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【求助】做CCK-8时几个小疑问，请高手帮忙解答一下，谢谢！
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这个帖子发布于8年零301天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我刚开始做实验，都不是很熟练，遇到几个问题，请大家帮忙看一下，先谢过了：1.每次加药就10ul，感觉就一点点，手抖得厉害，一不小心就挂在壁上了。请问有什么方法可以帮我一下吗？2.因为操作不熟练，所以加药的时间特别长，不知道对最后的测量值有没有影响。3.说明书上写OD值在1-2之间比较可靠，请问这在实际中是不是对各种细胞都是适用的。非常感谢！
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1，拿水和废板子练一下手，10微升还是很多的，我们还要1ul加药呢。挂到壁上可以轻轻拍拍，晃一下，不过不要晃出来了。加的时候不要加入气泡。2，影响应该有，但是不至于太大，加完放到37度开始脱氢酶的反映才会很快。一般一个板子5分钟以内加完就好了。最好不要长过10分钟。3，各种细胞都适用，实际每种细胞最好摸一下种板密度（/96板孔）。读数大小和cc-8反映时间成正比，有的细胞加入进去1小时就值很高了，有的需要4个小时甚至更长时间。具体视实际情况。一般在1.2-1.5比较好。在0.9-2之间都还可以吧。因为空白培养基都可能0.2-0.3之间。非高手，用cck-8也不久，初级者回答初级者的问题也许更详细，希望对你有用。这个cck-8我也刚刚用了几个月，很快你就熟了。
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1，一般是450nm测，650nm参考，以450-650作为真实值。原因就是diving战友说的去除其他物质的影响。2， 我做的主要是贴壁细胞，同实验室的有做悬浮细胞，也有panc-1，貌似是5000/孔。3，刚开始加96孔板的时候，细胞比较容易贴到孔周围，后来发现这种现象减轻了，可能是操作更熟练的缘故，自己也可以再摸索一下方式。孔周围总是比中间多，这是正常。3，加药后可以用抢轻轻混匀，刚开始我也不敢吹，怕把贴壁细胞吹起来。后来发现没事。不过，最终我还是采取横竖方向各轻轻拍板50-100次，用枪头又浪费又慢。完全不吹不晃的话，加入的1-2微升DMSO容易沉到底下，造成一小片细胞死亡。4，关于怕浪费不起cck-8的问题，我们新手可以这样克服：如果显微镜下看见你的细胞长的过满，或者肉眼无见明显梯度死亡（本来有用的药，比如对照药反而无效或者杀死过多等）或者预感结果不太好（不符合预期），可以用mtt或者mts（这个是490测值，楼上那位不妨考虑下，就是要避光，数值不如cck-8稳定）等代替测，实在不行，拍照数数活细胞也可以考虑。如果肉眼观察都不满意，何苦浪费试剂（可惜我是浪费了很多之后才知道这句话，知道了这句话时候我也无需浪费了，哈哈）。5，做之前，最好摸一下细胞密度（一般细胞5000就ok，我有些细胞长4天才满，所以用了10000，后来都改成5000了），值偏大时可以减少种板细胞数，也可以减少cck-8作用时间，如我们的细胞中有的要加cck-84个小时做，有的一个小时值就老高了。刚开始如果不知道什么时候测合适，就一个小时测一次，快点测完后拿回去。一般熟练后肉眼看颜色就知道值大概有多少了。各种细胞不同，不可一概而论。祝各位尽早获得好结果~
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dreamer水吉 编辑于
1，拿水和废板子练一下手，10微升还是很多的，我们还要1ul加药呢。挂到壁上可以轻轻拍拍，晃一下，不过不要晃出来了。加的时候不要加入气泡。2，影响应该有，但是不至于太大，加完放到37度开始脱氢酶的反映才会很快。一般一个板子5分钟以内加完就好了。最好不要长过10分钟。3，各种细胞都适用，实际每种细胞最好摸一下种板密度（/96板孔）。读数大小和cc-8反映时间成正比，有的细胞加入进去1小时就值很高了，有的需要4个小时甚至更长时间。具体视实际情况。一般在1.2-1.5比较好。在0.9-2之间都还可以吧。因为空白培养基都可能0.2-0.3之间。非高手，用cck-8也不久，初级者回答初级者的问题也许更详细，希望对你有用。这个cck-8我也刚刚用了几个月，很快你就熟了。
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非常感谢！说实话，我前面做的这个试验挺惨烈的。加CCK加到一半枪还坏了！郁闷死人！我们开始做的是5000，结果出来的IC50根本不行，于是做，加上我的笨鸟技术，孔里基本上就没剩下几个细胞了。。。。。。多谢回答，我再勤加练习吧！谢谢！：）
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dreamer水吉
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请问dreamer水吉一下，您的细胞是贴壁细胞还是悬浮细胞啊，悬浮细胞一般多长时间测比较合适啊？我第一次做这个，谢谢你
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我也是 第一次做，遇到了和楼主一样的问题我的OD值普遍在1.5-2.5之间，有时还 到3.0多，密度摸了几次好像都差不多，我现在种的是5000/well,是悬浮细胞，但结果很糟糕~还有就是CCK-8真的好贵哦，一枪下去2元钱呢 ~~~~~~郁闷请各位大侠指导
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请问做CCK8是一定要用490nm的波长吗？我么实验室是590的，而且我不知道怎么调啊？谢谢哦
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CCK-8要用450的波长啊，说明书上写得很清楚啊，同时参比波长要设到600或以上。seaky_2001910，你不要告诉大家你做CCK-8都是用490测的。。。。。。To perfectstory，说明书上还讲OD值在1-2之间是最好的，超过2可能大了些，也许是你培养的时间太长了吧。我种的是PANC-1，摸了好几次觉得4000的最好，不过结果还没给老板看，等他看了再说吧。是挺贵的，我第一次没有细胞还加了结果被老板训了一顿，郁闷了一晚上。
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谢谢bakebake的提醒，我前几天做了一下，结果不太好，有几个问题想问一下：1、说明书上：I do not have a 450 nm filter. What other filterscan I use? You can use filters with the absorbance between 450and 490 nm, even though 450 nm filter gives the bestsensitivity.我们实验室没有450NM，我只能用490的，郁闷哪。2、一定要有参比波长吗？为什么呀？3，我加完药之后一段时间，发现孔内中心的细胞都死好多，但是边上的细胞还是特别多，是不是加药加的均匀啊？怎么样才能加均匀呢？4、我的是悬浮细胞，密度是10的5次方每孔，好像有点大了一样，不知道你的是什么细胞啊？谢谢，祝大家试验都顺利！
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参比波长是为了去除其它颜色物质的影响，感觉做cck或者elisa这种不用参比波长可能结果不会差异太大。悬浮没做过 呵呵 我做贴壁细胞
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1，一般是450nm测，650nm参考，以450-650作为真实值。原因就是diving战友说的去除其他物质的影响。2， 我做的主要是贴壁细胞，同实验室的有做悬浮细胞，也有panc-1，貌似是5000/孔。3，刚开始加96孔板的时候，细胞比较容易贴到孔周围，后来发现这种现象减轻了，可能是操作更熟练的缘故，自己也可以再摸索一下方式。孔周围总是比中间多，这是正常。3，加药后可以用抢轻轻混匀，刚开始我也不敢吹，怕把贴壁细胞吹起来。后来发现没事。不过，最终我还是采取横竖方向各轻轻拍板50-100次，用枪头又浪费又慢。完全不吹不晃的话，加入的1-2微升DMSO容易沉到底下，造成一小片细胞死亡。4，关于怕浪费不起cck-8的问题，我们新手可以这样克服：如果显微镜下看见你的细胞长的过满，或者肉眼无见明显梯度死亡（本来有用的药，比如对照药反而无效或者杀死过多等）或者预感结果不太好（不符合预期），可以用mtt或者mts（这个是490测值，楼上那位不妨考虑下，就是要避光，数值不如cck-8稳定）等代替测，实在不行，拍照数数活细胞也可以考虑。如果肉眼观察都不满意，何苦浪费试剂（可惜我是浪费了很多之后才知道这句话，知道了这句话时候我也无需浪费了，哈哈）。5，做之前，最好摸一下细胞密度（一般细胞5000就ok，我有些细胞长4天才满，所以用了10000，后来都改成5000了），值偏大时可以减少种板细胞数，也可以减少cck-8作用时间，如我们的细胞中有的要加cck-84个小时做，有的一个小时值就老高了。刚开始如果不知道什么时候测合适，就一个小时测一次，快点测完后拿回去。一般熟练后肉眼看颜色就知道值大概有多少了。各种细胞不同，不可一概而论。祝各位尽早获得好结果~
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dreamer水吉 编辑于
我做的是PANC－1，是贴壁细胞，比你那个看来容易不少啊！Lucky me! 所以不知道你那个细胞会不会太多了一些，要不你还是自己摸摸条件吧！前几天老板亲自上阵督战，我在高压气氛下又做了一次，结果比上次那个好了N倍！感觉把细胞种匀还是最重要的，我想充分地重悬是关键吧，也不知道你的细胞为什么都碎了。。。。。。Good Luck!
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bakebake 编辑于
dreamer水吉，你能不能帮我问一下你们实验室的，他们做PANC1出来的IC50大概在什么范围啊？我作出来跟文献差了八千里，老板说方法不一样，所以结果也不一样。我没找到关于CCK8做PANC-1 IC50的文献，想请你帮忙问一下，谢谢！
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不同药抑制能力不同吧，同学做出来紫杉醇的IC50都在10的-8次方，到10的-7之间，别的细胞上也许-9到-10呢。至于待测药IC50，那要看具体情况了，一般比紫杉醇大一些，也许能大100倍1000倍都不一定。前些天我做试验的时候，紫杉醇的IC50总是过大100倍，后来发现是计算错误。如果你和文献相差太大的话，不妨全面检查你的加药和计算。
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你不会把cck-8先按比例稀释在培养基里吗！然后弃去原96孔板里的所有需要加cck-8培养基,然后再用排枪把含有cck-8的鲜新培养基加入到96孔板里。然后观察，每隔10分钟测一次数据，获取所有数据里面最好的。注意：稀释cck-8时关闭超净工作台的灯，速度要快，cck-8最好不要见光，否则会失效。
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turbot 编辑于
测得值都在0.5左右啊，是不是太小啦？什么原因呢？
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seaky_2001910 谢谢bakebake的提醒，我前几天做了一下，结果不太好，有几个问题想问一下：3，我加完药之后一段时间，发现孔内中心的细胞都死好多，但是边上的细胞还是特别多，是不是加药加的均匀啊？怎么样才能加均匀呢？我也出现过这种情况，估计是加药的时候直接滴到孔中央，把细胞给拍死了。下次Medium稀释后贴壁加入就好啦。 seaky_2001910 wrote:测得值都在0.5左右啊，是不是太小啦？什么原因呢？解决方法有二：增加细胞数量延长CCK-8作用时间
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我也用cck做细胞毒实验，实验用的细胞是HeLa细胞。测了两次IC50值，第一次为15uM,第二次为20uM。请问各位战友，你们觉得这两次的误差大吗？应该用哪个更合理呢？
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我做的是悬浮细胞 ，请问你们选择的96孔培养板是平地的还是圆底的啊，我是悬浮细胞，用圆底做CCK-8有影响吗？
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我也是刚开始做CCK-8，悬浮细胞HL-60，出现了很多问题，其中很明显的一个就是细胞向周围集中严重，我用的是平地96孔培养板，是不是U型板会好一点呢？另外，加药后基本没有细胞梯度死亡，甚至细胞长的更好了，郁闷呀，不是是不是我加的细胞数多的缘故，20000/孔，但出来的OD值都在1.0到1.5之间，需要减少细胞数量吗？
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我做的怎么是药物浓度越大，OD值越大啊？！帮忙分析一下吧谢谢
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我的也是这样啊，不知道为什么啊
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关于药物浓度大，OD值越高的问题，有2个可能性：1、药物在检测波长处有吸收。请先确认一下药物是否有颜色，在检测波长处是否有吸收，可以在空白培养基中加药物，然后测定OD值，如果比空白高，就说明药物有吸收。2、药物和CCK-8有反应。可以在空白培养基中加药物，加CCK-8，然后测定OD值，如果比空白高（加CCK-8），就说明药物有吸收。解决办法可以联系试剂公司
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关于丁香园閬囧埌涓