 、Fe3+ 、Pb2+等)形成沉淀。对于不破坏青 霉素，使蛋白质变性的其他方法。如加丙酮、酒精等有机溶剂或絮凝剂等也可除 去蛋白质。有机高分子絮凝剂带有-NH、-COOH 和-OH 基团，能够形成高密度 电荷来中和蛋白质的电性而促成使其絮凝。青霉素生产采用加酸调节 pH 值至等 电点及加入絮凝剂除蛋白质。 经过预处理的发酵液便可进行过滤去除菌丝体及沉淀的蛋白质。 青霉素发酵 过滤宜采用鼓式真空过滤机， 如采用板框过滤机则菌丝因流入下水道而影响废水 治理， 并对环境卫生不利。 因为青霉素在低温时比较稳定， 同时细菌繁殖也较慢， 因而可避免青霉素迅速被破坏，所以发酵液放罐后，一般要先冷却再过滤。过滤 后的滤液需经酸处理除蛋白质，同时加入少量 PPB。由于发酵液中含有过剩的碳 酸钙，在酸化除蛋白质时会有部分溶解，使 Ca2+呈游离状态在酸化萃取时，遇大 量 SO42-形成 CaSO4 沉淀。因此，预处理除蛋白质时 pH 会值适当高些。 不同菌种的发酵过滤难易不同。 如过滤较困难可对过滤料液进行适当处理以 改善过滤性能。改善过滤性能的方法有：酸化凝结、电解质处理、热凝固、加入 助滤剂(硅藻土、纸浆等)。另外，如发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶 将它转化为单糖，对过滤速度有帮助。一般真菌的菌丝比较粗大，发酵液容易过 滤，常不需要特殊处理。青霉素发酵菌丝粗长，直径 10?m，其滤渣成紧密饼状， 很易从滤布上刮下来，无需改善过滤性能。但除蛋白质进行二次过滤时，为了提 高滤速应加硅藻土作助滤剂， 或将部分发酵液不经一次过滤处理而直接进入二次 过滤，利用发酵液中的菌体作助滤介质。生产上一般将不超过发酵液体积 1/3 的 发酵液与一次过滤液一起进行二次过滤。 2.1.11 青霉素的提取 化学提取和精制的目的： 从发酵液中制取高纯度的、 合乎药典的抗生素成品。 青霉素发酵液经过预处理和过滤后得到的滤液由于滤液中青霉素浓度很低，仅 0.1～4.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍，并且某些杂质的 性质与抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作，提取要达到提 纯和浓缩两个目的。 发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代 谢产物、预处理需要加入的杂质等。- 13 -湖南科技大学本科生毕业设计在提炼过程中要遵循下面四个原则： ①时间短 ②温度低 ③pH 适中 ④勤清洗消毒 常用的提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。 ① 溶媒萃取法 这是利用抗生素在不同的 pH 值条件下以不同的化学状态 (游离态、碱或盐)存在时，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗 生素从一种液相(如发酵滤液)转移到另一种液相(如有机溶媒)中去，以达到浓缩 和提纯的目的。利用此原理就可借助于调节 pH 值得方法时抗生素从一个液相中 被提取到另一液相中去。所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同 时所选溶媒在一定的 pH 下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少 量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。 有选择性的 ②离子交换法 利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力， 将抗生素吸附上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。 ③沉淀法 是一种分离抗生素简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很 有效的方法。 究竟采用哪一种方法，要视产品的性质而定。 青霉素的提取采用溶媒萃取 法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸 性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节 pH，再转入中性水相，反复几次萃取， 即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和 戊酯。萃取 2~3 次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH 选择 2.8~3.0，从乙酸丁酯 反萃到水相时，pH 选择 6.8~7.2。为了避免 pH 波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲 液进行反萃。所得滤液多采用二次萃取，用 10%硫酸调 pH2.8~3.0，加入醋酸丁 酯。 由于发酵液中青霉素尝试很低，而杂质(包括无机盐、残糖、脂肪、各种蛋 白质及降解产物、色素、热原物质或有毒物质等)浓度相对较高。另外，青霉素 水溶液也不稳定且发酵液易被污染，故提取时要时间短、温度低，pH 值宜选择 在对青霉素较稳定的范围，勤清洗消毒(包括厂房、设备、容器、并注意消灭死 角)。 青霉素在酸性条件下易溶于丁酯，碱性条件下易溶于水，所以生产上采用萃 取(酸性条件)及反萃取(碱性条件)方法对含青霉素的滤液时行提取。当青霉素自 发酵液萃取到乙酸丁酯中时，大部分有机酸(杂酸)也转移到溶剂中。无机杂质、 大部分含氮化合物等碱性物质及大部分酸性较青霉素强的有机酸， 在从滤液萃取 到丁酯时，则留在水相。如酸性强弱和青霉素相差悬殊的也可以和青霉素分离，- 14 -湖南科技大学本科生毕业设计但对于酸性较青霉素弱的有机酸， 在从丁酯反萃取到水中时， 大部分留在丁酯中。 只有酸性和青霉素相近的有机酸随着青霉素转移，很难除去。杂酸的含量可用污 染数表示，污染数表示丁酯萃取液中杂酸和青霉素含量之比。总酸量可用 NaOH 滴定求得。青霉素含量可用旋光法或碘量法测定，两者之差即表示杂酸含量。 青霉素在酸性条件下极易水解破坏，生成青霉素酸，但要使青霉素在萃取 时转入有机相，又一定要在酸性条件下。这一矛盾要求在萃取时选择合理的 pH 值及适当尝试的酸化液。而从有机相转入水相转入水相中时，由于青霉素在碱 性较强的条件下极易碱解破坏，生成青噻唑酸，但要使青霉素在反萃取时转入 水相，又一定要在碱性较强的条件下。这一矛盾要求在萃取时选择合理 pH 值及 适当浓度的碱性缓冲液。 多级逆流萃取有助于提高青霉素收得率。生产上一般采用二级逆流萃取。浓 缩比选择很重要，因为丁酯的用量与收率和质量都有关系。如果用量太多，虽然 萃取较完全，收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶剂的用量；如果丁酯 用量太少，则萃取不完全，影响收率。发酵滤液与丁酯滤液体积比一般为 (1.5~2)∶1，即一次丁萃取液的浓-缩倍数为 1.5~2 从丁酯相反萃取时为避免 pH 值波动， 常用缓冲液。 可用磷酸盐缓冲液、 碳酸氢钠或碳酸钠溶液等。 反萃取时， 因分配系数之值较大，浓缩倍数可以较高，一般 3~4 倍。从缓冲液再萃取到丁酯 中的二次丁萃取液，浓缩倍数一般为 2~2.5 倍。故几次时共约浓缩 10~12 倍，浓 度已合乎结晶要求。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，因此在二次丁酯萃取 液中加入醋酸钾-乙醇溶液，使青霉素游离酸与高浓度酸钾溶液反应生成青霉素 钾，然后溶解于过量的醋酸钾乙醇溶液中呈浓缩液状态存在于结晶液中，当醋酸 钾加到定量时， 近饱和状态的醋酸钾又起到盐析作用， 使青霉素钾盐结晶析出[7] 。 在一次萃取丁酯中，由于滤液中有大量蛋白质等表面活性物质存在，易发生 乳化，这时可加入去乳化剂。通常用 PPB，加入量为 0.05%~0.1%。关于乳化和 去乳化的机理可简述如下：由于蛋白质的憎水性质，故形成 W/O 型乳浊液，即 在丁酯相乳化，加入 PPB 后由于其亲水性较大，乳浊液发生转型而破坏，同时 使蛋白质表面成为亲水性，而被拉入水相，同时 PPB 是碱性物质，在酸性下留 在水相，这样可使丁酯相含杂质较少。考虑温度对青霉素稳定性的影响，整个萃 取过程应在低温下进行(10℃以下)，各种贮罐都以蛇管或夹层通冷冻盐水冷却， 在保证萃取效率的前提下，尽量缩短操作时间，可减少青霉素的破坏，青霉素不 仅在水溶液中不稳定，而且在丁酯中也被破坏。从实验结果得知青霉素在丁酯中 0~15℃放置 24h 不致损失效价，在室温放置 2h 损失 1.96%，4h 损失 2.32%。 2.1.12 青霉素的精制及烘干 对产品精制、烘干和包装的阶段要符合《药品生产质量管理均由范》(GMP) 的规定。- 15 -湖南科技大学本科生毕业设计⑴ 脱色和去热原质 脱色和去热原质是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。 色素是在发酵过程 中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。热原质是在生产过程中由于被 污染后杂菌所产生的一种内毒素。生产中一般用活性炭脱色去热原质，但需注意 脱色时 pH、温度、活性炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附 问题，否则影响收率。 ⑵ 结晶 抗生素精制常用结晶法来制得高纯度成品。常用的几种结晶方法有： ①改变温度结晶 这一特性来进行结晶。 ②利用等电点结晶 当将某一抗生素溶液的 pH 调到等电点时，它在水溶液 中溶解度最小，则沉淀析出。 ③加成盐剂结晶 能够沉淀结晶。 青霉素钠盐在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性质，再二次醋酸丁酯萃取液 中加入醋酸钠乙醇溶液，并控制温度青霉素钠盐就结晶析出。 醋酸丁酯中含水量过高会影响收率，但可提高晶体纯度。水分在 0.9%以下 对收率影响较小。 得到的晶体要求颗粒均匀， 有一定的细度。 颗粒太细会使过滤、 洗涤困难。晶体经丁醇洗涤，真空干燥即可等到成品。 2.1.13 成品的检验及分包装 青霉素是临床应用药物，使用对象是人，因此要特别注意药品的质量。纯 品得到后应通过全面严格检验才能出厂，检验的项目和标准一律按药典规定。 毒 ⑴ 成品鉴定 成品鉴定是根据药典的要求逐项进行分析，包括效价鉴定、 性试验、无菌检查、热源质试验、水分测定、水溶液酸碱度及混浊度测定、结晶 颗粒的色泽及大小的测定等。对于药典上未有规定的新抗生素，则可参照相近抗 生素，按经验规定一些指标。 ① 酸碱度检测 取本品，加水制成每 1ml 中含 30mg 的溶液，测定。 pH 值应为 5.0 ～7.5 。 加水 5ml 使溶解， 溶液应澄清无色； ② 溶液的澄清度与颜色 取样品 0.3g， 如显浑浊，与浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色标准比色 液比较，均不得更深。 ③ 吸光度 取样品，加水制成每 1ml 中含 1.80mg 的溶液，在 280nm 的波 长处测定吸光度，不得大于 0.10；在 264nm 的波长处有最大吸收，吸光度应为 0.80～0.88。 在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素以盐的形式从溶液中 利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的- 16 -湖南科技大学本科生毕业设计④ 细菌内毒素 0.01EU。取样品测定，每 100 青霉素单位中含内毒素的量应小于无菌取样品，用青霉素酶法灭活后或用适宜溶剂溶解后，转移至不少于 500ml 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理后测定。 ⑤ 效价测定 取本品适量，精密称定，加水溶液并定量稀释制成每 1ml 中 约含 0.5mg 的溶液，摇匀，精密量取 10?l，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取 青霉素对照品适量，同法测定。按外标以峰面积计算，其结果乘以 1.0658，即为 本品效价。每 1mg 相当于 1670 青霉素单位。 以供制剂厂进行小 ⑵ 成品分装 抗生素产品一般分装为大包装的原料药， 包装或制剂加工。也有一些抗生素工厂在无菌条件下用自动分装机进行小瓶分 装。 抗生素一般要求无菌，特别是注射剂更应满足严格无菌要求。因此，成品 分包装必须在无菌或半无菌的场所进行。注射剂则应在无菌条件下用自动分装 机械分装。药品分包装车间的整个生产流程必须纳入 GMP 管理标准，以确保药 品质量。另外钠盐比钾盐容易吸潮，因此包装车间的温度和成品包装条件要求 也高。 2.1.14 销售概况 2008 年进入 6 月后，青霉素工业盐价格出现回落趋势。6 月初青霉素工业 盐报价还在 1101 元/BOU，到了 7 月初已回落到 100 元/BOU。青霉素工业盐 6 月份的出口报价在 15 美元/BOU 左右，但在 7 月初，出口报价已下降到 1314 美 元/BOU。造成价格下滑的直接原因是，国内青霉素工业盐库存量已超过 4000 吨，巨大的库存造成资金大量占用；此外，原本应该进入出口高峰期的青霉素 工业盐却受到印度采购的抵制，也对出口价格产生了一定影响。 经历了 2007 年底青霉素工业盐出口的低迷，2008 年上半年，在基础原材料 涨价、能源供应紧张和环保限产制约等因素的推动下，青霉素工业盐出口价格逐 步恢复反弹，上半年平均出口价为 15.44 美元/公斤，同比仅降低 3.05%，但出口 量依然不大，仅为 6270 吨，同比减少 21.19%。出口市场方面， 2008 年上半年， 我国青霉素工业盐共销往 8 个国家和地区。其中，对印度出口额占全部出口总额 的 88.72%，出口集中度进一步提高。排名第 2 至 5 位的分别为阿联酋、伊朗、 日本、美国。2.2 设计原则⑴ 保证产品质量符合国家标准， 外销产品还必须满足销售地区的质量要求。- 17 -湖南科技大学本科生毕业设计⑵ 尽量采用成熟的，先进的技术和设备。提高原料利用率，提高劳动生产 率，降低水p电p气及其它能耗，降低生产成本，使工厂建成后能尽快投产，在 短期内达到设计生产能力和产品质量要求，并做到产品稳定p安全p可靠。 ⑶ 尽量减少三废排放量，有完善的三废治理措施，以减少或消除对环境的 污染，并做好三废的回收和综合利用。发酵工厂设计还应考虑采用微生物发酵的 工厂的独特要求，既要注意到周围环境的清洁卫生，又要注意对工厂内车间的卫 生p无菌p防火等条件的相互影响。 ⑷ 确保安全生产，以保证人身和设备的安全。 ⑸ 生产过程尽量采用机械化和自动化，实现稳产p高产。2.3 设计规模⑴ 本设计为年产 10000 吨青霉素工厂设计，是利用产黄青霉丝状菌三级发 酵工艺流程，产品为青霉素 G 盐，主要包括青霉素 G 钾盐的生产方法、工艺流 程、主要车间的物料与热量衡算、设备选型、废水处理以及工程概算等内容。 ⑵ 主要技术指标及基础数据 表 2.1指标名称 生产规模 生产方法 单 位 t/a 指 标 10000 数青霉素发酵工艺技术指标指标名称 产品日产量 产品规格 产品纯度 提取总收率 倒罐率 二级种子罐接种量 发酵罐接种量 单 位 t/d u/g % % % % % 指 标 33.33 1.6×106 &96 75.73 0.1 10 20 数通风搅拌发酵， 萃取 结晶提取年生产天数 发酵周期 罐发酵单位 发酵罐装料系数d/a h u/ml %300 190 75000 802.4 原料与产品规格青霉素发酵所使用原料主要是工业葡萄糖、工业淀粉及玉米粉，本厂与同城 相关原料厂长期合作，价格合理，运输方便。所生产青霉素最后在结晶时加入醋 酸钾使青霉素 G 以青霉素钾盐析出，出厂产品主要是工业用青霉素钾盐。2.5 供电⑴ 供电系统 ①. 生物制药生产工艺对电力的特殊要求:生物制药行业是一 个特殊行业，必须连续生产。生产工艺设备不仅对电源的电压、频率要求稳定， 还应该保证在连续生产周期中电力不能中断，这就要求有一个可靠的供电系统。- 18 -湖南科技大学本科生毕业设计②. 电力负荷分类和对供电的基本要求：电力网上用电设备所消耗的功率称 为电力负荷。按其重要性及对供电可靠性的要求，电力负荷可分为一下 3 类。第 一类，中断供电会造成人身伤害及重大经济损失，损坏重要设备，破坏生产工艺 工程，使生产长期不能恢复或产生大量废品。第二类，中断供电会造成经济较大 损失，损坏生产设备，产品大量减产，停顿较长时间才能恢复生产。第三类，除 上述两类外的一般负荷，均为第三类负荷，如一般的辅助车间及照明负荷等。 根据上述电力负荷性质及分类， 对供电提出如下要求。 第一类供电负荷： ⑵ 根据上述电力负荷性质及分类， 对供电提出如下要求。 要求使用两个独立的电源供电，当其中一个电源发生事故或因抢修而停电时，不 至于影响另一个电源继续供电，必须时再加备应急电源(发电机，UPS 电源)以保 证供电的连续性。第二类供电负荷：要求采用双回路供电，即由两条线路供电， 在条件下允许采用双回路时，可采用专用线路。第三类供电负荷：供电无特殊要 求，这类用电设备供电中断时影响较小，但在不增加投资情况下也应尽可能提供 供电的可能性。 生物制药行业一般列为一、二类供电负荷，故投资较大。采用双回路两个独 立电源，再设置 1 台备用发电机，以备急用。部分用电设备应配 UPS 电源(单相 或三相)。以保证产品质量及设备安全。 ⑶ 供电方式 生物制药行业的供电，应考虑供电的可靠性。采用双回路供 电的变电站电源进线为 6~10kV，降为 380V/220V。当一回路进线断电或变压器 故障，检修时可采用联络开关使重要负荷保持供电。低 压 柜应急配电屏母 线 桥变 压 器高压隔离柜母 联 柜变 压 器图 2.3 特殊设备的特殊电设施: ⑷.特殊设备的特殊电设施 特殊设备的特殊电设施 房无照明影响安全。一般工厂企业配电车间示意图 ① 应急照明灯、 出入口安全标志灯。 这些照明设施应安装到应急配电盘或采用配电池的应急照明， 市电停电时不至于因洁净厂 ② 生物制药厂房有时会因停电引起病毒或有毒气体泄露等， 造成安全事故。 有的设备因停电而不能降温以致烧坏等，这些设备出电源接在应急配电盘供电- 19 -湖南科技大学本科生毕业设计外，还应在线路上配接足够功率的 UPS 电源。一般考虑 UPS 电源应至少维持 30min 以上，使电气人员能有时间切换起用另一备用回路电源。- 20 -湖南科技大学本科生毕业设计第三章 总平面布置说明3.1 工厂总平面布置设计原则[3]⑴ 满足生产要求，工艺流程合理 两种： ① 按功能划分厂区，即将工厂的各部门按生产性质、卫生，防火与运输要 求的相似性，将工厂划分为若干功能区段。如中、大型机械工厂的厂区，可划分 为加工装配区，备料(热加工)区，动力区、仓库设施区及厂前区等。这种布置模 式的优点是各区域功能明确，相互干扰少，环境条件好，但是，这种布置模式难 以完全满足工艺流程和物流合理化的要求。 ② 采用系统布置设计模式，即按各部门之间物流与非物流相互关系的密切 程度进行系统布置，因此可以避免物料搬运的往返交叉，节省搬运时间与费用。 ⑵ 适应工厂内外运输要求，线路短捷顺直 工厂总平面布置要与工厂内部 运输方式相适应。根据生产产品产量特点，可以采用铁路运输、道路运输、带式 运输或管道运输等。根据选定的运输方式，运输设备及技术要求等，合理地确定 运输线路及与之有关的部门的位置。 厂内道路承担着物料运输，人流输送，消防通行的任务，还具有划分厂区的 功能；道路系统的布局对厂区绿化、美化，排水设施布置，工程管线铺设，也有 重大影响。 工厂内部运输方式，道路布局等应与厂外运输方式相适应，这也是工厂总平 面布置应给予重视的问题。 ⑶ 合理用地、节约用地是我国的一项基本国策。工业企业建设中，在确保 生产和安全的前提下，应尽量合理地节约建设用地。在工厂总平面布置时可以采 取如下措施： ① 根据运输、防火、安全，卫生、绿化等要求，台理确定通道宽度以及各 部门建筑物之间的距离，力求总体布局紧凑合理。 ② 在满足生产工艺要求的前提下，将联系密切的生产厂房进行合并，建成 联合厂房。此外，可以采用多层建筑或适宜的建筑物外形。 ③ 适当预留发展用地。 ⑷ 充分注意防火、防爆、防振与防噪声 安全生产是工厂布局首先要考虑的问题，在某些危险部门之间应留出适当 的防火、防爆间距。 振动会影响精密作业车间的生产，因此精密车间必须远离振源或采用必要 的隔振措施。如机械厂的精加工车间及计量部门应远离锻造车间或冲压车间。- 21 -工厂总体布局应满足生产要求，符合工艺过程，减少物流量，同时重视各部门之间的-关系密切程度。具体布置模式有湖南科技大学本科生毕业设计噪声不仅影响工作，而且还会摧残人的 身体健康。因此，在工厂总平面布 置时要考虑防噪声问题，一是可以采取隔音措施，降低噪声源发出的噪声级；二 是可以采取使人员多的部门远离噪声源的方法。 ⑸ 利用风象、朝向的自然条件，减小环境污染生产中产生的有害烟雾和粉 尘会严重影响工作人员的身体健康， 并会造成环境污染。 进行工厂总平面布置前， 必须了解当地.全年各季节风向的分布和变化转换规律，绘制成风象图，拽出全 年占优势的盛行风向及最小风频风向。如我国北方大部分地区春夏季盛行东南 风，秋冬季盛行西北风。散发有害烟雾或粉尘的车间，应分布在两盛行风向间的 最小频风向的上风侧。 另外，建筑物的朝向也是工厂总平面布置时应注意的问题，特别是对日照、 采光和自然通风要求较高的建筑物，更应注意这个问题。 ⑹ 充分利用地形、地貌、地质条件。 ⑺ 考虑建筑群体的空间组织和造型，注意美学效果。 ⑻ 虑建筑施工的便利条件。3.2 车间布置设计原则⑴ 定设备布置形式根据车间的生产纲领，分析产品―产量关系，从而确定 生产类型是大量生产、成批生产还是单件生产，由此决定车间设备布置形式是 采用流水线式，成组单元式还是机群式。 ⑵ 足工艺流程要求车间布置应保证工艺流程顺畅，物料搬运方便，减少或 避免往返交叉物流现象。 ⑶ 实行定置管理，工作环境整洁，安全.对车间布置时除对主要生产设备安 排适当位置外，还需对其它所有组成部分包括在制品暂存地，废品废料存放地， 检验试验用地、工人工作地，通道及辅助部门如办公室，生活卫生设施等安排 出合理的位置，确保工作环境整洁及生产安全。 ⑷ 选择适当的建筑形式 根据工艺流程要求及产品特点，配备适当等级的 起重运输设备，进一步确定建筑物高度、跨度、拄距及形状。 ⑸ 光、照明、通风，采暖、防尘、防噪声。 ⑹ 具备适当的柔性，适应生产的变化。[2]- 22 -湖南科技大学本科生毕业设计第四章 工艺设计与计算4.1 发酵生产工艺4.1.1 丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管(25°C，孢子培养，7 天)→ 斜面母瓶(25°C，孢子培养，7 天)→ 大米 孢子(26°C，种子培养 56h， 1∶1.5vvm)→ 一级种子培养液(27°C，种子培养，24h， 1∶1.5vvm)→ 二级种子培养液(27~26°C，发酵，7 天，1∶0.95vvm) → 发酵液。 4.1.2 工艺控制 影响发酵产率的因素 ⑴ 质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系 产生阻遏(或抑制)或对菌丝生长产生抑制(如葡萄糖的阻遏或抑制， 苯乙酸对生 为了避免这一现象， 长的抑制)， 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成， 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用 的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。 这里必须特别注意的是葡萄糖的流 加 ， 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动，都将引起严重的阻遏或限制 ， 使生物合成速度减慢或停止。目前，糖浓度的检测尚难在线进行，故葡萄糖的流 加不是依据糖浓度控制，而是间接根据 pH 值、溶氧或 CO2 释放率予以调节。 但一般认 ⑵ 温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别， 为应在 25 °C 左右。 温度过高将明显降低发酵产率， 同时增加葡萄糖的维持消耗， 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度不是一 样的，一般前者略高于后者，故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度， 以缩短生长时间，到达生产阶段后便适当降低温度以利于青霉素的合成。 ⑶ pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6.5 左右，有时也可以略高或 略低一些，但应尽量避免 pH 值超过 7.0，因为青霉素在碱性条件下不稳定，容 易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中，pH 值的变化是葡萄糖流加速度高 低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低；过低的加糖 速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合 物而引起 pH 值上升。 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要 ⑷ 溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说， 因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时，青霉素产率急剧下降，低于 10% 饱 和度时， 则造成不可逆的损害。 溶氧浓度过高， 说明菌丝生长不良或加糖率过低， 造成呼吸强度下降，同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一 个动态平衡点，而氧消耗与碳能源消耗成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加 控制的一个参考指标。- 23 -湖南科技大学本科生毕业设计⑸ 菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度，从而使 氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体 浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小，维持因数越大，呼吸强度越 高)、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发 酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏度低的发酵液使发酵中 的传氧速率上升，从而提高临界菌体浓度。 ⑹ 菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条 件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生 长速率低于 0.015h-1 时，比生产速率与比生长速率成正比，当比生长速率高于 0.015h-1 时，比生产速率与比生长速率无关。因此，要在发酵过程中达到并维持 最大比生产速率，必须使比生长速率不低 0.015h-1。这一比生长速率称为临界比 生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说，维持 0.015 h-1 的临界比生长速 率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍，这在实际工业生产中是很 难实现的。事实上，青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论 临界值低得多，却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料 分批发酵过程不断有部分菌丝自溶，抵消了一部分生长，故虽然表观比生长速 率低， 但真比生长速率却要高一些。 ⑺ 菌丝形态 在长期的菌株改良中，青霉素产生菌在沉没培养中分化为主 要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中 的基质及氧接触，故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低， 使气-液两相间氧的传递速率大大提高，从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体 浓度较高)，发酵罐体积产率甚至高于前者。 在丝状菌发酵中，控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度，并避免结球， 是获得高产的关键要素之一。 而在球状菌发酵中， 使菌丝球保持适当大小和松紧， 并尽量减少游离菌丝的含量，也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态 的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。 4.1.3 工艺控制要点 ⑴ 子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、 葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 ℃培养 7 天。真空干燥并以这种形 式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的 种子罐内， ℃培养 56h 左右， 26 菌丝浓度达 6%~8%， 菌丝形态正常， 10%~15% 按 的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内，27℃培养 24h，菌丝 体积 10%~12%，形态正常，效价在 700D/ml 左右便可作为发酵种子。 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有 0.5%~1.0 %玉米浆的三角瓶培 养原始亲米孢子，然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子(又称生产米)，亲米和生- 24 -湖南科技大学本科生毕业设计产米均为 25℃静置培养，需经常观察生长发育情况在培养到 3~4 天。大米表面 长出明显小集落时要振摇均匀，使菌丝在大米表面能均匀生长，待 10 天左右形 成绿色孢子即可收获。 亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培 养，生产米的孢子量要求每粒米 300 万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 ℃冰箱内。 工艺要求将新鲜的生产米(指收获后的孢瓶在 10 天以内使用) 接人含有花生 饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内，28℃ 培养 50~60h 当 pH 值 由 6.0~6.5 下降至 5.5~5.0，菌丝呈菊花团状，平均直径在 100~130?m。每毫升 的球数为 6 万~-8 万只， 沉降率在 85% 以上，即可根据发酵罐球数控制在
只/ml 范围的要求，计算移种体积，然后接入发酵罐，多余的种子 液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳，其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素 发酵单位的罐批差异减少。 ⑵ 养基成分的控制 ①碳源 加。 ②氮源 氮源常选用玉米浆、 精制棉籽饼粉、 麸皮， 并补加无机氮源(硫酸氨、 氨水或尿素)。 ③前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G，需在发酵液中加人前体。前体 可用苯乙酸、苯乙酰胺， 一次加入量不大于 0.1%，并采用多次加入，以防止前 体对青霉素的毒害。 ④无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等， 且用量要适度。另外， 由于铁离子对青霉菌有毒害作用，必须严格控制铁离子的浓度，一般控制在 30 ?g/ml 。 ⑶ 发酵培养的控制 ①加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程 中的 pH 值确定，最好是根据排气中 CO2 量及 O2 量来控制，一般在残糖降至 0.6% 左右，pH 值上升时开始加糖。 ②补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氨氮控制在 0.01%-0.05%，补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。 ③pH 值控制 对 pH 值的要求视不同菌种而异，一般为 pH 6.4~6.8，可以 补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制 pH 值。 ④温度控制 前 25~26℃，后期 23℃，以减少后期发酵液中青霉素的降解破 坏。 ⑤溶解氧的控制一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的 30% 。通风 比一般为 1 : 0. 8L/(L ? min)，搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡 萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液(DE 值 50% 以上)进行流- 25 -湖南科技大学本科生毕业设计⑥泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉 米油等或用化学合成消泡剂 “泡敌” 来消泡， 应当控制其用量并要少量多次加入， 尤其在发酵前期不宜多用，否则会影响菌体的呼吸代谢。 ⑦发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样， 用显微镜观察菌丝形 态变化来控制发酵。生产上惯称“镜检”，根据“镜检”中菌丝形变化和代谢变 化的其他指标调节发酵温度，通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时 间， 以获得最多青霉素。 当菌丝中空泡扩大、 增多及延伸， 并出现个别自溶细胞， 这表示菌丝趋向衰老，青霉素分泌逐渐停止，菌丝形态上即将进入自溶期，在此 时期由于茵丝自溶，游离氨释放，pH 值上升，导致青霉素产量下降，使色素、 溶解和胶状杂质增多，并使发酵液变蒙古稠，增加下一步提纯时过滤的困难。因 此，生产上根据“镜检”判断，在自溶期即将来临之际，迅速停止发酵，立刻放 罐，将发酵液迅速送往提炼工段。4.2 青霉素提炼⑴青霉素提炼工艺流程图：发酵液→预处理液→板框过滤→滤液→储罐 →BA 提取→脱色→过滤→BA 脱色液→结晶→离心分离→含１％水重液回收溶 媒的异丙醇洗涤→甩滤→无水异丙醇洗涤→甩干→摇摆机粉碎→烘干→工业钾 盐成品[7]4.3 工艺计算4.3.1 物料衡算 物料衡算的意义：在发酵生产和其他化工生产中，物料衡算是指：根据质 量守衡定律，凡引入某一统或设备的物料重量 Gm，必等于所得到的产物重量 Gp 和物料损失 Gt 之和，即： Gm = Gp + Gt????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.1) 这一运算法则，既适用与每一个单元操作过程，也适用于整个生产过程；既 可进行总物料衡算，也可对混合物中某一组分物料衡算。 通过物料平衡计算，可以求出引入和离开设备的物料(包括原料、中间体和 成品等)各组分的成分、重量和体积，进而计算产品的原料消耗定额、每日或每 年消耗量以及成品、副产物、废物等排出物料量。 ⑴ 培养基的配置 ①斜面、分离培养基(g/L)：葡萄糖 60，酵母偻 20，蛋白胨 10，琼脂 10，纯 化水配制，pH 70~7.2. ②种子培养基(g/L)：葡萄糖 5，蔗糖 60，玉米浆 20，花生饼粉 15，硫酸铵 10，轻质碳酸钙 5，纯化水配制，pH:6.2~6.4。- 26 -湖南科技大学本科生毕业设计③发酵培养基 (g/L)：葡萄糖 10，淀粉 30，玉米浆 50，花生饼粉 10， MgSO4?7H2O1， CuSO4?5H2O 0.02， MnSO4?H2O 0.01， FeSO4?7H2O 0.2， ZnSO4?7H2O 0.01，(NH 4 ) 2 SO 4 10，KH 2 PO 4 5，轻质碳酸钙 5，豆油 0.06，纯化水配制， pH:6.0~6.2[3]⑵ 生产 1000kg 青霉素所需原发酵液中含青霉素量的计算 青霉素的放罐效价为 75000u/ml， 1000u 青霉素的的重量为 0.627mg。 则每 ml 发酵液质量为：5×0.627＝31.35mg/ml ①洗涤分离过程：收率为 99%，其淋洗前的青霉素的量为： 10.10kg。将湿晶体放入洗涤罐，用丁醇(4~6L/10 亿单位)洗涤两次， 用乙酸乙酯(2L/10 亿单位)顶洗，甩干挖晶。 表 4.1淋洗之前青霉素的量 1010.10kg淋洗前后青霉素的量淋洗之后青霉素的量 1000kg 收率 99%②结晶过程：收率为 96%，那么结晶前的量为：%=1052.19kg。 加等体积的丁醇，减压共沸蒸馏脱水，温度 16~26℃，压力 0.67~1.3kPa，结晶后 静置养品一段时间后甩滤。 表 4.2结晶前青霉素的量 1052.19kg结晶前青霉素的量结晶后青霉素的量 1010.10kg 收率 96%③BA 提取过程：收率为 83%，那么经板框过滤出的滤液中青霉素的量为： %=1267.70kg。BA 提取分为一次 BA 提取和二次 BA 提取，首先将滤 液加入 1/3(体积比)BA，加 5%(质量浓度)PPB，用 10%硫酸调 pH2.0~2.2，逆流 萃取后以卧式离心机分离得一次 BA 萃取液， 然后以碳酸氢钠在 pH 值为 6.8~7.4 条件下将青霉素从 BA 中萃取到缓冲液中，再用 10%的硫酸溶液调 pH2.0~2.2 ， 将青霉素从缓冲液中再次转入到 BA 中，得二次 BA 萃取液。在二次 BA 萃取液 中加入活性炭(150~300g/10 亿单位)脱色，最后用石棉过滤板、绸布、微孔膜过 滤。 表 4.3萃取之前青霉素的量 1267.70kg萃取前后青霉素的量萃取之青霉素的量 1052.19kg 收率 83%预 处 理 及 过 滤 过 程 ： 收 率 为 96% ， 发 酵 液 中 青 霉 素 的 量 为 ： %=1320.52kg。发酵液放罐后需冷却至 10℃后，经鼓式真空过滤机过 滤。从鼓式真空过滤机得到青霉素滤液 pH 值在 6.2~7.2，蛋白质含量一般在 0.005%~0.2%。这些蛋白质的存在对后面提取有很大影响，必须加以除去。除去 蛋白质通常采用 10%硫酸调节 pH4.5~5.0.加入 0.05%(质量分数)左右的 PPB 的方- 27 -湖南科技大学本科生毕业设计法，同时再加入 0.7%硅藻土作助滤剂，再通过板框机过滤。经过第二次过滤的 滤液一般澄清透明，可进行萃取。 表 4.4 过滤前后青霉素的量过滤之前青霉素的量 1320.52 kg 过滤之后青霉素的量 1267.70kg 收率 96%则所需发 生产 1000kg 青霉素需放罐后发酵液中所含青霉素量为 1320.52kg， 酵液的体积为：1320.52÷(31.35×1×10 6÷1×10 6 )＝42.12m3 从一级种子罐到二级种子罐的接种量为 10%，发酵罐的接种量为 20% 发酵罐中各物质的计算： ⑶ 发酵罐中各物质的计算： 葡萄糖：42.12m 3 ×10g/L=421.2kg 淀粉：42.12m 3 ×30g/L=1263.6kg 玉米浆：42.12m 3 ×50g/L=2106kg 花生饼粉： 42.12 m 3 ×10 g/L=421.2kg MgSO 4 ?7H 2 O：42.12m 3 ×1 g/L =42.12kg (NH 4 )2SO 4 ：42.12m 3 ×10g/L=421.2kg CuSO 4 ?5H 2 O：42.12m 3 ×0.02 g/L=0.84kg MnSO 4 ?H2 O：42.12×0.01 g/L=0.42kg FeSO 4 ?7H 2O：42.12m 3 ×0.2 g/L=8.42g ZnSO 4 ?7H 2 O：42.12m 3×0.01 g/L=0.42kg KH 2 PO 4：42.12m 3 ×5 g/L=210.6kg 轻质碳酸钙：42.12m 3 ×5 g/L=210.6kg 豆油：42.12m 3 ×0.06 g/L=2.53kg 种子罐(二级 各物质计算： 二级)各物质计算 ⑷ 种子罐 二级 各物质计算 ： 葡萄糖：8.424 m3×5 g/L=42.12kg 蔗糖：8.424m3×60 g/L=505.44kg 玉米浆：8.424m3×20 g/L=168.48kg 花生饼粉：8.424m3×15 g/L=126.36kg (NH4)2SO4：5.85m3×10 g/L=84.24kg 轻质碳酸钙：8.424m3×5 g/L=42.12kg 豆油：8.424m3×0.06 g/L=0.51kg 种子罐(一级种子罐 一级种子罐)各物质计算 ⑸ 种子罐 一级种子罐 各物质计算 葡萄糖：0. g/L=4.21kg 蔗糖：0. g/L=50.54kg 玉米浆 0. g/L=16.85kg 花生饼粉：0. g/L=12.64kg- 28 -湖南科技大学本科生毕业设计(NH4)2SO4：0. g/L=8.42kg 轻质碳酸钙：0. g/L=4.21kg 豆油：0..06 g/L=0.05kg 通过上述计算得出生产 1000kg 青霉素发酵罐各物质成分的消耗量， 见表 4.5. 表 4.5成分 葡萄糖 蔗糖 淀粉 玉米浆 花生饼粉 (NH 4 ) 2 SO 4 MgSO 4 ?7H 2 O MnSO 4 ?H 2 O CuSO 4 ?5H 2 O FeSO 4 ?7H 2 O ZnSO 4 ?7H 2 O KH 2 PO 4 轻质碳酸钙 豆油生产 1000kg 青霉素发酵罐各物质成分表发酵罐 421.2kg ―― 1263.6kg 2106kg 421.2kg 42.12kg 421.2kg 0.84kg 0.42kg 8.42kg 0.42kg 210.6kg 210.6kg 2.53kg 二级种子罐 42.12kg 505.44kg ―― 168.48kg 126.36kg 84.24kg ―― ―― ―― ―― ―― ―― 42.12kg 0.51kg 一级种子罐 4.21kg 50.54kg ―― 16.85kg 12.64kg 8.42kg ―― ―― ―― ―― ―― ―― 4.21kg 0.05kg 总量 46.33kg 555.98kg 1263.6kg 2291.33kg 560.2kg 134.78kg 421.2kg 0.84kg 0.42kg 8.42kg 0.42kg 210.6kg 256.93kg 3.09kg⑹ 生产 1000kg 青霉素需无菌压缩空气用量计算 空气中附着在尘埃上 ①无菌空气的制备原理及简单过程 微生物体积很小， 的微生物大小为 0.5~5?m。 过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上 的微生物。其原理在于空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降，同时惯性 碰撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒，颗粒接触介 质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。惯性碰撞截留 起主要作用，另外静电引力也有一定作用。 无菌空气的制备一般是把吸入的空气先经过压缩机前的过滤器过滤， 再进入 空气压缩机， 从空气压缩机出来的空气(一般压力在 1.96×105Pa 以上， 温度 120～ 150℃)，再冷却到 25℃，最后通过总过滤器和分过滤器除菌，从而获得洁净度、 压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。具有一定压力的无菌空气可以克服在 预处理、过滤除菌及有关设备、管道、阀门汇总的压力损失，并在培养过程中能 够使发酵罐维持一定的罐压。 因此，过滤除菌的流程必须有供气设备―空气压缩机，对空气提供足够的能 量，同时还要具有高效的过滤除菌设备以除去空气中的微生物颗粒。要保持过滤- 29 -湖南科技大学本科生毕业设计器在比较高的效率下进行过滤，并维持一定的气流速度和不受油、水的干扰，则 要有一系列的加热、冷却及分离和除杂设备来保证。 ②空气预处理与设备 采风塔： 在工厂的上风头， 高度一般在 20m 左右， 设计流速 8m/s。可建在空压机的屋顶上。 粗过滤器：安装在空压机吸入口前，前置过滤器。作用是截留空气中较大 的灰尘，保护压缩机，减轻总过滤器的负担，也能起到一定除菌作用。介质为 泡沫塑料(平板式)或无纺布(折叠式)，流速 0.1－0.5 m/s。要求是阻力小，容灰量 大。 空气压缩机：作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空 压机。 空气贮罐：消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。螺杆和涡轮式提供均 匀连续空气可省去。设置在空压站附近。 冷却器：空气压缩机出口气温一般在 120℃，必需冷却。在潮湿季节，除湿。 空气冷却器的传热系数为 105W/(m2?℃)。采用双程或四程结构，两级串联使用。 第一级循环水冷却，第二级低温水(9℃)冷却。设置在发酵车间外。压缩空气每 经过 1m 管道，温度下降 0.5～1.0℃。 ③油水分离与设备：气液分离设备：除去空气中油和水，保护过滤介质。 油水分离与设备： 旋风分离器和丝网除沫器两类。 旋风分离器，利用离心沉降原理。结构简单，阻力小，分离效率高。压缩 空气的速度 15～25m/s，切线方向进入旋风分离器，在环隙内做圆周运动，水滴 或固体颗粒被甩向器壁，而收集。完全除去 20?m 以上离子，对 10?m 离子的分 离效率为 60～70%。 丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对 1?m 以上的雾滴除去率 98%。 空气加热设备：空气相对湿度仍然为 100%，需要降到 70%以下，才能进入 空气过滤器。列管式换热器，空气走管程，蒸汽走壳程。套夹式加热器，空气走 管程，蒸汽走夹套 要求除菌效率高， 耐受高温高压， 不易被油水污染， ④空气过滤介质与设备： 空气过滤介质与设备： 阻力小，成本低，易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、超细比例纤维 纸、石棉滤板等。 纤维及颗粒介质过滤器：圆筒形，直径 2.5～3m。孔径 10～15mm。空气从 下方进入， 上方引出。 常用介质棉花、 玻璃纤维、 活性炭等。 空气流速 0.2～0.3m/s。 可作为总过滤器。 总过滤器每月灭菌一次。 应该有备用过滤器， 灭菌时交换使用。 实验室采用一级过滤器， 生产规模设置二、 三级过滤器， 第一级为总过滤器， 二、三级为分过滤器。- 30 -湖南科技大学本科生毕业设计空气净化的一般流程如下： 空气吸入口→粗过 ⑤空气过滤除菌的工艺流程 空气净化的一般流程如下： 滤器→空气压缩机→空气储罐→一级空气冷却器→二级空气冷却器→分水器→ 旋风分离器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤器→分空气过滤器→无菌 空气。如图 4.1 Q=Q t +Q yst ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.2) 空 旋 加 二 一 气 级 热 级 风 冷 冷 分 贮 器 1 罐 离 却 却 压缩空气 器 器 器进 发 酵 罐器精 过 滤过滤 3器 过 滤分 总无菌空气 1器 锅 炉 房滤过过滤 1蒸 汽 过 滤-器图 4.1 生 无菌空气 空气 →空气净化流程图 如图 4.2 压缩 → ↓ 菌 菌 → 图 计 空气 的 本 ：42.12m3 如 ： 。 过滤除菌 ↓-----------------------------------------------------------------------↓ 罐→ 工艺技 1 的 生 1000kg 的 ：0.8424m3 t/a 工 罐 →↓ 罐 图 4.2 工艺技 无菌空气- 31 -湖南科技大学本科生毕业设计发酵时间为：130h； 发酵周期(含清洗、灭菌等)：190h； 发酵罐容积：500 m3； 发酵罐装料系数：80%； 发酵罐个数：20 个。 发酵过程无菌空气用量计算 发酵车间无菌空气消耗量主要用于产黄青霉丝状菌发酵过程通风供气， 其次 为种子培养的通气以及培养基压料输送也需要压缩空气。此外，因设备和管件等 的消毒吹干以及其他损耗构成无菌空气的耗用量。 单罐发酵无菌空气耗用量 根据资料可知枯草杆菌发酵常用的搅拌转速与通气量的关系如表 4.6： 表 4.6指标名称 发酵罐容量(m3) 搅拌转速(r/min) 通气速率(vvm) 20 130 0.25-0.28 50 110 0.20-0.25 100 100 0.15-0.18青霉素发酵常用的搅拌转速与通气量 青霉素发酵常用的搅拌转速与通气量指标数 150 95 0.12-0.15 200 90 0.10-0.12 250 85 0.07-0.10 500 80 0.05-0.07根据表可知，500 m3 规模的通气搅拌发酵罐的通气速率为 0.05-0.07 vvm,取 最高值 0.07vvm 进行计算。 单罐发酵过程用气量(常压空气) ⑴ 单罐发酵过程用气量 V=500×80%×0.07×30=840m3/h ⑵ 单罐年用气量 Va=V×130=1.1×106m3 式中 30―每年单罐发酵批次 190―发酵时间 种子培养等其他无菌空气耗量 二级种培养是在种子罐中进行的，可根据接种量、通气速率、培养时间等进 行计算。但通常的设计习惯，是把种子培养用气、培养基压送及管路损失等算作 一次，一般取这些无菌空气消耗量之和约等于发酵过程空气耗量的 25%。 故这项无菌空气耗量为： V′=25%V=25%×840 =210m3/h 每罐每年用气量为： Va′= V′×60 =210×60=1.26×104 m3/a 发酵车间高峰无菌空气消耗量 Vmax= 20×(V+V′)=20×(840+210)=1050 m3/h- 32 -湖南科技大学本科生毕业设计发酵车间无菌空气年耗量 Vt=20×(Va+ Va′) =20×(1.1×106+1.29×104 )=1./a 发酵车间无菌空气单耗 根据设计，实际青霉素年产量为： G=1×104t/a 故发酵车间无菌空气单耗为： Vo= Vt/G=1.×104=111.26m3/t 1 万 t/a 青霉素工厂无菌空气用量衡算表 根据上述计算结果，可得出 1 万 t/a 青霉素工厂无菌空气用量衡算表，如下 所示： 表 4.7发酵罐容积 (m3) 500 单罐通气量 (m3/h) 840发酵车间无菌空气衡算表量 (m3/h) 210 高峰空气耗量 (m3/h) 1050 年空气耗量 (m3) 1. 空气单耗 (m3/t) 111.26种子培养耗气4.3.2 能量衡算 ⑴ 耗冷量计算 发酵工厂耗冷量分为工艺耗冷量 (Q1)和非工艺耗冷量(Qnt)，而工艺耗冷量又包含了发酵培养基和发酵罐的冷却降温耗冷，生物反应 热(发酵热)等；非工艺耗冷量则包括维护结构耗冷量、用电设备运输放热耗冷量 等。具体的公式如下： 其中Qt = Q1 + Q2， 1 为培养基等物料和发酵罐体冷却至操作温度的耗冷量， Q由于发酵液的温度是要求一直维持在 25℃，发酵过程消毒是实消，消毒后温度 是 120℃，要通入冷却水，将其冷却至 25℃，即 Q1 = Q培养基 + Q罐体 = 4.09 × 400 ×1050 × (120 ? 25 ) + 0.836 × 1.5 × 7800 × (120 ? 25 ) = 1.641×108 kJ ⑵ 发酵热计算 通气发酵过程热量计算常用的计算方法有三种，一是通过 冷却水带走的热量计算；二是通过发酵液温度升高测定计算；三是应用生物合成 热的方法进行计算。前两种方法是通过试验测定结果推算，第三种方法则是半理 论计算法。 据理论分析，发酵热可用下式计算: Q2=Qb+Qst-Qτ(kJ/h)蒸汽过滤??????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.3)- 33 -湖南科技大学本科生毕业设计式中，Qb 为生物合成热，包括微生物细胞呼吸放热 Q b ′ 和发酵放热 Q b ″ 两部 分，即:Qb =аQb′+βQb〃 (kJ/h)????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.4)其中， Q b ′ ──15651kJ/kg (对葡萄糖)Q b ″ ──4953 kJ/kg (对葡萄糖)а和β分别为细胞呼吸和发酵耗糖量(kJ/h)；а取 12% ，β取 85% 。 而机械搅拌产生的热量为 Q st =3600P st ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.5) 式中， η──搅拌功热转换系数，为 0.92 Pst──搅拌轴功率 (kW) 而 Qε为排气使发酵液水分汽化带出的热焓。根据经验，Q = 0.2Qb kJ / h εt ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.6)由前面计算可知，花生饼粉+玉米浆+淀粉+葡萄糖+豆油 =292.5+.5+292.5 +1.755=kg 由于微生物对葡萄糖、玉米浆、 豆油等的细胞呼吸放热 Qb ′ 和发酵放热 Q b ″ 两部分现阶段并不清楚，因此本设计 的发酵热只可以根据一些试验数据和现在国内一些生产厂家中试测得的试验数 据取细胞对发酵液呼吸放热 Q b ′ 为 17500kJ/kg，发酵放热 Q b ″ 为 5500kJ/kg。 由此可以得出 ： Q b =
× (17500 + 5500) = 6.732 ×10 7kj/h 设备选型计算中有：Pst=1250kWQst = 3600 × 0.92 × 1250 = 4.14 × 10 6 (kJ / h) Qε = 0.2Qb = 0.2 × 6.732 × 10 7 = 1.3464 × 10 7 kJ / h因为所选发酵罐为 500 m3， 发酵液为 500×0.8=400 m3， 所以以每个发酵罐为 单位算发酵热为：Q2 = 6.732 ×107 × 400 1 400 1 × + 4.14 ×106 ? 1.3464 ×107 × × = 3.0687 ×107 kJ / h 29.25 24 29.25 24⑶ 非工艺耗冷量的计算 本设计中非工艺耗冷量分为两个部分：照明及用 电设备放热量和电机运转耗冷量。Qyst =Q 3+Q 4 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(4.7)- 34 -湖南科技大学本科生毕业设计其中 Q3 为照明及用电设备放热量， Q4 为电机运转耗冷量。 车间照明耗冷量可根据下式计算： 3=qF?????????????????????????????????????????????????????(4.8) Q 其中， 为冷间单位面积照明放热耗冷量。 q 通常， 车间的照明标准为 10W/m3， 同时使用系数取 0.6，则： q1 = 10×0.6×3600 = 21600[J/(m2?h)]=21.6[kJ/(m2?h)] F──为冷间面积(m2) 发酵车间中的冷间主要是种子室和控制室，取 F = 12 m2 那么 Q3 = 12 × 21.6＝259.2(kJ / h) 电机运转耗冷量可根据下式计算：Q4 = 3600 ε?????????????????????????????????(4.9) ηP式中 P ──电机设备功率 (kW) 由设备选型中知 P = 1250(kW) ε ε η──搅拌功热转换系数，为 0.92，代入式(4.9)得：Q4 = 3600 × 1250 × 0.92 = 4.14 × 106 kJ / h由此可得出： 4.2.3 其他衡算Qnt = Q3 + Q4 = 259.2 + 4.14 × 106 = 4.1402592 × 106 KJ⑴ 无菌空气量的计算 空气的温度保持在 40～50℃，总空压 0.18MPa，发 酵培养流速为 1∶0.8vvm，种子培养中空气流速为 1∶1.5vvm (vvm 为单位时间 单位体积培养基中通入标况下的空气的体积)。 发酵罐中培养基体积为 29.25m3， 发酵时间是 190 h。 发酵罐： 流速为 0.8vvm， 空气用量 V 大=空气流速×培养基体积×发酵时间=0.8×400×190=/min 中罐：流速为 1.5vvm，培养基的体积是 100m3，培养时间是 24 h。 V 中=1.5×80×24=210.6m3/min 小罐：流速为 1.5vvm，培养基的体积是 0.585m3，培养时间是 56 h。 V 小=1.5×8×56=21.06m3/min 每年所需无菌空气总量： 总=(0.6+21.06)×60×20×300/7=2.406×108 V m3 ⑵ 水的用量 工厂用水包括洗罐水、萃取用水、培养基用水和其他用水。 M 总 = M 洗罐 + M 萃取 + M 培养基 + M 其他 = 61136.9 +
+ 65000 + 1142857 = kg / d = 2152.59t / d- 35 -湖南科技大学本科生毕业设计其中洗罐用水按原料与水的比为 100∶450 计算，萃取用水按获得青霉素量 与水比为 1∶10 计算，其他用水包括在大罐中补料时的加水，本设计一次补水用 量大概是 5～6 t 左右。于补水在每次发酵工艺工程中的用量不是个恒定的用量， 因此补水量不能完全的确定。再有就是冷却用水(其中还包括无菌空气的冷却)， 工厂的循环用水，生活卫生用水等。根据现在国内生产的 情况来看一天用水量 在 60～65 t 左右。 实消过程中是用蒸汽将 ⑶ 蒸汽耗量 本设计所需蒸汽为发酵罐实消过程。 培养基加热到 120℃，并保持 30℃分钟 实罐灭菌应注意以下事项 ①灭菌前罐内均需用高压水清洗，清除堆积物。 ②灭菌时要保证各路进气畅通及罐内培养基翻腾激烈。要控制好温度和压 力，严防高温、高压闷罐，否则容易造成培养基成分破坏和 pH 的升高。灭菌时 总蒸汽压力要求不低于(3.0~3.5)×105Pa(绝压)，是用压力不低于 2×105Pa(绝压) ③灭菌过程中要保持压力稳定，要严防泡沫升至罐顶或逃液。为节约蒸汽用 量，排气量不宜过大，但排气要去保持畅通。 ④实罐灭菌或空罐灭菌时必须避免“死角”，即蒸汽到达不了或达不到灭菌 温度的地方，以免灭菌比彻底而使系统染菌。采用实罐时，配制培养基是要防止 原料结块，在配料罐出口处应装有筛板过滤器(筛孔直径 ≤ 0.5mm)，以防止培养 集中的块状物及异物进入罐内。配料罐要注意清洗和灭菌。 ⑤灭菌结束后，要引入无菌空气保持罐压，这样可避免罐压迅速下降，以致 产生负压并抽吸外界空气。 子引入无菌空气前， 罐内压力必须低于分过滤器压力， 否则培养基(或物料)将倒流入过滤器内。每天培养基灭菌体积为 3×400m3 计算， 又要考虑到七天的周期中最后一天只用两个罐， 所以每天平均体积为
m3，培养及密度为 1050kg/m3，所用蒸汽温度为 120 ℃，水蒸气在 120℃的液化 焓为 2250kJ/kg，由此Q 每 天 = 3Q 罐 ×M 蒸汽20 20 = 3 × 1.63191 × 10 8 × = 4.6626 × 10 8 kJ / d 21 21 Q 4.6626 × 10 8 = 每天 = = 21455.78 kg / d = 214.578 t / d ⑷ 冷却面积计算 通过发酵罐冷却面积的经验值，抗菌素的冷却面积与发 酵液体积为 1~1.5，取 1.5，已知填充系数为φ=80%，则每个 500 m3 的发酵罐换 热面积为[4] ：A = V全φψ = 500 × 0.8 × 1.5 = 600m 2- 36 -湖南科技大学本科生毕业设计第五章 设备选型及尺寸计算5.1 选型原则⑴ 物料计算是设备选型的依据，选择设备时要注意四点： ⑵ 根据每一品种单位时间(h 或 min)产量的物料平衡情况和设备生产能力来 确定所需设备的台数。 ⑶ 几个生产中的关键设备，除按实际生产能力所需台数的设备外，还应考 虑备用设 ⑷ 后道工序的生产能力要略大于前道，不至于生产能力不够，导致物料积 压。 选择设备应考虑下列原则： ①满足工艺要求，保证产品的质量和产量。 ②应选用较先进，机械化程度较高的设备。 ③充分利用原料，能耗少，效率高，体积小，能一机多用。 ④ 应符合卫生要求，故而多应用不锈钢材料。 ⑤ 有合理的自动控制系统，控制温度、压力和真空度，时间、速度、流量 等工艺参数。5.2 关键设备选择根据上面的物料衡算得出生产 1000kg 青霉素的发酵液的量为： 1 =29.25m3， V 那么生产 10000 吨青霉素所需体积为 29.25×104 m3 设发酵罐的填充系数φ=80%；则每天需要发酵罐的总容积为 V0(发酵周期为 190h，每年生产天数为 300 天)。 V0=V1/φ=29.25×104 /(0.8×300)= 5.